恶性黑素瘤患者外周血酪氨酸酶与临床分期的相关性研究
作者：江文 周礼义 陈映玲
单位：同济医科大学附属同济医院皮肤科，武汉 430030
关键词：恶性黑素瘤；酪氨酸酶类；聚合酶链反应
同济医科大学学报990313 摘要 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR )检测恶性黑素瘤患者外周血中酪氨酸酶mRNA，并与健康供血者和其它皮肤恶性肿瘤患者对照。结果：68例恶性黑素瘤患者，临床Ⅰ期和Ⅱ期酪氨酸酶mRNA的RT-PCR阳性率分别为6.5%和13.3%，Ⅲ期为42.9%，Ⅳ期(即有远距离转移者)为87.5% ( P<0.001)。说明外周血中酪氨酸酶 mRNA阳性率与临床分期有明显的关系,而与性别、肿瘤发病部位和病理学分类无关( P>0.05 )。在健康供血者和其他皮肤恶性肿瘤患者血液中酪氨酸酶mRNA的RT-PCR均为阴性。提示酪氨酸酶mRNA具有特异性。
Study on the Relationship between Tyrosinase in Peripheral Blood and
, http://www.100md.com
Clinical Stage in Patients with Malignant Melanoma
Jiang Wen, Zhou Liyi, Chen Yingling
Department of Dermatology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract By using reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) tyrosinase mRNA in peripheral blood was determined in the patients with malignant melanoma and compared with that in healthy subjects and patients with other malignant tumor in skin. Blood samples of 68 patients with malignant melanoma in different stages of disease were collected. RT-PCR positive rate for tyrosinase mRNA in blood were 6.5%， 13.3%, 42.9% and 87.5% in the patients with stages I to Ⅳ, respectively. There was a statistically significant correlation between positive RT-PCR products for tyrosinase mRNA in peripheral blood and clinical stage(P<0.001). In control, RT-PCR products for tyrosinase mRNA were negative in all of healthy subjects or patients with other malignant tumor in skin. These results demonstrate that tyrosinase mRNA is specific.
, 百拇医药
Key words malignant melanoma； tyrosinase； reverse-transcriptase polymerase chain reaction
近几十年来，恶性黑素瘤的发病率及死亡率在世界范围内明显升高。尽管恶性黑素瘤只占皮肤恶性肿瘤的5%，但其死亡数占所有恶性皮肤肿瘤中的75%。因此，早期发现恶性黑素瘤的发生和转移对于指导治疗有着重要意义。以往，肿瘤方面的研究集中在肿瘤相关抗原或肿瘤细胞释放的不同分子，但这些方法仅能发现肿瘤，不能指明转移的潜在性或肿瘤的发展。因此，希望有一种肿瘤标志物，能在患者血液中尽早被检测出，以尽可能早期对恶性黑素瘤的复发和转移作出诊断。利用聚合酶链反应(PCR)方法检测恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶，可以达到此目的。近来研究发现，血中酪氨酸酶与恶性黑素瘤有一定的关系[1]。但国内尚无此方面的报道。我们利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测恶性黑素瘤患者血液酪氨酸酶，探讨外周血酪氨酸酶与恶性黑素瘤发生及预后的关系，为临床早期诊断和及时治疗以及预后判断提供依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标准细胞株
SK-Mel 28细胞株为酪氨酸酶阳性的恶性黑素瘤细胞[2](德国海德堡大学提供)。
1.2 临床资料
根据患者的临床表现及病理切片结果选择恶性黑素瘤患者68例。病例来源于同济医院皮肤科和德国乌尔姆大学皮肤科。并按照UICC[3]进行临床分期，其中男26例，女42例。平均年龄 50.8岁。选择10名健康供血者、5例基底细胞癌、6例鳞状细胞癌作为阴性对照。SK-Mel 28细胞作为阳性对照。
1.3 方法
1.3.1方法敏感性测定:将SK-Mel 28细胞105/ml进行连续等倍稀释,并将浓度为105/ml、104/ml、103/ml、102/ml、10/ml、1/ml的SK-Mel 28细胞分别置于健康供血者10 ml EDTA血液中。
, 百拇医药
1.3.2 RNA的制备：将每位患者及阴性对照者的静脉血10 ml置于EDTA试管中，并用Chomczynisk[4]的方法提取RNA。Sk-Mel 28细胞的RNA提取方法与此相同。
1.3.3 cDNA的合成：取3 μg RNA，用Superscript试剂盒( Gibco BRL )将RNA进行逆转录为cDNA。
