高效液相色谱柱前衍生法测定牛磺酸含量
作者：颜京霞 宋秀君 卞小芸 勾凌燕 王仁杰 张亚超
单位：颜京霞 宋秀君 卞小芸 河北医科大学第三医院眼科(石家庄 050051)；勾凌燕 王仁杰 张亚超 中国人民解放军石家庄医学高等专科学校
关键词：牛磺酸；分析；白内障；病因学；色谱法，高压液相；方法；大鼠
河北医科大学学报990409 摘 要 目的 探讨高效液相色谱柱前衍生法测定血、房水、晶状体中牛磺酸含量的价值。方法 采用2种流动相,流动相A为0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)-甲醇-四氢呋喃(80∶20∶0.8),流动相B为0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.5)-甲醇(20∶80);色谱柱为necleos ODSΦ4.6 nm×150 nm。Wistar大鼠的血浆、房水、晶状体经处理和衍生后进样分析。结果 该方法最低检出限为10 μg/ml,氨基酸浓度与相对响应值之间平均相关系数为0.998±0.002,回收率为91.07 %～96.79 %,牛磺酸峰面积变异系数在进样量3μl时为10.75 %,进样量5 μl时为3.12 %。结论 高效液相色谱柱前衍生法可使血、房水、晶状体中的牛磺酸与其它氨基酸很好地分离,是测定牛磺酸含量的好方法。
, http://www.100md.com
中图号 R493.2;R776.1
DETERMINATION OF TAURINE CONTENT BY HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Yan Jingxia Song Xiujun Bian Xiaoyun
Department of Ophthalmology,the Third Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050051)
Gou Lingyan Wang Renjie Zhang Yachao
, 百拇医药
Shijiazhuang Medical College of PLA
ABSTRACT Objective To explore the method for determination of taurine in plasma,aqueous and lenses of rate by high performance liquid chromatography(HPLC).Methods Two mobile phase were used:0.05 mol/L sodium acetate buffer (pH=6.5)-methanolfourhydrofuran(80∶20∶0.8) and 0.05 mol/L sodium citrate butter (pH=6.5)-methanol(20∶80);the analytical column was Φ4.6 nm×150 mm necleos ODS.The Wistar rat's plasma,aqueous and lenses samples were determined after derivation.Results Using this method,the minimum detected limit was 10 μm/ml;the mean related coefficient between concentration of amino acids and reaction valus was 0.998±0.002;the rate of recovery were 97.07 %～96.79 %;the coefficient of variation of taurine's peak area was 10.75 % when the analysed sample was 3 μl and was 3.12 % when the analysed sample was 5 μl.Conclusion Using HPLC,taurine in blood plasma,aqueous and lenses can be separated well from amino acids.This method is a good way in the determination of taurine content.
, 百拇医药
MeSH taurine/anal;cataract/etiol;chromatography,high-performance liquid/methods;rats
近几年来,文献报道〔1,2〕牛磺酸在白内障的发生、发展中起着十分重要的作用,但对牛磺酸含量分析常采用氨基酸自动分析仪〔3〕。本文采用高效液相色谱柱前衍生技术对眼房水、晶状体和血液中的牛磺酸及谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸进行了分析测定,获得了比较满意的结果,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 仪器:高效液相色谱仪LC-4A(日本岛津),数据处理机C-R2AX(日本岛津),荧光检测器RF-530(日本岛津),色谱柱necleosODS Φ4.6 mm×150 mm。
