班氏丝虫宿主循环抗原的检测
作者：杨维平 沈一平 章子豪 张翟娟 张翟 王增贤
单位：225001扬州大学医学院寄生虫学教研室(杨维平、张翟)；南京医学院(沈一平、章了豪、张翟娟)；安徽医科大学(王增贤)
关键词：丝虫病；抗原；尿液；乳，人
中华医学杂志940309
摘要 应用兔抗牛丝虫抗体ELISA双抗体夹心法和Dot-ELISA法检测安徽流行区人体班氏丝虫循环抗原。微丝蚴血症者血清总阳性率96%(24/25)，尿液总阳性率为60%(15/25)，4份乳汁阳性率均为100%。15份尿液阳性和4份乳汁阳性者与血清阳性结果的符合率分别为100%(15/25)和75%(3/4)。检测江苏非流行区正常人血清、尿液、乳汁共43份，全部阴性。11份肠道线虫感染者尿液全为阴性，血清Dot-ELISA阴性。10份肺吸虫感染者血清Dot-ELISA阴性。结果表明，班氏丝虫循环抗原不仅存在于血清而且存在于尿液和乳汁中。
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近年来已报道，在感染宿主的尿液、乳汁、粪便、阴道分泌肠、羊水、脑脊液、胸水等排满泄分泌物中检获10多种寄生虫抗原[1～3]。为进一步研究班氏丝虫感染宿主尿液、乳汁中是否存在寄生虫抗原及其与血清中循环抗原(CAg)的关系，寻找特异而有效的探针和简便快速的诊断方法，本研究试用兔抗牛丝虫特异性抗体ELISA和Dot-ELISA方法对班氏丝虫感染者的血、尿、乳样本进行了对比检测。
对象和方法
1、对象：25例厚血膜检查班氏微丝蚴阳性者选自安徽省凤阳县武店乡；10例正常哺乳期妇女和11例Kato-Katz厚涂片和(或)饱和盐水浮聚烘检虫卵阳性的肠道线虫感染哺乳期妇女选自江苏省江都县吴堡乡非丝虫流行区；10例肺吸虫血清CAg阳性血清为南京医学院章子豪副教授赠送。其余非流行区正常对照血清、尿液样本均采自南京医学院学生。
2、样本采集与处理：(1)血清：用直径3mm消毒塑料毛细管采集手指末稍血，分离血清，-20℃备用。(2)尿液：用清毒塑料离心管收集尿液20ml，3000r/min离心15分钟，取上清-20℃备用。(3)乳清：婴儿清晨第一次吸乳后，采集哺乳期妇女乳汁10ml，-20℃备用。检测前一次解冻，4℃下12000r/min离心15分钟后收集乳清。
, 百拇医药
3、抗原、抗体制备：(1)牛丝虫抗原制备：自水牛腹腔采集唇乳突腹腔丝虫(Setaria labiato-papillosa)，将剪碎虫体以适量PBS在冰浴中匀浆，150mA下超声粉碎20分钟，-70℃至室温反复冻融5次，4℃下10000r/min离心20分钟，上清即牛丝虫成虫可溶性抗原。蛋白含量为2.3mg/ml。(2)牛丝虫抗体制备与标记：选择健康成年家兔淋巴结内注射牛丝虫抗原，初次免疫1个月后心脏穿刺采血。血清CIE抗体效价为1：160。经饱和硫酸铵粗提后，再以DEAE纤维素层析提取纯兔抗牛丝虫抗体(IgG)。蛋白含量3.3mg/ml。采用辣根过氧化物酶过磺酸钠法标记抗牛-丝虫抗体。HRP/IgG克分子比值为1.87:1。酶结合物用灭菌纯甘油作1：2稀释，4℃备用。
4、ELISA双抗体夹心法：用pH9.5 0.5mol/L碳酸盐缓冲液稀释抗牛丝虫抗体(10.2μg/ml)包被40孔平底聚氯乙烯反应板，4℃过夜。以pH7.4 0.01mol/L PBS-0.005% Tween-20(PBS/T)洗涤，每孔用200μl1% BSA-PBS，37℃封闭1小时。再次洗板后，加入1：20稀释的受试血清或1：10稀释的尿、乳样本，37℃孵育1小时，PBS/T洗板后，加入经抗原滴定最适工作浓度为1：300的抗牛丝虫抗体酶结合物100μl，37℃孵育1小时，洗涤，加邻苯二胺(OPD)100μl，以2mol/L H2SO4终止反应。在酶联免疫检测仪(DG3022型)490nm下测定吸光度(A)值。血清、乳汁取正常对照组
±2s，尿样取正常对照组