1.3.4 引物设计与合成：参照Smith等[5]的设计，引物由德国MMG.Boitech合成。序列为：
HTTR1：5'-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3'
HTYR2：5'-AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3'
HTYR3：5'-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3'
, 百拇医药
HTYR4：5'-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3'
外引物 HTYR1和 HTYR2在第1次 PCR反应中扩增284 bp产物，内引物 HTYR3和 HTYR4在第2次 PCR反应中扩增出207 bp产物。
1.3.5 套式 PCR：①第1次 PCR反应：第1次扩增时分别取2 μg cDNA标本和标准株，在0.5 ml 离心管中进行 PCR扩增。并设空白对照。在50 μl PCR反应体积中还含有10倍 PCR缓冲液5.0 μl，4种dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μl，外引物HTYR1和HTYR2各0.5μl。 经95 ℃下 5 min预变性后，加入Taq DNA聚合酶0.2 μl (5 U/μl)(Giobro BRL)，于94℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，经30个循环后，再于72℃延伸 5 min。②第2次 PCR反应：将第1次 PCR产物用双蒸无菌水稀释100倍，取 5 μl稀释的第1次PCR产物进行 PCR扩增。50 μl PCR反应体积中还含有10倍 PCR缓冲液5.0 μl，4种dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μl，外引物HTYR3和HTYR4各0.5 μl。反应温度、时间和循环次数同第1次 PCR反应。③取每个样本的扩增液10 μl，在含有0.5 mg/L溴化乙锭的25 g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.3.6 标本mRNA完整的检测：磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH)为组织非特异性酶，我们使用GAPDH-PCR对每个标本的mRNA的完整性进行检测，参考Ercolani[6]的设计，使用的引物为：
GA1：5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'
GA2：5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'
两种引物在PCR反应中扩增出320 bp产物。
1.4 统计学处理方法
实验结果采用χ2检验。
2 结果
2.1 方法敏感性
, 百拇医药
将105/ml SK-Mel 28细胞连续等倍稀释，并分别加入10 ml健康供血者的血液中，提取mRNA，再进行RT-PCR，在第1次 PCR反应扩增产物中可检测出104～105个SK-Mel 28细胞(附图a)，而第2次 PCR反应扩增产物中可检测出1个以上的SK-Mel 28细胞(附图b)。
附图 方法敏感性测定。图a：第1次 PCR反应的扩增产物，图b：第2次 PCR反应的扩增产物。A～E 为10 ml健康供血者的血液中，分别加入1～105/ml连续等倍稀释的SK-Mel 28细胞。S为健康供血者的血液(未加SK-Mel 28细胞)，N为阴性对照(无菌双蒸水)，P为阳性对照(106/ml SK-Mel 28细胞)。100 bp列为100 bp ladder
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附图 方法敏感性测定。图a：第1次 PCR反应的扩增产物，图b：第2次 PCR反应的扩增产物。A～E 为10 ml健康供血者的血液中，分别加入1～105/ml连续等倍稀释的SK-Mel 28细胞。S为健康供血者的血液(未加SK-Mel 28细胞)，N为阴性对照(无菌双蒸水)，P为阳性对照(106/ml SK-Mel 28细胞)。100 bp列为100 bp ladder
2.2 阴性对照
10例健康供血者和11例其它恶性皮肤肿瘤患者外周血中酪氨酸酶RT-PCR均为阴性。
2.3 外周血中酪氨酸酶与肿瘤患者性别的关系
男性患者血中酪氨酸酶RT-PCR阳性率(34.6%)高于女性患者(19.0%), 但两组间差异无显著意义 ( P>0.05)。
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2.4 外周血中酪氨酸酶与肿瘤发生部位的关系
肿瘤发生在头皮、颈部、躯干部的患者的RT-PCR阳性率为33.3% (6/18)，略高于肿瘤发生在面部、四肢的患者，其阳性率为22.0%(11/50)，两组间差异无显著意义( P>0.05)。
2.5 外周血中酪氨酸酶与肿瘤病理学分类的关系
肢端雀斑样黑素瘤(ALM)及结节性恶黑(NM)的RT-PCR阳性率分别为50.0%(2/4)、32.1%(9/28)，高于浅表扩散性恶黑(SSM)及恶性雀斑样黑素瘤(LMM)〔分别为17.2%(5/29)、14.2%(1/7)〕，但各组间RT-PCR阳性率无显著性差异(P>0.05)。
2.6 外周血中酪氨酸酶与临床分期的关系
从附表可见，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各组间血中酪氨酸酶RT-PCR阳性率有极显著性差异 (P<0.001)。
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附表 外周血中酪氨酸酶PCR阳性数与