1.2 试剂:氨基酸标准品由英国BDH公司提供,邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂为英国Fluka公司产品,其它化学试剂均为国产分析纯,所有实验用水均为2次重蒸水。
, 百拇医药
1.3 标准氨基酸、牛磺酸分离及色谱条件
1.3.1 标准溶液的配置:精确称取各种氨基酸30 mg,混匀后用50 %甲醇水溶于25 ml容量瓶中。用移液管分别量取1,2,3,4和5 ml混合溶液移入5个50 ml的容量瓶中,用50 %甲醇水定容。
1.3.2 衍生
1.3.2.1 衍生液的配制:准确称取50 mg OPA溶于1.5 ml甲醇中,加入50 μl巯基乙醇,11 ml 0.4mol/L硼酸缓冲液(pH=9.5),通入氮气,棕色瓶贮存。使用时,每日补充20 μl巯基乙醇,10 d换1次。
1.3.2.2 衍生操作:取10～25 μl样品,加衍生试剂100 μl,置旋涡振荡器振荡1 min,用乙酸缓冲液将体积补充到200 μl,操作在2 min内完成,取适当量进样。
, 百拇医药
1.3.2.3 分离测定:采用两种流动相对标准或样品进行梯度洗脱。流动相A:0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)-甲醇-四氢呋喃(80∶20∶0.8);流动相B:0.05mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.5)-甲醇(20∶80)。采用四段线性梯度洗脱,流速0.6 ml/min,衰减0。荧光检测器:EX 338 nm,EM 425 nm。
1.3.2.4 样品处理
血浆处理:Wistar大鼠断头取血,1 500～2 000 g 离心15 min。精确吸取血清100 μl于1 ml具塞试管中,加入100 μl甲醇及10 %硫酸锌10 μl,振荡混合10 s,3 000 g离心15 min,取上清液50 μl,常温水浴,氮气吹干。
房水处理:Wistar大鼠断头,残头固定,自角膜缘剪开角膜,采用毛细管吸取房水,精确吸取房水40 μl于1 ml具塞试管中。加入100 μl甲醇及10 %硫酸锌10 μl,振荡混合10 s,3 000 g离心15 min,取上清液50 μl,常温水浴,氮气吹干。
, 百拇医药
晶状体处理:Wistar大鼠断头,残头固定后自角膜缘剪开角膜,取晶状体,于滤纸上吸取晶体上残留的玻璃体,称量后立即放入匀浆管,加入Tris-Hcl缓冲液(pH=7.4)(总量为25 μl/mg晶状体),0～4 ℃匀浆2 min,8 700 g离心5 min,取上清液,待测定。
2 结果
2.1 计算:由System Glod对峰面积积分,再以标准氨基酸浓度对峰面积作校正曲线,计算样品浓度。
2.2 色谱行为:在上述的色谱条件下,标准品及血、房水、晶体中的牛磺酸与谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、丙氨酸得到了很好的分离,但精氨酸、甘氨酸、苏氨酸分离效果相比之下稍差。见混合标品的色谱图(图1),大鼠血、房水、晶状体中氨基酸分离色谱图(图2)。25 min内,所有氨基酸均全部洗脱,在牛磺酸出峰后,以A液将其余保留时间长的OPA氨基酸衍生物洗脱,使每个样品的分析时间不超过35 min。
, 百拇医药
图1 标准色谱图
Figure 1 Standard chromatograma
图2 样品分离色谱图
Figure 2 Separate chromatogram of the sample
2.3 线性关系和最低检出限:以不同浓度氨基酸标准品进行测量,测得其浓度与峰面积的回归方程:
谷氨酸 Y=100.06X-1 110.5,r=0.999
谷氨酰胺 Y=150.17X-1 623.9,r=0.998
丝氨酸 Y=128.58X-1 406.4,r=0.999
, 百拇医药
精氨酸+甘氨酸+苏氨酸
Y=359.58X-3 910.4,r=0.998
丙氨酸 Y=151.38X-2 008.8,r=0.993
牛磺酸 Y=158.11X-1 835.3,r=0.998
平均相关系数为0.998±0.002,此方法的最低检出限为10 μg/ml。
2.4 重复性:同一浓度不同进样量时氨基酸面积的变异系数见表1。
表1 同一浓度不同进样量氨基酸峰面积变异系数
Table 1 Coefficient of variation on peak area of amino
, 百拇医药
acids in same concentration and different quantity(%) Dose
(μl)
Glum
Glun
Ser
Arg+Gly+Thr
Ala
Tau
3
7.02
8.12
7.00
, http://www.100md.com
10.20
14.10
10.75
5
2.30
2.63
2.24
3.72
4.39
3.12
2.5 回收率:试验中测定各氨基酸回收率,得到的回收率波动范围在91.07%～96.79%之间,见表2。表2 不同氨基酸回收率平均值
