复方中药对小鼠B－16黑素瘤细胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用
作者：程东庆 尉晓冬 王遂泉 许爱娥
单位：310009杭州市第三人民医院皮肤科
关键词：医学；中国传统；酪氨酸酶；黑色素瘤；实验性；白癜风
中华皮肤科杂志000311
【摘要】目的研究复方中药对小鼠B-16黑素瘤细胞株细胞增殖、黑素合成的影响，及其对细胞内酪氨酸酶的激活作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定中药对细胞增殖的影响；酶学方法研究中药对酪氨酸酶活性的作用；470nm比色标准曲线法测定黑素含量。结果研究发现复方3号(补肝肾为主)促进黑素细胞增殖和色素合成的能力高于复方1号(光敏感性药物)或复方2号(活血化瘀)，而酶激活能力复方1号较为稳定。结论在白癜风治疗中补肝肾类中药不可忽视。同时也说明影响黑素合成的因素是多方面的，可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关。
, 百拇医药
Effect of Traditional Chinese Medicine on the Tyrosinase Activity and Melanogenesis in B- 16 Murine Melanoma
CHENG Dongqing
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
WEI Xiaodong
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
WANG Suiquan
, 百拇医药
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
【 Abstract】 Objective To study the effect of traditional Chinese medicine on tyrosinase activity and the melanogenesis of B- 16 murine melanoma cell. Methods MTT was used to study the proliferation of B- 16 murine melanoma cell. The tyrosinase activity was measured by enzyme- kinetic- method. The melanin was detected by its absorption at 470nm against the standard concentration curve. Results The complex prescription 3(for invigorating liver and kidney) had a strong potential to promote the proliferation and melanogenesis of B- 16 cell than complex prescription 1 (light sensitive drugs) or complex prescription 2 (for improvement of blood circulation), whereas complex prescription 1 was more stable in promoting tyrosinase activity among these remedies. Conclusion The remedies for invigorating of liver and kidney can not be neglected in vitiligo treatment.
, 百拇医药
【 Key words】 Medicine,Chinese traditional Tyrosine Melanoma, experimental Vitiligo
迄今为止，白癜风的发病机理尚未阐明。一般认为在黑素的生物合成过程中，酪氨酸酶起着关键性的催化作用。酪氨酸酶是一种独特的具有多重催化功能的酶[1]，与白癜风的治疗可能相关。通常将氧化多巴的能力作为酪氨酸酶的催化能力。我们在既往筛选基础上[2]着重探讨中药复方1号(光敏感性药物)、复方2号(活血化瘀类药)、复方3号(补肝肾类药)对小鼠B-16黑素瘤细胞株胞内酪氨酸酶的作用及其对细胞增殖、黑素生物合成的影响。
材料与方法
一、材料
1.中药：复方中药1号：主要成分为补骨脂和白芷，生药浓度为1g/mL，具有光敏感性作用；复方中药2号：含当归、生地、红花、桃仁、赤芍、川芎、丹参、生晒参等生药各1g/mL，基本作用为活血化瘀；复方中药3号：为补肝肾类药，含沙苑子、车前子、五味子、枸杞子、菟丝子、覆盆子各1g/mL生药。上述中药以生药浓度1g/mL用培养基倍比稀释得不同浓度，用于实验。
, 百拇医药
2.试剂：DL-多巴、合成黑素(均为美国Sigma公司产品)；胰蛋白酶(上海华美生物公司产品)。
3.小鼠B16黑素瘤细胞株：中国科学院上海细胞研究所提供。
4.酶标仪：LabsystemsDragonWellscanMK3。
二、方法
1.中药提取：提取方法参见文献[2]。
2.细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物(1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL)，并设置培养液对照。