临床分期(UICC)的关系 临床分期
例数
RT-PCR
阳性数
阳性率(%)
Ⅰ
31
2
6.5
Ⅱ
15
2
, 百拇医药
13.3
Ⅲ
14
6
42.9
Ⅳ
8
7
87.5
各组间比较 P<0.0013 讨论
酪氨酸酶是一种组织特异性酶，是黑色素合成的关键酶，仅特异性表达于黑素细胞和黑素瘤细胞。黑素细胞通常不进入血液循环，如果在外周血液中发现酪氨酸酶mRNA，即说明血液中存在黑素瘤细胞。
, 百拇医药
我们利用RT-PCR方法对恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶进行检测，观察了68例恶性黑素瘤患者，其中Ⅰ期患者血中酪氨酸酶PCR阳性率为6.5%，Ⅱ期为13.3%，而Ⅲ期PCR阳性率为42.9%，Ⅳ期即有肿瘤内脏转移的患者PCR阳性率高达87.5%。而健康供血者及其它皮肤肿瘤的外周血中检测不出酪氨酸酶。Brossart等[1]在其它转移性非皮肤性恶性肿瘤的血液中也未检测出酪氨酸酶。说明RT-PCR方法检测mRNA酪氨酸酶不但具有明显的特异性，且与恶性黑素瘤细胞的临床分期有着密切关系。在有肿瘤转移的患者中循环的黑素瘤细胞的检出率极高，而黑素瘤局限的患者中循环的黑素瘤细胞的检出率极低，此结果与Fertmann[8]和Kunst[9]的研究基本一致。
我们在Ⅰ期和Ⅱ期中均检测到2例手术后患者酪氨酸酶PCR为阳性，可能与手术时释放至血液有关[7]。
从本检测结果可看出，患者外周血中酪氨酸酶与其它影响患者预后的因素如性别、肿瘤部位、肿瘤的病理学分类等因素无关。说明外周血中酪氨酸酶是另外一种独立的预后因素。因此，利用PCR对恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶进行检测的方法，有望用于早期发现黑素瘤患者肿瘤的复发、转移及转移性黑素瘤，并及时进行系统治疗及评估患者预后。
, 百拇医药
(本研究中部分恶性黑素瘤患者的标本系德国乌尔姆大学皮肤科提供，特此致谢)
作者简介:江文，女，1966年生，主治医师
参考文献
1 Brossart P, Keilholz U, Willhauck M et al. Hematogenous Spread of malignant melanoma cells in different stages of disease. J Invest Dermatol, 1993, 101:887
2 Carey T E, Takahashi T, Resnick L A et al. Cell surface antigens of human malignant melanoma: mixed hemadsorption assays for humoral immunity to cultured autologous melanoma cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1976, 73:3278
, http://www.100md.com
3 Hermanek P, Scheibe U, Spassl D et al. UICC TMM-Klassifikation maligner tumoren. Berlin： Springer Verlag,1987.15
4 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method for RNA isolation by acid guanidinium thyocianate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156
5 Smith B, Selby P, Southgate J et al. Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction. Lancet, 1991, 338:1227
, 百拇医药
6 Ercolani L, Florence B, Denaro M et al. Isolation and complete sequence of a functional human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene. J Biol Chem, 1988, 30:15 335
7 Murthy S M, Goldschmitdt R A, Rao U et al. The influence of surgical trauma on experimental metastase. Cancer, 1989, 64:2035
8 Farthmann B, Eberle J, Krasagakis K et al. RT-PCR for tyrosinase-mRNA-positive cells in peripheral blood: evaluation strategy and correlation with known prognostic markers in 123 melanoma patients. J Invest Dermatol, 1998, 110:263
9 Kunst U,Buer J,Prost M et al. Peripheral blood tyrosinase messenger RNA detection and survival in malignant melanoma. J Natl Cancer Inst, 1996, 88:590
(1998-06-29 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院皮肤科，武汉 430030
关键词：恶性黑素瘤；酪氨酸酶类；聚合酶链反应