, 百拇医药 Table 2 Mean value of the rate of recovery in
different amino acids (n=3)
Glum
Glun
Ser
Arg+Gly+Thr
Ala
Tau
ARR(%)
93.60
91.07
, http://www.100md.com
91.76
96.79
94.00
92.41
ARR:Average recovery rate Glum:Glutamane Glun:Glutanine Ser:Serine Arg:Arginine Gly:Glycine Thr:Threomine Ala:Alanine Tau:Taurine (Figure 1～2,Table 1～2)3 讨论
牛磺酸是机体内1种自由氨基酸,具有很强的渗透压调节作用和抗内源性氧化性损害的作用。在白内障发病早期,晶体内牛磺含量就明显地下降。因此,测量血、房水和晶体中牛磺酸含量对临床预防和治疗白内障有极其重要的意义。
国外对生物样品氨基酸含量的测定常采用氨基酸自动分析仪专项测定〔3〕。在国内也开始用此测定方法,但其分析要求条件高,分析所需时间长,仪器昂贵,不适用于基层单位,采用高效液相色谱仪进行测量更具实用性〔4〕。本文对生物样品中牛磺酸含量,特别是对眼局部房水和晶状体内牛磺酸含量采用高效液相色谱法进行分析,并采用OPA柱前衍生的方法进行测量,使牛磺酸与其它氨基酸得到很好的分离。
, 百拇医药
OPA柱前衍生法具有灵敏度高、分辨力强的优点,但衍生反应尚受反应温度、各试剂加入量及反应时间的影响,尤其是反应时间是需要严格掌握的关键因素〔5,6〕。在试验过程中,将衍生反应的时间控制在2 min以内,保证了衍生产物的稳定性;选用2-巯基乙醇作还原剂虽使衍生产物不够稳定,但其有较强的荧光吸收,有利于提高检验的灵敏度,因此更适合于微量氨基酸的分析。
测定结果〔7〕表明,半乳糖性白内障发生发展过程中,血、房水和晶状体中牛磺酸含量均比正常对照组降低,而通过腹腔注射、结膜下注射或点眼人为补充牛磺酸后,晶状体中牛磺酸含量升高,晶状体混浊程度比白内障对照组明显改善。
此方法的不足之处是氨基酸中精氨酸、甘氨酸和苏氨酸的分离不甚理想,但此方法主要目的在于使眼房水、晶状体和血液中的牛磺酸与其它氨基酸可以很好地分离,因此仍不失为测量牛磺酸含量的好方法。
河北省自然科学基金资助课题(No.396157)
, 百拇医药
参考文献
1.Kasuya M,Itoi M,Kobayashi S,et al.Changes of glutathione and taurine concentrations in lens of rat eyes induced by galactose-cataract formation or ageing.Exe Eye Res,1992,54:49
2.Malone JI,Benford SA,Malone JJR.Taurine prevents galactose-induced cataracts.Diab Comb,1993,7:44
3.Spackman DH,Stein WH,Moore S.Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids.Anal Chem,1958,30:1190
, http://www.100md.com
4.Auvin-Guette C,Rips R.Polyamines and corresponding amino acids measured together.Chromatographia,1988,26:60
5.Liu HJ.Determination of amino acids by precolumn derivation with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysucciniomidyl carbamate and higy-performance liquid chromatography with ultroviolet detection.J Chromatogr,1994,670:59
6.Lindroth P,Mopper K.High-performance liquid chromatography determination of derivatization with ophthaldialdedyde.Anal Chem,1979,51:1667
7.宋秀君,王仁杰,颜京霞,等.牛磺酸对半乳糖白内障大鼠房水和晶体游离氨基酸含量的影响.中国药理毒理学杂志,1998,3:225
(1998-02-23 收稿), 百拇医药
单位：颜京霞 宋秀君 卞小芸 河北医科大学第三医院眼科(石家庄 050051)；勾凌燕 王仁杰 张亚超 中国人民解放军石家庄医学高等专科学校
关键词：牛磺酸；分析；白内障；病因学；色谱法，高压液相；方法；大鼠