置37℃，体积分数为5%CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。
, 百拇医药
3.酪氨酸酶活力测定[4,5]：96孔培养板加入B16单细胞悬液(7～8)×103/孔，待贴壁后加入含中药1.25mg/mL的培养基培养24、48、72h后弃培养基，用pH7.4的PBS洗涤2次，每孔加1%TritonX-100溶液50μL，迅速置-80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入1%L-多巴溶液10μL，37℃反应2h，测定490nm吸光度值，以不加中药的细胞孔作为对照。每一浓度设立3个复孔，取平均值。
4.细胞内黑素含量测定[6]：选择对数生长期细胞制成单细胞悬液，以每孔2×105细胞/2mL接种于6孔培养板，每孔分别加中药10、50、100μL，以不加中药作为对照。将细胞在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养4d，倾去培养液，用生理盐水洗2次，0.25%胰酶消化，收集细胞，然后超声处理细胞，离心，沉淀用10%三氯乙酸和乙醇洗涤，1200×g离心5min，倾上清液，最后加入1NNaOH(含10%DMSO)在80℃水浴保温2h后于470nm测A值，用合成黑素重复最后步骤制作标准曲线。
, 百拇医药
结果
一、中药对黑素细胞增殖的影响
用MTT法测定中药作用后小鼠B16细胞的增殖，发现与对照组相比复方中药对体外培养黑素细胞增殖均具有促进作用，最佳浓度复方3号为2.8mg/mL、复方2号为2.5mg/mL、复方1号为1.8mg/mL，促增殖率分别为复方3号27.8%、复方2号24.6%、复方1号16.7%,结果表明对黑素细胞的促增殖作用复方3号强于复方2号、复方1号。
二、中药对细胞内酪氨酸酶活性的影响
测定小鼠B16细胞[(7～8)×103/孔]在中药作用不同时间后其胞内酪氨酸酶的活性，结果表明，中药复方1号在作用48h后酪氨酸酶有显著升高，但作用72h后有下降趋势；复方2号和3号在作用24h后酶活性有所上升，但48h、72h后不稳定(见表1)。因此中药作用48h酶活性最强。
, 百拇医药
表1 中药对黑素细胞胞内酪氨酸酶的激活作用
复方中药
作用24 h
作用48 h
作用72 h
A值
对照A值
酶激活率
A值
对照A值
酶激活率
A值
对照A值
, 百拇医药
酶激活率
复方1号
0.18
0.12
50.0
0.25
0.14
78.6
0.12
0.10
20.0
复方2号
0.14
, 百拇医药
0.12
16.7
0.26
0.14
85.7
0.10
0.10
0
复方3号
0.17
0.12
41.6
0.20
, http://www.100md.com
0.14
42.8
0.09
0.10
/
三、中药对细胞合成黑素的影响
中药作用后细胞合成色素有显著增加，黑素的相对含量(实验组黑素量/对照组黑素量)分别为复方1号142%、复方2号139%和复方3号185%，表明促进黑素合成的能力复方3号强于复方1号、复方2号。
讨论
我们选取白癜风治疗中使用概率高的50种中药，研究其对细胞外酪氨酸酶的作用，筛选出女贞子、白芷、无花果、旱莲草、补骨脂、潼蒺藜、地肤子、桃仁等8味中药，能促进细胞外酪氨酸酶活性，其中女贞子、白芷作用最强。用不同浓度中药作用于黑素细胞，结果发现小鼠B16细胞在复方中药作用24h、48h后酶活性增加，72h后明显比48h降低。此结果提示，胞内酪氨酸酶在黑素合成过程中其活性不是一成不变的，可能与黑素小体的形成、发展及代谢有关，酪氨酸酶活性与黑素含量的关系及其影响因素有待于深入研究。在研究中发现复方1号的酶激活能力大于复方2号、3号，而促黑素细胞增殖及黑素含量测定结果则显示复方3号促进黑素细胞增殖和色素合成的能力高于复方1号或复方2号。表明在白癜风治疗中补肝肾类中药不可忽视。
, 百拇医药
中华医学会杨森基金资助
参 考 文 献
1，Iwata M, Corn T, Iwata S, et al. The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins. J Invest Dermatol, 1990,95:9- 15.
2，许爱娥,王遂泉，尉晓冬，等.常用中药对酪氨酸酶的激活作用.中华皮肤科杂志,1998,31：48.
3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983,65:55- 63.
, http://www.100md.com
4，Nakajima M, Shinoda I, Fukuwatari Y, et al. Arbutin increases the pigmentation of culture human melanocytes through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity. Pigment Cell Res, 1998,11:12- 17.
5，Zhang L, Yoshida T, Kuroiwa Y. Stimulation of melanin synthesis of B16- F10 mouse melanoma cells by bufalin. Life Sci, 1992,51:17- 24.
6，Oikawa A, Nakayasu M. Quantitative measurement of melanin as tyrosine equivalents and as weight of purified melanin. Yale J Biol Med, 1973, 46:500- 507.