同济医科大学学报990313 摘要 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR )检测恶性黑素瘤患者外周血中酪氨酸酶mRNA，并与健康供血者和其它皮肤恶性肿瘤患者对照。结果：68例恶性黑素瘤患者，临床Ⅰ期和Ⅱ期酪氨酸酶mRNA的RT-PCR阳性率分别为6.5%和13.3%，Ⅲ期为42.9%，Ⅳ期(即有远距离转移者)为87.5% ( P<0.001)。说明外周血中酪氨酸酶 mRNA阳性率与临床分期有明显的关系,而与性别、肿瘤发病部位和病理学分类无关( P>0.05 )。在健康供血者和其他皮肤恶性肿瘤患者血液中酪氨酸酶mRNA的RT-PCR均为阴性。提示酪氨酸酶mRNA具有特异性。
Study on the Relationship between Tyrosinase in Peripheral Blood and
, http://www.100md.com
Clinical Stage in Patients with Malignant Melanoma
Jiang Wen, Zhou Liyi, Chen Yingling
Department of Dermatology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract By using reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) tyrosinase mRNA in peripheral blood was determined in the patients with malignant melanoma and compared with that in healthy subjects and patients with other malignant tumor in skin. Blood samples of 68 patients with malignant melanoma in different stages of disease were collected. RT-PCR positive rate for tyrosinase mRNA in blood were 6.5%， 13.3%, 42.9% and 87.5% in the patients with stages I to Ⅳ, respectively. There was a statistically significant correlation between positive RT-PCR products for tyrosinase mRNA in peripheral blood and clinical stage(P<0.001). In control, RT-PCR products for tyrosinase mRNA were negative in all of healthy subjects or patients with other malignant tumor in skin. These results demonstrate that tyrosinase mRNA is specific.
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Key words malignant melanoma； tyrosinase； reverse-transcriptase polymerase chain reaction
近几十年来，恶性黑素瘤的发病率及死亡率在世界范围内明显升高。尽管恶性黑素瘤只占皮肤恶性肿瘤的5%，但其死亡数占所有恶性皮肤肿瘤中的75%。因此，早期发现恶性黑素瘤的发生和转移对于指导治疗有着重要意义。以往，肿瘤方面的研究集中在肿瘤相关抗原或肿瘤细胞释放的不同分子，但这些方法仅能发现肿瘤，不能指明转移的潜在性或肿瘤的发展。因此，希望有一种肿瘤标志物，能在患者血液中尽早被检测出，以尽可能早期对恶性黑素瘤的复发和转移作出诊断。利用聚合酶链反应(PCR)方法检测恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶，可以达到此目的。近来研究发现，血中酪氨酸酶与恶性黑素瘤有一定的关系[1]。但国内尚无此方面的报道。我们利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测恶性黑素瘤患者血液酪氨酸酶，探讨外周血酪氨酸酶与恶性黑素瘤发生及预后的关系，为临床早期诊断和及时治疗以及预后判断提供依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标准细胞株
SK-Mel 28细胞株为酪氨酸酶阳性的恶性黑素瘤细胞[2](德国海德堡大学提供)。
1.2 临床资料
根据患者的临床表现及病理切片结果选择恶性黑素瘤患者68例。病例来源于同济医院皮肤科和德国乌尔姆大学皮肤科。并按照UICC[3]进行临床分期，其中男26例，女42例。平均年龄 50.8岁。选择10名健康供血者、5例基底细胞癌、6例鳞状细胞癌作为阴性对照。SK-Mel 28细胞作为阳性对照。
1.3 方法
1.3.1方法敏感性测定:将SK-Mel 28细胞105/ml进行连续等倍稀释,并将浓度为105/ml、104/ml、103/ml、102/ml、10/ml、1/ml的SK-Mel 28细胞分别置于健康供血者10 ml EDTA血液中。
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1.3.2 RNA的制备：将每位患者及阴性对照者的静脉血10 ml置于EDTA试管中，并用Chomczynisk[4]的方法提取RNA。Sk-Mel 28细胞的RNA提取方法与此相同。
1.3.3 cDNA的合成：取3 μg RNA，用Superscript试剂盒( Gibco BRL )将RNA进行逆转录为cDNA。
1.3.4 引物设计与合成：参照Smith等[5]的设计，引物由德国MMG.Boitech合成。序列为：