的A值为阳性。参考阳性标本为牛丝虫抗原。每次检测均设阳性、阴性对照。
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5、Dot-ELISA法：参照Matsumura等[4]方法略加改进。将1μl样本点于印压有Φ0.3cm小圈的混合纤维素膜(NC为上海新亚净化器件厂产)上，37℃1小时烘干。用1%BSA-PBS室温封闭1小时，PBS/T洗涤，加入1：200稀释的抗牛丝虫抗体酶结合物，室温下振摇2小时，洗涤，用4-氯-1-萘酚室温显色15分钟，再用3，3'二氨基联苯胺显色15分钟，蒸馏水终止反应。参考阳性标本为牛丝虫抗原。每次试验均设阳性、阴性对照。
附表 两种方法对班氏丝虫CAg的检测结果 样本来源
ELISA
Dot-ELISA
符合率(%)
例数
阳性例数
, 百拇医药
阳性率(%)
例数
阳性例数
阳性率(%)
血 清
班氏微丝蚴血症者
25
24
96
25
21
84
84
, 百拇医药
肠道线虫感染者*
11
4
36
11
0
0
63
肺吸虫CAg阳性者
10
2
20
10
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0
0
80
肺吸虫感染犬
1
0
0
1
0
0
100
流行区对照
5
1
, http://www.100md.com
20
5
1
20
100
非流行区对照
24
0
0
24
0
0
100
尿 液
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班氏微丝蚴血症者
25
10
40
25
10
40
54
肠道线虫感染者
8
0
0
8
, http://www.100md.com 0
0
100
肺吸虫感染犬
1
0
0
1
0
0
100
流行区对照
5
1
, http://www.100md.com
20
5
1
20
100
非流行区对照
9
0
0
9
0
0
100
乳 汁
, 百拇医药
班氏微丝蚴血症者
4
4
100
4
4
100
100
非流行区对照
10
0
0
10
, 百拇医药 0
0
100
* 钩虫感染4例，蛔虫感染2例，钩蛔和蛔鞭混合感染各1例，钩蛔鞭混合感染3例
结 果
血清、尿液及乳汁的班氏丝虫CAg检测结果见附表。由附表可见，微丝蚴血症者血清总阳性率为96%(24/25)，尿液总阳性率60%(15/25)，4份乳汁阳性率均为100%。尿液阳性结果和乳汁阳性结果及血清阳性结果的符合率分别为100%和75%。
讨 论
近年来国内外学者高分子为测定血、尿、乳中寄生虫抗原或免疫复合物有可能用于诊断活动性感染和药物疗效考核。在感染班氏丝虫血清和尿液中已用抗犬恶丝虫和马来丝虫抗体以及抗班氏微丝蚴代谢抗原或抗马来丝虫3期幼虫抗原McAb证实了丝虫CAg的存在[5]，本研究首次用抗牛唇乳突腹腔丝虫抗体证实丝虫CAg不仅存在于班氏微丝蚴血症者的血清，而且存在于尿液和乳汁中。乳汁中含有抗原物质可能诱导婴儿免疫耐受和免疫抑制。
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研究结果表明ELISA的敏感性较Dot-ELISA高，检测班氏策丝蚴血症者备用清和乳汁中丝虫CAg的检出率分别达96%和100%，但与肠道线虫及肺吸虫存在较高的交叉反应(36%和20%)，这可能与多克隆抗体特异性较弱、虫种间交叉抗原较复杂以及感染血清中存在自身抗体等因素有关。尿液中丝虫CAg阳性检出率虽不同(60%)，但与其它寄生虫未出现交叉反应。尿液CAg阳性和乳汁CAg阳性者与血清阳性结果的符合率分别达100%和75%。流行区对照丝虫抗原阳性率较高(20%)，不能排除隐性感染的存在。尿液、池汁的采样较简便，受检者无痛苦。若进一步提高酶标抗体检测的每感性和特异性，进一步改良检测方法并达到标准化，检测尿液和乳汁中丝虫CAg对于丝虫病的免疫学研究将具有更大的实用价值。