河北医科大学学报990409 摘 要 目的 探讨高效液相色谱柱前衍生法测定血、房水、晶状体中牛磺酸含量的价值。方法 采用2种流动相,流动相A为0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)-甲醇-四氢呋喃(80∶20∶0.8),流动相B为0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.5)-甲醇(20∶80);色谱柱为necleos ODSΦ4.6 nm×150 nm。Wistar大鼠的血浆、房水、晶状体经处理和衍生后进样分析。结果 该方法最低检出限为10 μg/ml,氨基酸浓度与相对响应值之间平均相关系数为0.998±0.002,回收率为91.07 %～96.79 %,牛磺酸峰面积变异系数在进样量3μl时为10.75 %,进样量5 μl时为3.12 %。结论 高效液相色谱柱前衍生法可使血、房水、晶状体中的牛磺酸与其它氨基酸很好地分离,是测定牛磺酸含量的好方法。
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中图号 R493.2;R776.1
DETERMINATION OF TAURINE CONTENT BY HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Yan Jingxia Song Xiujun Bian Xiaoyun
Department of Ophthalmology,the Third Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050051)
Gou Lingyan Wang Renjie Zhang Yachao
, 百拇医药
Shijiazhuang Medical College of PLA
ABSTRACT Objective To explore the method for determination of taurine in plasma,aqueous and lenses of rate by high performance liquid chromatography(HPLC).Methods Two mobile phase were used:0.05 mol/L sodium acetate buffer (pH=6.5)-methanolfourhydrofuran(80∶20∶0.8) and 0.05 mol/L sodium citrate butter (pH=6.5)-methanol(20∶80);the analytical column was Φ4.6 nm×150 mm necleos ODS.The Wistar rat's plasma,aqueous and lenses samples were determined after derivation.Results Using this method,the minimum detected limit was 10 μm/ml;the mean related coefficient between concentration of amino acids and reaction valus was 0.998±0.002;the rate of recovery were 97.07 %～96.79 %;the coefficient of variation of taurine's peak area was 10.75 % when the analysed sample was 3 μl and was 3.12 % when the analysed sample was 5 μl.Conclusion Using HPLC,taurine in blood plasma,aqueous and lenses can be separated well from amino acids.This method is a good way in the determination of taurine content.
, 百拇医药
MeSH taurine/anal;cataract/etiol;chromatography,high-performance liquid/methods;rats
近几年来,文献报道〔1,2〕牛磺酸在白内障的发生、发展中起着十分重要的作用,但对牛磺酸含量分析常采用氨基酸自动分析仪〔3〕。本文采用高效液相色谱柱前衍生技术对眼房水、晶状体和血液中的牛磺酸及谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸进行了分析测定,获得了比较满意的结果,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 仪器:高效液相色谱仪LC-4A(日本岛津),数据处理机C-R2AX(日本岛津),荧光检测器RF-530(日本岛津),色谱柱necleosODS Φ4.6 mm×150 mm。
1.2 试剂:氨基酸标准品由英国BDH公司提供,邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂为英国Fluka公司产品,其它化学试剂均为国产分析纯,所有实验用水均为2次重蒸水。