HTTR1：5'-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3'
HTYR2：5'-AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3'
HTYR3：5'-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3'
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HTYR4：5'-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3'
外引物 HTYR1和 HTYR2在第1次 PCR反应中扩增284 bp产物，内引物 HTYR3和 HTYR4在第2次 PCR反应中扩增出207 bp产物。
1.3.5 套式 PCR：①第1次 PCR反应：第1次扩增时分别取2 μg cDNA标本和标准株，在0.5 ml 离心管中进行 PCR扩增。并设空白对照。在50 μl PCR反应体积中还含有10倍 PCR缓冲液5.0 μl，4种dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μl，外引物HTYR1和HTYR2各0.5μl。 经95 ℃下 5 min预变性后，加入Taq DNA聚合酶0.2 μl (5 U/μl)(Giobro BRL)，于94℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，经30个循环后，再于72℃延伸 5 min。②第2次 PCR反应：将第1次 PCR产物用双蒸无菌水稀释100倍，取 5 μl稀释的第1次PCR产物进行 PCR扩增。50 μl PCR反应体积中还含有10倍 PCR缓冲液5.0 μl，4种dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μl，外引物HTYR3和HTYR4各0.5 μl。反应温度、时间和循环次数同第1次 PCR反应。③取每个样本的扩增液10 μl，在含有0.5 mg/L溴化乙锭的25 g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察结果。
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1.3.6 标本mRNA完整的检测：磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH)为组织非特异性酶，我们使用GAPDH-PCR对每个标本的mRNA的完整性进行检测，参考Ercolani[6]的设计，使用的引物为：
GA1：5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'
GA2：5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'
两种引物在PCR反应中扩增出320 bp产物。
1.4 统计学处理方法
实验结果采用χ2检验。
2 结果
2.1 方法敏感性
, 百拇医药
将105/ml SK-Mel 28细胞连续等倍稀释，并分别加入10 ml健康供血者的血液中，提取mRNA，再进行RT-PCR，在第1次 PCR反应扩增产物中可检测出104～105个SK-Mel 28细胞(附图a)，而第2次 PCR反应扩增产物中可检测出1个以上的SK-Mel 28细胞(附图b)。
附图 方法敏感性测定。图a：第1次 PCR反应的扩增产物，图b：第2次 PCR反应的扩增产物。A～E 为10 ml健康供血者的血液中，分别加入1～105/ml连续等倍稀释的SK-Mel 28细胞。S为健康供血者的血液(未加SK-Mel 28细胞)，N为阴性对照(无菌双蒸水)，P为阳性对照(106/ml SK-Mel 28细胞)。100 bp列为100 bp ladder
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附图 方法敏感性测定。图a：第1次 PCR反应的扩增产物，图b：第2次 PCR反应的扩增产物。A～E 为10 ml健康供血者的血液中，分别加入1～105/ml连续等倍稀释的SK-Mel 28细胞。S为健康供血者的血液(未加SK-Mel 28细胞)，N为阴性对照(无菌双蒸水)，P为阳性对照(106/ml SK-Mel 28细胞)。100 bp列为100 bp ladder
2.2 阴性对照
10例健康供血者和11例其它恶性皮肤肿瘤患者外周血中酪氨酸酶RT-PCR均为阴性。
2.3 外周血中酪氨酸酶与肿瘤患者性别的关系
男性患者血中酪氨酸酶RT-PCR阳性率(34.6%)高于女性患者(19.0%), 但两组间差异无显著意义 ( P>0.05)。
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2.4 外周血中酪氨酸酶与肿瘤发生部位的关系
肿瘤发生在头皮、颈部、躯干部的患者的RT-PCR阳性率为33.3% (6/18)，略高于肿瘤发生在面部、四肢的患者，其阳性率为22.0%(11/50)，两组间差异无显著意义( P>0.05)。
2.5 外周血中酪氨酸酶与肿瘤病理学分类的关系
肢端雀斑样黑素瘤(ALM)及结节性恶黑(NM)的RT-PCR阳性率分别为50.0%(2/4)、32.1%(9/28)，高于浅表扩散性恶黑(SSM)及恶性雀斑样黑素瘤(LMM)〔分别为17.2%(5/29)、14.2%(1/7)〕，但各组间RT-PCR阳性率无显著性差异(P>0.05)。
2.6 外周血中酪氨酸酶与临床分期的关系
从附表可见，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各组间血中酪氨酸酶RT-PCR阳性率有极显著性差异 (P<0.001)。