(收 稿 日 期 ： 1999- 05- 04), 百拇医药
单位：310009杭州市第三人民医院皮肤科
关键词：医学；中国传统；酪氨酸酶；黑色素瘤；实验性；白癜风
中华皮肤科杂志000311
【摘要】目的研究复方中药对小鼠B-16黑素瘤细胞株细胞增殖、黑素合成的影响，及其对细胞内酪氨酸酶的激活作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定中药对细胞增殖的影响；酶学方法研究中药对酪氨酸酶活性的作用；470nm比色标准曲线法测定黑素含量。结果研究发现复方3号(补肝肾为主)促进黑素细胞增殖和色素合成的能力高于复方1号(光敏感性药物)或复方2号(活血化瘀)，而酶激活能力复方1号较为稳定。结论在白癜风治疗中补肝肾类中药不可忽视。同时也说明影响黑素合成的因素是多方面的，可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关。
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Effect of Traditional Chinese Medicine on the Tyrosinase Activity and Melanogenesis in B- 16 Murine Melanoma
CHENG Dongqing
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
WEI Xiaodong
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
WANG Suiquan
, 百拇医药
(Department of Dermatology. The Third People′ s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009)
【 Abstract】 Objective To study the effect of traditional Chinese medicine on tyrosinase activity and the melanogenesis of B- 16 murine melanoma cell. Methods MTT was used to study the proliferation of B- 16 murine melanoma cell. The tyrosinase activity was measured by enzyme- kinetic- method. The melanin was detected by its absorption at 470nm against the standard concentration curve. Results The complex prescription 3(for invigorating liver and kidney) had a strong potential to promote the proliferation and melanogenesis of B- 16 cell than complex prescription 1 (light sensitive drugs) or complex prescription 2 (for improvement of blood circulation), whereas complex prescription 1 was more stable in promoting tyrosinase activity among these remedies. Conclusion The remedies for invigorating of liver and kidney can not be neglected in vitiligo treatment.
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【 Key words】 Medicine,Chinese traditional Tyrosine Melanoma, experimental Vitiligo
迄今为止，白癜风的发病机理尚未阐明。一般认为在黑素的生物合成过程中，酪氨酸酶起着关键性的催化作用。酪氨酸酶是一种独特的具有多重催化功能的酶[1]，与白癜风的治疗可能相关。通常将氧化多巴的能力作为酪氨酸酶的催化能力。我们在既往筛选基础上[2]着重探讨中药复方1号(光敏感性药物)、复方2号(活血化瘀类药)、复方3号(补肝肾类药)对小鼠B-16黑素瘤细胞株胞内酪氨酸酶的作用及其对细胞增殖、黑素生物合成的影响。
材料与方法
一、材料
1.中药：复方中药1号：主要成分为补骨脂和白芷，生药浓度为1g/mL，具有光敏感性作用；复方中药2号：含当归、生地、红花、桃仁、赤芍、川芎、丹参、生晒参等生药各1g/mL，基本作用为活血化瘀；复方中药3号：为补肝肾类药，含沙苑子、车前子、五味子、枸杞子、菟丝子、覆盆子各1g/mL生药。上述中药以生药浓度1g/mL用培养基倍比稀释得不同浓度，用于实验。
, 百拇医药
2.试剂：DL-多巴、合成黑素(均为美国Sigma公司产品)；胰蛋白酶(上海华美生物公司产品)。
3.小鼠B16黑素瘤细胞株：中国科学院上海细胞研究所提供。
4.酶标仪：LabsystemsDragonWellscanMK3。
二、方法
1.中药提取：提取方法参见文献[2]。
2.细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物(1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL)，并设置培养液对照。
置37℃，体积分数为5%CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。
