侵染西番莲属(Passiflora)植物的五个黄瓜花叶病毒分离物的特性比较
作者：徐平东 李 梅 林奇英 谢联辉
单位：徐平东 李 梅(厦门华侨亚热带植物引种园国家植物引种隔离检疫基地，厦门 361002)；林奇英 谢联辉(福建农业大学植物病毒研究所，福州350002)
关键词：西番莲属植物；黄瓜花叶病毒亚组I；黄瓜花叶病毒亚组II
中国病毒学990114 摘 要 从紫果西番莲(Passiflora edulis)、杂交种西番莲(P. edulis X P.edulis var. flavicarpa)、黄果西番莲(P.edulis var. flavicarpa)、转心莲(P.caerulea)及龙珠果(P.foetida)分离到的5个黄瓜花叶病毒(CMV)分离物(PE、PE2、PEf、PC、PF)所作的生物学性质、理化特性和血清学关系的比较研究结果表明，5个分离物在寄主反应及血清学性质上存在不同，而在病毒粒体形态、体外抗性、蚜虫传毒和病毒外壳蛋白分子量方面无明显差异。根据5个分离物的寄主反应和血清学关系，可将其区分为CMV的两个亚组，其中PE、PE2、PC和PF属CMV亚组I，PEf属CMV亚组II。
, 百拇医药
Comparative Studies on Properties of Five Cucumber Mosaic
Virus Isolates Infecting Passiflora in China
Xu Pingdong Li Mei
(National Plant Introduction Quarantine Base, Xiamen Overseas Chinese SubtropicalPlant Introduction Garden, Xiamen 361002)
Lin Qiying Xie Lianhui
(Institute of Plant Virology, Fujian Agricultural University, Fuzhou 350002)
, 百拇医药
Abstract Comparative studies on biological properties, physical and biochemical properties, morphology and serological relationships of five cucumber mosaic virus (CMV) isolates (PE,PE2,PEf,PC,PF) infecting Passiflora edulis, P. edulis × P.edulis var. flavicarpa, P.edulis var. flavicarpa, P.caerulea, P.foetida were carried out. There were differences in host reactions and serological relationships of five CMV isolates. However, similarities were found in viral particle morphology, stability in sap, aphid transmission, molecular weight of coat protein of five CMV isolates. According to the host reactions and serological relationships, these five isolates could be divided into two CMV subgroups, among which PE, PE2,PC,PF belonged to subgroup I and PEf to subgroupII.
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Key words Passiflora, CMV subgroup I, CMV subgroup II
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)寄主范围极其广泛，给农业生产造成重要经济损失。近年来，CMV在热带、亚热带经济植物上造成的损失也日益严重[1]。由CMV引起的病毒病在许多西番莲生产国造成危害[2]。我国的台湾[3]、广东[4]、福建[5]及海南[6]也先后报道CMV危害西番莲。但迄今对侵染西番莲属(Passiflora)植物的CMV进行较为系统深入研究的报道很少，尤其对这些CMV分离物所处亚组更不甚了解[2]。作者在调查福建西番莲病毒病发生时，发现CMV为其主要病原，并对其病原CMV进行了初步亚组分析，认为存在两个CMV亚组。本文报道侵染西番莲属植物的5个CMV分离物的生物学性质、理化特性和血清学关系等方面的研究结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 毒源及其纯化
5个CMV分离物来自紫果西番莲(Passiflora edulis)、杂交种西番莲(P.edulis×P.edulis var. flavicarpa)、黄果西番莲(P.edulis var. flavicarpa)、转心莲(P.caerulea)及龙珠果(P.foetida)，编号分别为PE、PE2、PEf、PC和PF。各分离物均经苋色藜(Chenopodium amaranticolor)单斑分离，繁殖在心叶烟(Nicotiana glutinosa)上，置隔离检疫温室。
1.2 生物学性质测定
寄主范围、体外抗性和蚜虫传毒试验均按常规方法进行。
1.3 病毒提纯及其检测
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5个CMV分离物的粗提纯按Lot等[7]或Mossop等[8]的提纯方法；进一步提纯，采用10%～40%蔗糖梯度离心。提纯病毒用Beckman DU8型紫外/可见分光光度计在220～320nm波长范围进行扫描，检测病毒的紫外吸收，测A260/280值，以E0.1%260=5.0[9]来估计病毒浓度及提纯产量。提纯的病毒经2%醋酸铀(pH5.0)染色后，JEM-100CXII型透射电镜观察病毒粒体形态。
1.4 病毒外壳蛋白分子量测定
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定[10]。分离胶浓度为15%，浓缩胶为5%，SDS为0.1%。用IS-1000型数字成像系统(Alpha Innotech公司产品)的分子量测算软件计算各分离物外壳蛋白亚基的分子量。标准蛋白为Gibco BRL公司产品，分子量为Myosin(H-chain,200000),Phosphorylase B(97400),Bovine serum albumin(68000), Ovalbumin