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附表 外周血中酪氨酸酶PCR阳性数与
临床分期(UICC)的关系 临床分期
例数
RT-PCR
阳性数
阳性率(%)
Ⅰ
31
2
6.5
Ⅱ
15
2
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13.3
Ⅲ
14
6
42.9
Ⅳ
8
7
87.5
各组间比较 P<0.0013 讨论
酪氨酸酶是一种组织特异性酶，是黑色素合成的关键酶，仅特异性表达于黑素细胞和黑素瘤细胞。黑素细胞通常不进入血液循环，如果在外周血液中发现酪氨酸酶mRNA，即说明血液中存在黑素瘤细胞。
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我们利用RT-PCR方法对恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶进行检测，观察了68例恶性黑素瘤患者，其中Ⅰ期患者血中酪氨酸酶PCR阳性率为6.5%，Ⅱ期为13.3%，而Ⅲ期PCR阳性率为42.9%，Ⅳ期即有肿瘤内脏转移的患者PCR阳性率高达87.5%。而健康供血者及其它皮肤肿瘤的外周血中检测不出酪氨酸酶。Brossart等[1]在其它转移性非皮肤性恶性肿瘤的血液中也未检测出酪氨酸酶。说明RT-PCR方法检测mRNA酪氨酸酶不但具有明显的特异性，且与恶性黑素瘤细胞的临床分期有着密切关系。在有肿瘤转移的患者中循环的黑素瘤细胞的检出率极高，而黑素瘤局限的患者中循环的黑素瘤细胞的检出率极低，此结果与Fertmann[8]和Kunst[9]的研究基本一致。
我们在Ⅰ期和Ⅱ期中均检测到2例手术后患者酪氨酸酶PCR为阳性，可能与手术时释放至血液有关[7]。
从本检测结果可看出，患者外周血中酪氨酸酶与其它影响患者预后的因素如性别、肿瘤部位、肿瘤的病理学分类等因素无关。说明外周血中酪氨酸酶是另外一种独立的预后因素。因此，利用PCR对恶性黑素瘤患者血液的酪氨酸酶进行检测的方法，有望用于早期发现黑素瘤患者肿瘤的复发、转移及转移性黑素瘤，并及时进行系统治疗及评估患者预后。
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(本研究中部分恶性黑素瘤患者的标本系德国乌尔姆大学皮肤科提供，特此致谢)
作者简介:江文，女，1966年生，主治医师
参考文献
1 Brossart P, Keilholz U, Willhauck M et al. Hematogenous Spread of malignant melanoma cells in different stages of disease. J Invest Dermatol, 1993, 101:887
2 Carey T E, Takahashi T, Resnick L A et al. Cell surface antigens of human malignant melanoma: mixed hemadsorption assays for humoral immunity to cultured autologous melanoma cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1976, 73:3278
, http://www.100md.com
3 Hermanek P, Scheibe U, Spassl D et al. UICC TMM-Klassifikation maligner tumoren. Berlin： Springer Verlag,1987.15
4 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method for RNA isolation by acid guanidinium thyocianate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156
5 Smith B, Selby P, Southgate J et al. Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction. Lancet, 1991, 338:1227
, 百拇医药
6 Ercolani L, Florence B, Denaro M et al. Isolation and complete sequence of a functional human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene. J Biol Chem, 1988, 30:15 335
7 Murthy S M, Goldschmitdt R A, Rao U et al. The influence of surgical trauma on experimental metastase. Cancer, 1989, 64:2035
8 Farthmann B, Eberle J, Krasagakis K et al. RT-PCR for tyrosinase-mRNA-positive cells in peripheral blood: evaluation strategy and correlation with known prognostic markers in 123 melanoma patients. J Invest Dermatol, 1998, 110:263
9 Kunst U,Buer J,Prost M et al. Peripheral blood tyrosinase messenger RNA detection and survival in malignant melanoma. J Natl Cancer Inst, 1996, 88:590
(1998-06-29 收稿), 百拇医药