本研究得到王得玉、沈际佳、江宝玲、史志明、印湖莲及许聚岭等同志的协助，特此志谢。
参考文献
1 Petralanda I, Yarzabal L, Piessens WF, Parasite antigens are present in breast milk of women infected with omchocerca volvulus, Am J Trop Med Hyg, 1988,38:372.
, 百拇医药
2 Lutsch C, Cesbron JY, Henry D, et al Lymphatic filariasis: detection of circulating and urinary antigen and differences in antibody isotypes complexed with circulating antigen between symptomatic and asymptomatic subjects. Clin Exp Immunol, 1988,71:253.
3 杨维平，感染宿主体液中寄生虫抗原检测的研究进展，扬州医学院学报，1993，1：74。
4 Matsumura K, Wakatsuki S, Endo R, et al. A rapid detection of circulating antigens of dirofilaria immits in dogs by a dot enzyme-linked immunosorbent assay, FEMS Microbiol Immunol, 1988,1:145.
5 郑惠君，陶增厚，Reddy MVR等，应用单克隆抗体酶联免疫吸附试验双抗体法检测人体丝虫病循环抗原，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1987，5：1。, 百拇医药
单位：225001扬州大学医学院寄生虫学教研室(杨维平、张翟)；南京医学院(沈一平、章了豪、张翟娟)；安徽医科大学(王增贤)
关键词：丝虫病；抗原；尿液；乳，人
中华医学杂志940309
摘要 应用兔抗牛丝虫抗体ELISA双抗体夹心法和Dot-ELISA法检测安徽流行区人体班氏丝虫循环抗原。微丝蚴血症者血清总阳性率96%(24/25)，尿液总阳性率为60%(15/25)，4份乳汁阳性率均为100%。15份尿液阳性和4份乳汁阳性者与血清阳性结果的符合率分别为100%(15/25)和75%(3/4)。检测江苏非流行区正常人血清、尿液、乳汁共43份，全部阴性。11份肠道线虫感染者尿液全为阴性，血清Dot-ELISA阴性。10份肺吸虫感染者血清Dot-ELISA阴性。结果表明，班氏丝虫循环抗原不仅存在于血清而且存在于尿液和乳汁中。
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近年来已报道，在感染宿主的尿液、乳汁、粪便、阴道分泌肠、羊水、脑脊液、胸水等排满泄分泌物中检获10多种寄生虫抗原[1～3]。为进一步研究班氏丝虫感染宿主尿液、乳汁中是否存在寄生虫抗原及其与血清中循环抗原(CAg)的关系，寻找特异而有效的探针和简便快速的诊断方法，本研究试用兔抗牛丝虫特异性抗体ELISA和Dot-ELISA方法对班氏丝虫感染者的血、尿、乳样本进行了对比检测。
对象和方法
1、对象：25例厚血膜检查班氏微丝蚴阳性者选自安徽省凤阳县武店乡；10例正常哺乳期妇女和11例Kato-Katz厚涂片和(或)饱和盐水浮聚烘检虫卵阳性的肠道线虫感染哺乳期妇女选自江苏省江都县吴堡乡非丝虫流行区；10例肺吸虫血清CAg阳性血清为南京医学院章子豪副教授赠送。其余非流行区正常对照血清、尿液样本均采自南京医学院学生。