, 百拇医药
(43000), Carbonic anhydrase(29000),β-Lactoglobulin(18400),Lysozyme(14300)。
1.5 血清学试验
1.5.1 抗血清制备 用PE2和PEf两个分离物免疫家兔制备抗血清。免疫方法按文献[11]。1.0%琼脂双扩散方法测定抗血清效价。
1.5.2 单、多克隆抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)测定 按文献[2]的方法测定。8种CMV单克隆抗体的来源为：单克隆抗体2.1、21.4、34.2、41.2由法国国家科学研究中心Van Regenmortel博士赠送，单克隆抗体4H10B12、7B3D9、23C10E4、44E9A7由美国农业部徐惠迪博士赠送。
2 结果
, 百拇医药
2.1 寄主范围及症状反应
摩擦接种14科63种(或品种)植物，5个CMV分离物均能侵染西番莲科、藜科、茄科、葫芦科、豆科、夹竹桃科、苋科、菊科、番杏科、胡麻科、唇形科11科53种(或品种)植物，但所产生的症状各分离物间存在较大差异(表1)。根据5个CMV分离物在供试寄主植物上的症状反应，可以将它们区分为两个类群。第1类群(包括分离物PE、PE2、PC、PF)，其特点是在心叶烟(Nicotiana glutinosa)和珊西烟(N.tabacum cv. Xanthi-NC)上，表现绿色花叶、叶片畸型症状；在西葫芦(Cucurbita pepo)上，表现为接种叶局部退绿斑、新生叶退绿斑驳症状；在千日红(Gomphrena globosa)上，表现为接种叶局部坏死斑、新生叶绿色花叶症状。第2类群(包括分离物PEf)，其特点是在心叶烟和珊西烟上，表现为接种叶局部退斑和新生叶退绿斑驳；在西葫芦上，表现为接种叶局部退绿斑、新生叶稳症带毒；在千日红上，表现接种叶局部坏死斑、新生叶系统坏死斑。
, 百拇医药
表1 5个CMV分离物的寄主范围及症状反应
Table 1 Host range and symptoms of five CMV isolates 寄主范围
Host range
症状 Symptom
PE
PE2
PC
PF
PEf
藜科Chenopodiaceae
苋色藜(Chenopodium amaranticolor)
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LNL/-
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昆诺藜(C.quinoa)
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灰藜(C.album)
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墙藜(C.murale)
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甜菜(Beta vulgaris)
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-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/+
西番莲科Passifloraceae
紫果西番莲(Passiflora edulis)
-/GM
-/GM,TN
-/GM
-/GM
-/GM
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黄果西番莲(P.edulis var.flavicarpa)
-/GM
-/GM,LD,TN
-/GM
-/GM
-/GM
(P.edulis X P.edulis var.flavicarpa)
-/GM
-/GM,LD,TN
-/GM
-/GM
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-/GM
龙珠果(P.foetida)
-/GM,LD
-/GM,LD,TN
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
毛西番莲(P.mollissima)
-/GM
-/TN
-/GM
-/GM
, http://www.100md.com
-/GM
转心莲(p.caerulea)
-/GM,LD
-/GM,TN
-/GM,LD
-/GM
-/GM,LD
茄科Solanaceae
心叶烟(Nicotiana glutinosa)
-/GM,FL
-/GM,FL，TN
, 百拇医药 -/GM,FL
-/GM,FL
LCL/CMo,LD
普通烟(N.tabacum)
cv.Havana 38
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/CMo
cv.Samsum-NN
-/GM,LD
, 百拇医药
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/mCMo
cv.Turkish
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM-
-/CMo
cv.White Burley
-/GM,LD
, http://www.100md.com
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM-
-/CMo
cv.Xanthi-NC
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/mCMo
cv.黄苗榆
-/GM
, 百拇医药
-/GM
-/GM
-/mGM
-/mCMo
cv.亮黄烟
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/CMo
本氏烟(N.benthamiana)
-/GM,LD,S
, 百拇医药
-/GM,LD,TN
-/CMo,LD
-/GM,LD,S,D
-/CMo
德氏烟(N.debneyi)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/+
克氏烟(N.clevelandii)
-/GM,LD
, 百拇医药
-/GM,LD,D
-/GM,LD,S
-/GM,LD,S
LCL/CMo
黄花烟(N.rustica)
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/CMo,LD