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1.3 标准氨基酸、牛磺酸分离及色谱条件
1.3.1 标准溶液的配置:精确称取各种氨基酸30 mg,混匀后用50 %甲醇水溶于25 ml容量瓶中。用移液管分别量取1,2,3,4和5 ml混合溶液移入5个50 ml的容量瓶中,用50 %甲醇水定容。
1.3.2 衍生
1.3.2.1 衍生液的配制:准确称取50 mg OPA溶于1.5 ml甲醇中,加入50 μl巯基乙醇,11 ml 0.4mol/L硼酸缓冲液(pH=9.5),通入氮气,棕色瓶贮存。使用时,每日补充20 μl巯基乙醇,10 d换1次。
1.3.2.2 衍生操作:取10～25 μl样品,加衍生试剂100 μl,置旋涡振荡器振荡1 min,用乙酸缓冲液将体积补充到200 μl,操作在2 min内完成,取适当量进样。
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1.3.2.3 分离测定:采用两种流动相对标准或样品进行梯度洗脱。流动相A:0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)-甲醇-四氢呋喃(80∶20∶0.8);流动相B:0.05mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.5)-甲醇(20∶80)。采用四段线性梯度洗脱,流速0.6 ml/min,衰减0。荧光检测器:EX 338 nm,EM 425 nm。
1.3.2.4 样品处理
血浆处理:Wistar大鼠断头取血,1 500～2 000 g 离心15 min。精确吸取血清100 μl于1 ml具塞试管中,加入100 μl甲醇及10 %硫酸锌10 μl,振荡混合10 s,3 000 g离心15 min,取上清液50 μl,常温水浴,氮气吹干。
房水处理:Wistar大鼠断头,残头固定,自角膜缘剪开角膜,采用毛细管吸取房水,精确吸取房水40 μl于1 ml具塞试管中。加入100 μl甲醇及10 %硫酸锌10 μl,振荡混合10 s,3 000 g离心15 min,取上清液50 μl,常温水浴,氮气吹干。
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晶状体处理:Wistar大鼠断头,残头固定后自角膜缘剪开角膜,取晶状体,于滤纸上吸取晶体上残留的玻璃体,称量后立即放入匀浆管,加入Tris-Hcl缓冲液(pH=7.4)(总量为25 μl/mg晶状体),0～4 ℃匀浆2 min,8 700 g离心5 min,取上清液,待测定。
2 结果
2.1 计算:由System Glod对峰面积积分,再以标准氨基酸浓度对峰面积作校正曲线,计算样品浓度。
2.2 色谱行为:在上述的色谱条件下,标准品及血、房水、晶体中的牛磺酸与谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、丙氨酸得到了很好的分离,但精氨酸、甘氨酸、苏氨酸分离效果相比之下稍差。见混合标品的色谱图(图1),大鼠血、房水、晶状体中氨基酸分离色谱图(图2)。25 min内,所有氨基酸均全部洗脱,在牛磺酸出峰后,以A液将其余保留时间长的OPA氨基酸衍生物洗脱,使每个样品的分析时间不超过35 min。
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图1 标准色谱图
Figure 1 Standard chromatograma
图2 样品分离色谱图
Figure 2 Separate chromatogram of the sample
2.3 线性关系和最低检出限:以不同浓度氨基酸标准品进行测量,测得其浓度与峰面积的回归方程:
谷氨酸 Y=100.06X-1 110.5,r=0.999
谷氨酰胺 Y=150.17X-1 623.9,r=0.998
丝氨酸 Y=128.58X-1 406.4,r=0.999
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精氨酸+甘氨酸+苏氨酸
Y=359.58X-3 910.4,r=0.998
丙氨酸 Y=151.38X-2 008.8,r=0.993
牛磺酸 Y=158.11X-1 835.3,r=0.998
平均相关系数为0.998±0.002,此方法的最低检出限为10 μg/ml。
2.4 重复性:同一浓度不同进样量时氨基酸面积的变异系数见表1。
表1 同一浓度不同进样量氨基酸峰面积变异系数
Table 1 Coefficient of variation on peak area of amino
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acids in same concentration and different quantity(%) Dose
(μl)
Glum
Glun
Ser
Arg+Gly+Thr
Ala
Tau
3
7.02
8.12
7.00
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10.20