2、样本采集与处理：(1)血清：用直径3mm消毒塑料毛细管采集手指末稍血，分离血清，-20℃备用。(2)尿液：用清毒塑料离心管收集尿液20ml，3000r/min离心15分钟，取上清-20℃备用。(3)乳清：婴儿清晨第一次吸乳后，采集哺乳期妇女乳汁10ml，-20℃备用。检测前一次解冻，4℃下12000r/min离心15分钟后收集乳清。
, 百拇医药
3、抗原、抗体制备：(1)牛丝虫抗原制备：自水牛腹腔采集唇乳突腹腔丝虫(Setaria labiato-papillosa)，将剪碎虫体以适量PBS在冰浴中匀浆，150mA下超声粉碎20分钟，-70℃至室温反复冻融5次，4℃下10000r/min离心20分钟，上清即牛丝虫成虫可溶性抗原。蛋白含量为2.3mg/ml。(2)牛丝虫抗体制备与标记：选择健康成年家兔淋巴结内注射牛丝虫抗原，初次免疫1个月后心脏穿刺采血。血清CIE抗体效价为1：160。经饱和硫酸铵粗提后，再以DEAE纤维素层析提取纯兔抗牛丝虫抗体(IgG)。蛋白含量3.3mg/ml。采用辣根过氧化物酶过磺酸钠法标记抗牛-丝虫抗体。HRP/IgG克分子比值为1.87:1。酶结合物用灭菌纯甘油作1：2稀释，4℃备用。
4、ELISA双抗体夹心法：用pH9.5 0.5mol/L碳酸盐缓冲液稀释抗牛丝虫抗体(10.2μg/ml)包被40孔平底聚氯乙烯反应板，4℃过夜。以pH7.4 0.01mol/L PBS-0.005% Tween-20(PBS/T)洗涤，每孔用200μl1% BSA-PBS，37℃封闭1小时。再次洗板后，加入1：20稀释的受试血清或1：10稀释的尿、乳样本，37℃孵育1小时，PBS/T洗板后，加入经抗原滴定最适工作浓度为1：300的抗牛丝虫抗体酶结合物100μl，37℃孵育1小时，洗涤，加邻苯二胺(OPD)100μl，以2mol/L H2SO4终止反应。在酶联免疫检测仪(DG3022型)490nm下测定吸光度(A)值。血清、乳汁取正常对照组
±2s，尿样取正常对照组的A值为阳性。参考阳性标本为牛丝虫抗原。每次检测均设阳性、阴性对照。, http://www.100md.com
5、Dot-ELISA法：参照Matsumura等[4]方法略加改进。将1μl样本点于印压有Φ0.3cm小圈的混合纤维素膜(NC为上海新亚净化器件厂产)上，37℃1小时烘干。用1%BSA-PBS室温封闭1小时，PBS/T洗涤，加入1：200稀释的抗牛丝虫抗体酶结合物，室温下振摇2小时，洗涤，用4-氯-1-萘酚室温显色15分钟，再用3，3'二氨基联苯胺显色15分钟，蒸馏水终止反应。参考阳性标本为牛丝虫抗原。每次试验均设阳性、阴性对照。
附表 两种方法对班氏丝虫CAg的检测结果 样本来源
ELISA
Dot-ELISA
符合率(%)
例数
阳性例数
, 百拇医药
阳性率(%)
例数
阳性例数
阳性率(%)
血 清
班氏微丝蚴血症者
25
24
96
25
21
84
84
, 百拇医药
肠道线虫感染者*
11
4
36
11
0
0
63
肺吸虫CAg阳性者
10
2
20
10
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0
0
80
肺吸虫感染犬
1
0
0
1
0
0
100
流行区对照
5
1
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20
5
1
20
100
非流行区对照
24
0
0
24
0
0
100
尿 液
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班氏微丝蚴血症者
25
10
40
25
10
40
54
肠道线虫感染者
8
0
0
8
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0
100
肺吸虫感染犬
1
0
0
1
0
0
100
流行区对照
5
1
, http://www.100md.com
20
5
1
20
100
非流行区对照
9