假酸浆(Nicandra physaloides)
, http://www.100md.com
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/+
蔓陀萝(Datura stramonium)
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/CMo,LD
-/CMo,LD
番茄(Lycopersicon esculentum)
, http://www.100md.com
cv.Momor
-/GM,FL
-/GM,FL,S
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
cv.苹果青番茄
-/GM,FL
-/GM,FL,S
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
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cv.直房丛生番茄
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
辣椒(Capsicum frutescens)
-/GM
-/GM
-/YGM
-/RSM
-/GM
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大椒(C.annum)cv.Green Giant
LCL/VC,CMo,LD
LCL/CMo,LD
LCL/VC,CMo,LD
LCL/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
洋酸浆(Physalis floridana)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
, 百拇医药
-/GM
矮牵牛(Petunia hybrida)
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC，CMo
龙葵(Solanum nigrum)
-/GM
-/GM
-/GM
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-/GM
玄参科Sorophulariaceae
金鱼草(Antirrhinum majus)
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豆科Leguminosae
蚕豆(Vicia faba)
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碗豆(Pisum sativum)cv. Green-foast
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豇豆(Vigna unguiculata)
cv.Black eye
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cv.黑种二尺
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cv.长泰豇豆
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大豆(Glycine max)cv.诱变33
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菜豆(Phaseolus vulgaris)
cv.Bountiful
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cv.Pinto
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cv.Top crop
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长序菜豆(Phaseolus lathyroides)
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绿豆(Vigna radiata) cv.M7A
LNL/-
, 百拇医药
LNL/-
LNL/-
LNL/-
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望江南(Cassia occidentalis)
LNL/-
LNL/-
LNL/-
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决明(C.tora)
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深红三叶草(Triforlium incarnatum)
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葫芦科Cucurbitaceae
黄瓜(Cucumis sativus)
, 百拇医药
cv.长青黄瓜
LCL/CMo
LCL/CMo,D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
cv.二青黄瓜
LCL/CMo
LCL/CMo，D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
, 百拇医药
西葫芦(Cucurbita pepo)
LCL/CMo
LCL/CMo,LD,S,D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/+
笋瓜(Cucurbita maxima)cv.Buffer cup
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
, 百拇医药
LCL/CMo
丝瓜(Luffa cylindrica)
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
十字花科Cruciferae
大白菜(Brassica pekinensis)
cv.夏洋白菜
-/-
-/-
, 百拇医药
-/-
-/-
-/-
苋科Amaranthaceae
千日红(Gomphrena globosa)
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/SNL
老枪谷(Amaranthus caudatus)