14.10
10.75
5
2.30
2.63
2.24
3.72
4.39
3.12
2.5 回收率:试验中测定各氨基酸回收率,得到的回收率波动范围在91.07%～96.79%之间,见表2。表2 不同氨基酸回收率平均值
, 百拇医药 Table 2 Mean value of the rate of recovery in
different amino acids (n=3)
Glum
Glun
Ser
Arg+Gly+Thr
Ala
Tau
ARR(%)
93.60
91.07
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91.76
96.79
94.00
92.41
ARR:Average recovery rate Glum:Glutamane Glun:Glutanine Ser:Serine Arg:Arginine Gly:Glycine Thr:Threomine Ala:Alanine Tau:Taurine (Figure 1～2,Table 1～2)3 讨论
牛磺酸是机体内1种自由氨基酸,具有很强的渗透压调节作用和抗内源性氧化性损害的作用。在白内障发病早期,晶体内牛磺含量就明显地下降。因此,测量血、房水和晶体中牛磺酸含量对临床预防和治疗白内障有极其重要的意义。
国外对生物样品氨基酸含量的测定常采用氨基酸自动分析仪专项测定〔3〕。在国内也开始用此测定方法,但其分析要求条件高,分析所需时间长,仪器昂贵,不适用于基层单位,采用高效液相色谱仪进行测量更具实用性〔4〕。本文对生物样品中牛磺酸含量,特别是对眼局部房水和晶状体内牛磺酸含量采用高效液相色谱法进行分析,并采用OPA柱前衍生的方法进行测量,使牛磺酸与其它氨基酸得到很好的分离。
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OPA柱前衍生法具有灵敏度高、分辨力强的优点,但衍生反应尚受反应温度、各试剂加入量及反应时间的影响,尤其是反应时间是需要严格掌握的关键因素〔5,6〕。在试验过程中,将衍生反应的时间控制在2 min以内,保证了衍生产物的稳定性;选用2-巯基乙醇作还原剂虽使衍生产物不够稳定,但其有较强的荧光吸收,有利于提高检验的灵敏度,因此更适合于微量氨基酸的分析。
测定结果〔7〕表明,半乳糖性白内障发生发展过程中,血、房水和晶状体中牛磺酸含量均比正常对照组降低,而通过腹腔注射、结膜下注射或点眼人为补充牛磺酸后,晶状体中牛磺酸含量升高,晶状体混浊程度比白内障对照组明显改善。
此方法的不足之处是氨基酸中精氨酸、甘氨酸和苏氨酸的分离不甚理想,但此方法主要目的在于使眼房水、晶状体和血液中的牛磺酸与其它氨基酸可以很好地分离,因此仍不失为测量牛磺酸含量的好方法。
河北省自然科学基金资助课题(No.396157)
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参考文献
1.Kasuya M,Itoi M,Kobayashi S,et al.Changes of glutathione and taurine concentrations in lens of rat eyes induced by galactose-cataract formation or ageing.Exe Eye Res,1992,54:49
2.Malone JI,Benford SA,Malone JJR.Taurine prevents galactose-induced cataracts.Diab Comb,1993,7:44
3.Spackman DH,Stein WH,Moore S.Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids.Anal Chem,1958,30:1190
, http://www.100md.com
4.Auvin-Guette C,Rips R.Polyamines and corresponding amino acids measured together.Chromatographia,1988,26:60
5.Liu HJ.Determination of amino acids by precolumn derivation with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysucciniomidyl carbamate and higy-performance liquid chromatography with ultroviolet detection.J Chromatogr,1994,670:59
6.Lindroth P,Mopper K.High-performance liquid chromatography determination of derivatization with ophthaldialdedyde.Anal Chem,1979,51:1667
7.宋秀君,王仁杰,颜京霞,等.牛磺酸对半乳糖白内障大鼠房水和晶体游离氨基酸含量的影响.中国药理毒理学杂志,1998,3:225
(1998-02-23 收稿), 百拇医药