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3.酪氨酸酶活力测定[4,5]：96孔培养板加入B16单细胞悬液(7～8)×103/孔，待贴壁后加入含中药1.25mg/mL的培养基培养24、48、72h后弃培养基，用pH7.4的PBS洗涤2次，每孔加1%TritonX-100溶液50μL，迅速置-80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入1%L-多巴溶液10μL，37℃反应2h，测定490nm吸光度值，以不加中药的细胞孔作为对照。每一浓度设立3个复孔，取平均值。
4.细胞内黑素含量测定[6]：选择对数生长期细胞制成单细胞悬液，以每孔2×105细胞/2mL接种于6孔培养板，每孔分别加中药10、50、100μL，以不加中药作为对照。将细胞在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养4d，倾去培养液，用生理盐水洗2次，0.25%胰酶消化，收集细胞，然后超声处理细胞，离心，沉淀用10%三氯乙酸和乙醇洗涤，1200×g离心5min，倾上清液，最后加入1NNaOH(含10%DMSO)在80℃水浴保温2h后于470nm测A值，用合成黑素重复最后步骤制作标准曲线。
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结果
一、中药对黑素细胞增殖的影响
用MTT法测定中药作用后小鼠B16细胞的增殖，发现与对照组相比复方中药对体外培养黑素细胞增殖均具有促进作用，最佳浓度复方3号为2.8mg/mL、复方2号为2.5mg/mL、复方1号为1.8mg/mL，促增殖率分别为复方3号27.8%、复方2号24.6%、复方1号16.7%,结果表明对黑素细胞的促增殖作用复方3号强于复方2号、复方1号。
二、中药对细胞内酪氨酸酶活性的影响
测定小鼠B16细胞[(7～8)×103/孔]在中药作用不同时间后其胞内酪氨酸酶的活性，结果表明，中药复方1号在作用48h后酪氨酸酶有显著升高，但作用72h后有下降趋势；复方2号和3号在作用24h后酶活性有所上升，但48h、72h后不稳定(见表1)。因此中药作用48h酶活性最强。
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表1 中药对黑素细胞胞内酪氨酸酶的激活作用
复方中药
作用24 h
作用48 h
作用72 h
A值
对照A值
酶激活率
A值
对照A值
酶激活率
A值
对照A值
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酶激活率
复方1号
0.18
0.12
50.0
0.25
0.14
78.6
0.12
0.10
20.0
复方2号
0.14
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0.12
16.7
0.26
0.14
85.7
0.10
0.10
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复方3号
0.17
0.12
41.6
0.20
, http://www.100md.com
0.14
42.8
0.09
0.10
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三、中药对细胞合成黑素的影响
中药作用后细胞合成色素有显著增加，黑素的相对含量(实验组黑素量/对照组黑素量)分别为复方1号142%、复方2号139%和复方3号185%，表明促进黑素合成的能力复方3号强于复方1号、复方2号。
讨论
我们选取白癜风治疗中使用概率高的50种中药，研究其对细胞外酪氨酸酶的作用，筛选出女贞子、白芷、无花果、旱莲草、补骨脂、潼蒺藜、地肤子、桃仁等8味中药，能促进细胞外酪氨酸酶活性，其中女贞子、白芷作用最强。用不同浓度中药作用于黑素细胞，结果发现小鼠B16细胞在复方中药作用24h、48h后酶活性增加，72h后明显比48h降低。此结果提示，胞内酪氨酸酶在黑素合成过程中其活性不是一成不变的，可能与黑素小体的形成、发展及代谢有关，酪氨酸酶活性与黑素含量的关系及其影响因素有待于深入研究。在研究中发现复方1号的酶激活能力大于复方2号、3号，而促黑素细胞增殖及黑素含量测定结果则显示复方3号促进黑素细胞增殖和色素合成的能力高于复方1号或复方2号。表明在白癜风治疗中补肝肾类中药不可忽视。
, 百拇医药
中华医学会杨森基金资助
参 考 文 献
1，Iwata M, Corn T, Iwata S, et al. The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins. J Invest Dermatol, 1990,95:9- 15.
2，许爱娥,王遂泉，尉晓冬，等.常用中药对酪氨酸酶的激活作用.中华皮肤科杂志,1998,31：48.
3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983,65:55- 63.
, http://www.100md.com
4，Nakajima M, Shinoda I, Fukuwatari Y, et al. Arbutin increases the pigmentation of culture human melanocytes through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity. Pigment Cell Res, 1998,11:12- 17.
5，Zhang L, Yoshida T, Kuroiwa Y. Stimulation of melanin synthesis of B16- F10 mouse melanoma cells by bufalin. Life Sci, 1992,51:17- 24.
6，Oikawa A, Nakayasu M. Quantitative measurement of melanin as tyrosine equivalents and as weight of purified melanin. Yale J Biol Med, 1973, 46:500- 507.
(收 稿 日 期 ： 1999- 05- 04), 百拇医药