, http://www.100md.com
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
菊科Compositae
莴苣(Lactuca sativa)
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/+
, 百拇医药
百日菊(Zinnia elegans)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
番杏科Aizoaceae
番杏(Tetragonia expansa)
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
, http://www.100md.com
LCL/-
夹竹桃科Apocynaceae
长春花(Catharanthus roseus)
-/GM,LD
-/GM,LD,S
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM
胡麻科Pedaliaceae
白芝麻(Sesamum indicum)
LNL/-
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LNL/D
LNL/-
LNL/-
LNL/-
唇形科Labiatae
罗勒(Ocimum basilicum)
-/GM
-/GM,LD
-/YGM
-/GM
-/GM
禾本科Poaceae
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玉米(Zea mays ssp. mays)cv.掖478
-/-
-/-
-/-
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CMo=Chlorotic mottle退绿斑驳，D=Dead of plants全株死亡，FL=Fern-leaf symptoms厥叶症，GM=Green mosaic绿色花叶，LCL=Local chlorotic lesions局部退绿斑，LD=Leaf distortion畸形，LNL=Local necrotic lesions局部坏死斑，m=Mild轻症，RSM＝Ringspot-mosaic环斑花叶，S=矮化 Stunt,SNL=Systemic necrotic lesions系统坏死斑，TN=Tip necrosis顶端坏死，VN=Vein necrosis叶脉坏死，YGM=Yellow-green mosaic黄绿色花叶，+=Symptomless infection隐症侵染，-=No infection不侵染
, 百拇医药
2.2 体外抗性
5个CMV分离物的体外抗性如表2。
表2 5个CMV分离物的体外抗性
Table 2 Stability in sap of five CMV isolates 病毒分离物
Virus isolate
失毒温度
TIP(℃)
稀释限点
DEP
体外存活期
LIV(d)
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PE
50～55
10-3～10-4
4～5
PE2
50～55
10-3～10-4
2～3
PC
50～55
10-3～10-4
, 百拇医药
4～5
PF
50～55
10-3～10-4
4～5
PEf
50～55
10-2～10-3
2～3
2.3 蚜虫传毒试验
5个CMV分离物均可通过桃蚜(Myzus persicae)以非持久方式传播，传毒效率无明显差异(表3)。 表3 5个CMV分离物的桃蚜传毒试验结果
, 百拇医药
Table 3 Transmission via Myzus persicae 毒源植物
Source plant
试验植物
Test plant
PE
PE2
PC
PF
PEf
对照
CK
N.tabacum
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Passiflora edulis
8/10
6/10
8/10
7/10
6/10
0/10
N.tabacum
Passiflora foetida
10/10
8/10
9/10
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10/10
8/10
0/10
饲毒时间为5min(Acquisition feeding time 5min);传毒时间为24h(Inoculation feeding time 24h)；每株10头蚜虫(10 aphids per plant were used);表中数值表示发病株数/接种株数(Diseased plants/inoculated plants)。
2.4 病毒的提纯产量、紫外吸收及粒体
采用Lot等[7]或Mossop等[8]的提纯方法对5个CMV分离物进行粗提纯，然后用10%～40%蔗糖梯度离心进一步提纯，获得纯化病毒。提纯病毒的紫外吸收都显示典型的核蛋白吸收曲线，最高吸收在258nm左右，最低吸收在240nm左右，其A260/280值在1.63～1.72之间，各分离物的提纯产量相差很大，最高产量达783mg/kg鲜叶，最低产量仅24mg/kg鲜叶。电镜观察表明5个分离物的提纯病毒粒体均为球状，直径为24～30nm(表4，图1。)
, 百拇医药
表4 5个CMV分离物的粒体大小、紫外吸收和提纯产量
Table 4 Virions, ultraviolet absorption and purified yields of five CMV isolates 病毒分离物
Virus isolate
粒体大小(nm)
Virion
紫外吸收 Ultraviolet absorption
提纯产量(mg/kg)a
Purified yield
A260
, 百拇医药
A280
A260/280
PE
26～28
0.8530
0.5240
1.63
228b
PE2
24～26
1.3106
0.7620
, 百拇医药 1.72
783b
PC
26～28
0.8040
0.4729
1.70
307c
PF
26～28
1.1810
0.6960
, http://www.100md.com 1.70
24c
PEf
28～30
0.6800
0.3960
1.72
121c
a:最高产量(Highest jield); b:粗提纯按Lot等方法(Partial purified by Lot et al); c:粗提纯按Mossop等的方法(Partial purified by Mossop et al).