0
0
9
0
0
100
乳 汁
, 百拇医药
班氏微丝蚴血症者
4
4
100
4
4
100
100
非流行区对照
10
0
0
10
, 百拇医药 0
0
100
* 钩虫感染4例，蛔虫感染2例，钩蛔和蛔鞭混合感染各1例，钩蛔鞭混合感染3例
结 果
血清、尿液及乳汁的班氏丝虫CAg检测结果见附表。由附表可见，微丝蚴血症者血清总阳性率为96%(24/25)，尿液总阳性率60%(15/25)，4份乳汁阳性率均为100%。尿液阳性结果和乳汁阳性结果及血清阳性结果的符合率分别为100%和75%。
讨 论
近年来国内外学者高分子为测定血、尿、乳中寄生虫抗原或免疫复合物有可能用于诊断活动性感染和药物疗效考核。在感染班氏丝虫血清和尿液中已用抗犬恶丝虫和马来丝虫抗体以及抗班氏微丝蚴代谢抗原或抗马来丝虫3期幼虫抗原McAb证实了丝虫CAg的存在[5]，本研究首次用抗牛唇乳突腹腔丝虫抗体证实丝虫CAg不仅存在于班氏微丝蚴血症者的血清，而且存在于尿液和乳汁中。乳汁中含有抗原物质可能诱导婴儿免疫耐受和免疫抑制。
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研究结果表明ELISA的敏感性较Dot-ELISA高，检测班氏策丝蚴血症者备用清和乳汁中丝虫CAg的检出率分别达96%和100%，但与肠道线虫及肺吸虫存在较高的交叉反应(36%和20%)，这可能与多克隆抗体特异性较弱、虫种间交叉抗原较复杂以及感染血清中存在自身抗体等因素有关。尿液中丝虫CAg阳性检出率虽不同(60%)，但与其它寄生虫未出现交叉反应。尿液CAg阳性和乳汁CAg阳性者与血清阳性结果的符合率分别达100%和75%。流行区对照丝虫抗原阳性率较高(20%)，不能排除隐性感染的存在。尿液、池汁的采样较简便，受检者无痛苦。若进一步提高酶标抗体检测的每感性和特异性，进一步改良检测方法并达到标准化，检测尿液和乳汁中丝虫CAg对于丝虫病的免疫学研究将具有更大的实用价值。
本研究得到王得玉、沈际佳、江宝玲、史志明、印湖莲及许聚岭等同志的协助，特此志谢。
参考文献
1 Petralanda I, Yarzabal L, Piessens WF, Parasite antigens are present in breast milk of women infected with omchocerca volvulus, Am J Trop Med Hyg, 1988,38:372.
, 百拇医药
2 Lutsch C, Cesbron JY, Henry D, et al Lymphatic filariasis: detection of circulating and urinary antigen and differences in antibody isotypes complexed with circulating antigen between symptomatic and asymptomatic subjects. Clin Exp Immunol, 1988,71:253.
3 杨维平，感染宿主体液中寄生虫抗原检测的研究进展，扬州医学院学报，1993，1：74。
4 Matsumura K, Wakatsuki S, Endo R, et al. A rapid detection of circulating antigens of dirofilaria immits in dogs by a dot enzyme-linked immunosorbent assay, FEMS Microbiol Immunol, 1988,1:145.
5 郑惠君，陶增厚，Reddy MVR等，应用单克隆抗体酶联免疫吸附试验双抗体法检测人体丝虫病循环抗原，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1987，5：1。, 百拇医药