, 百拇医药
图1 3个CMV分离物的提纯病毒粒体(×140000)
Fig.1 Virions of three CMV isolates (×140000) A:PE； B:PE2； C:PEf
5个CMV分离物的外壳蛋白分子量经多次SDS-PAGE测定，结果表明均为单个亚基组成，经分子量测算软件计算，其分子量均为27kD。
2.6 血清学关系测定
2.6.1 抗血清效价
用分离物PE2和PEf的提纯制剂免疫家兔制备的抗血清，经琼脂双扩散测定，效价分别为1∶256和1∶128。
2.6.2 DAS-ELISA测定
, 百拇医药 用8个单克隆抗体对5个CMV分离物进行DAS-ELISA测定，其结果列于表5。根据文献[12，13]，单克隆抗体21.4和7B3D9仅与ToRS血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体34.2和4H10B12仅与DTL血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体42.3仅与Co血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体2.1、23C10E4及44E9A7与DTL、ToRS两个血清组的分离物均具阳性反应。分离物PEf与单克隆抗体21.4和7B3D9具强阳性反应，而与 单克隆抗体34.2、42.3及4H10B12显阴性反应，属ToRS血清组；分离物PE、PE2、PC、PF与单克隆抗体34.2及4H10B12具强阳性反应，而与单克隆抗体21.4、42.3及7B3D9显阴性反应，属DTL血清组。
表5 5个CMV分离物的DAS-ELISA测定 (A405吸收值a)
Table 5 Absorption values (A405)obtained in DAS-ELISA with eight monoclonal antibodies to five CMV isolates 病毒分离物
, http://www.100md.com
Virus isolate
单 克 隆 抗 体 Monoclonal antibody
2.1
34.2
21.4
42.3
4H10B12
7B3D9
23C10E4
44E9A7
PE
1.496
, 百拇医药
1.337
0.189
0.252
1.174
0.000
1.240
0.928
PE2
1.353
1.200
0.167
0.285
1.275
, 百拇医药
0.002
1.379
0.942
PC
1.239
0.962
0.138
0.245
0.908
0.020
1.200
1.270
PF
, 百拇医药
1.514
1.340
0.231
0.178
1.265
0.021
1.405
1.200
PEf
1.200
0.040
1.200
0.187
, http://www.100md.com
0.000
0.660
1.060
0.716
Healthy tobacco
0.076
0.021
0.034
0.030
0.014
0.003
0.003
, http://www.100md.com 0.000
PBST-PVP
0.105
0.160
0.198
0.150
0.139
0.131
0.060
0.101
a2次实验平均值(Average value in two tests).
3 讨论
, http://www.100md.com
CMV存在众多株系或分离物[14，15]，但是大量的研究表明这些株系或分离物可根据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白的肽链图谱分析、dsRNA分析、核酸杂交、RT-PCR产物的限制酶分析以及核酸序列分析等区分为两个性质不同的亚组[1，16]。根据侵染西番莲属植物的5个CMV分离物在心叶烟等4个鉴别寄主的症状和血清学关系，可将其区分为两个类群，第1类群(包括分离物PE、PE2、PC和PF)属CMV亚组I；第2类群(包括分离物PEf)属CMV亚组II。
CMV侵染西番莲在国内外均有报道[2～6]，但是，对其性质未作系统深入的研究。本研究初步明确了我国侵染西番莲属植物CMV的特性，并将它们鉴定区分为两个亚组。这一结果可为进一步研究我国西番莲病毒病的防治提供参考。
致谢 法国国家科学研究中心M.H.V.Van Regenmortel博士和美国农业部徐惠迪博士赠送CMV单克隆抗体，特此致谢!
, 百拇医药
* 福建省自然科学基金资助项目(C95059)
参考文献
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收稿日期1998-01-21修回日期：1998-05-11, http://www.100md.com
单位：徐平东 李 梅(厦门华侨亚热带植物引种园国家植物引种隔离检疫基地，厦门 361002)；林奇英 谢联辉(福建农业大学植物病毒研究所，福州350002)
关键词：西番莲属植物；黄瓜花叶病毒亚组I；黄瓜花叶病毒亚组II
中国病毒学990114 摘 要 从紫果西番莲(Passiflora edulis)、杂交种西番莲(P. edulis X P.edulis var. flavicarpa)、黄果西番莲(P.edulis var. flavicarpa)、转心莲(P.caerulea)及龙珠果(P.foetida)分离到的5个黄瓜花叶病毒(CMV)分离物(PE、PE2、PEf、PC、PF)所作的生物学性质、理化特性和血清学关系的比较研究结果表明，5个分离物在寄主反应及血清学性质上存在不同，而在病毒粒体形态、体外抗性、蚜虫传毒和病毒外壳蛋白分子量方面无明显差异。根据5个分离物的寄主反应和血清学关系，可将其区分为CMV的两个亚组，其中PE、PE2、PC和PF属CMV亚组I，PEf属CMV亚组II。
, 百拇医药
Comparative Studies on Properties of Five Cucumber Mosaic
Virus Isolates Infecting Passiflora in China
Xu Pingdong Li Mei
(National Plant Introduction Quarantine Base, Xiamen Overseas Chinese SubtropicalPlant Introduction Garden, Xiamen 361002)
Lin Qiying Xie Lianhui
(Institute of Plant Virology, Fujian Agricultural University, Fuzhou 350002)
, 百拇医药
Abstract Comparative studies on biological properties, physical and biochemical properties, morphology and serological relationships of five cucumber mosaic virus (CMV) isolates (PE,PE2,PEf,PC,PF) infecting Passiflora edulis, P. edulis × P.edulis var. flavicarpa, P.edulis var. flavicarpa, P.caerulea, P.foetida were carried out. There were differences in host reactions and serological relationships of five CMV isolates. However, similarities were found in viral particle morphology, stability in sap, aphid transmission, molecular weight of coat protein of five CMV isolates. According to the host reactions and serological relationships, these five isolates could be divided into two CMV subgroups, among which PE, PE2,PC,PF belonged to subgroup I and PEf to subgroupII.
, 百拇医药
Key words Passiflora, CMV subgroup I, CMV subgroup II
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)寄主范围极其广泛，给农业生产造成重要经济损失。近年来，CMV在热带、亚热带经济植物上造成的损失也日益严重[1]。由CMV引起的病毒病在许多西番莲生产国造成危害[2]。我国的台湾[3]、广东[4]、福建[5]及海南[6]也先后报道CMV危害西番莲。但迄今对侵染西番莲属(Passiflora)植物的CMV进行较为系统深入研究的报道很少，尤其对这些CMV分离物所处亚组更不甚了解[2]。作者在调查福建西番莲病毒病发生时，发现CMV为其主要病原，并对其病原CMV进行了初步亚组分析，认为存在两个CMV亚组。本文报道侵染西番莲属植物的5个CMV分离物的生物学性质、理化特性和血清学关系等方面的研究结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 毒源及其纯化
5个CMV分离物来自紫果西番莲(Passiflora edulis)、杂交种西番莲(P.edulis×P.edulis var. flavicarpa)、黄果西番莲(P.edulis var. flavicarpa)、转心莲(P.caerulea)及龙珠果(P.foetida)，编号分别为PE、PE2、PEf、PC和PF。各分离物均经苋色藜(Chenopodium amaranticolor)单斑分离，繁殖在心叶烟(Nicotiana glutinosa)上，置隔离检疫温室。
1.2 生物学性质测定
寄主范围、体外抗性和蚜虫传毒试验均按常规方法进行。
1.3 病毒提纯及其检测
, 百拇医药
5个CMV分离物的粗提纯按Lot等[7]或Mossop等[8]的提纯方法；进一步提纯，采用10%～40%蔗糖梯度离心。提纯病毒用Beckman DU8型紫外/可见分光光度计在220～320nm波长范围进行扫描，检测病毒的紫外吸收，测A260/280值，以E0.1%260=5.0[9]来估计病毒浓度及提纯产量。提纯的病毒经2%醋酸铀(pH5.0)染色后，JEM-100CXII型透射电镜观察病毒粒体形态。
1.4 病毒外壳蛋白分子量测定
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定[10]。分离胶浓度为15%，浓缩胶为5%，SDS为0.1%。用IS-1000型数字成像系统(Alpha Innotech公司产品)的分子量测算软件计算各分离物外壳蛋白亚基的分子量。标准蛋白为Gibco BRL公司产品，分子量为Myosin(H-chain,200000),Phosphorylase B(97400),Bovine serum albumin(68000), Ovalbumin
, 百拇医药
(43000), Carbonic anhydrase(29000),β-Lactoglobulin(18400),Lysozyme(14300)。
1.5 血清学试验
1.5.1 抗血清制备 用PE2和PEf两个分离物免疫家兔制备抗血清。免疫方法按文献[11]。1.0%琼脂双扩散方法测定抗血清效价。
1.5.2 单、多克隆抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)测定 按文献[2]的方法测定。8种CMV单克隆抗体的来源为：单克隆抗体2.1、21.4、34.2、41.2由法国国家科学研究中心Van Regenmortel博士赠送，单克隆抗体4H10B12、7B3D9、23C10E4、44E9A7由美国农业部徐惠迪博士赠送。
2 结果
, 百拇医药
2.1 寄主范围及症状反应
摩擦接种14科63种(或品种)植物，5个CMV分离物均能侵染西番莲科、藜科、茄科、葫芦科、豆科、夹竹桃科、苋科、菊科、番杏科、胡麻科、唇形科11科53种(或品种)植物，但所产生的症状各分离物间存在较大差异(表1)。根据5个CMV分离物在供试寄主植物上的症状反应，可以将它们区分为两个类群。第1类群(包括分离物PE、PE2、PC、PF)，其特点是在心叶烟(Nicotiana glutinosa)和珊西烟(N.tabacum cv. Xanthi-NC)上，表现绿色花叶、叶片畸型症状；在西葫芦(Cucurbita pepo)上，表现为接种叶局部退绿斑、新生叶退绿斑驳症状；在千日红(Gomphrena globosa)上，表现为接种叶局部坏死斑、新生叶绿色花叶症状。第2类群(包括分离物PEf)，其特点是在心叶烟和珊西烟上，表现为接种叶局部退斑和新生叶退绿斑驳；在西葫芦上，表现为接种叶局部退绿斑、新生叶稳症带毒；在千日红上，表现接种叶局部坏死斑、新生叶系统坏死斑。
, 百拇医药
表1 5个CMV分离物的寄主范围及症状反应
Table 1 Host range and symptoms of five CMV isolates 寄主范围
Host range
症状 Symptom
PE
PE2
PC
PF
PEf
藜科Chenopodiaceae
苋色藜(Chenopodium amaranticolor)
, 百拇医药
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
昆诺藜(C.quinoa)
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
灰藜(C.album)
, http://www.100md.com
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
墙藜(C.murale)
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
甜菜(Beta vulgaris)
, 百拇医药
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/+
西番莲科Passifloraceae
紫果西番莲(Passiflora edulis)
-/GM
-/GM,TN
-/GM
-/GM
-/GM
, 百拇医药
黄果西番莲(P.edulis var.flavicarpa)
-/GM
-/GM,LD,TN
-/GM
-/GM
-/GM
(P.edulis X P.edulis var.flavicarpa)
-/GM
-/GM,LD,TN
-/GM
-/GM
, 百拇医药
-/GM
龙珠果(P.foetida)
-/GM,LD
-/GM,LD,TN
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
毛西番莲(P.mollissima)
-/GM
-/TN
-/GM
-/GM
, http://www.100md.com
-/GM
转心莲(p.caerulea)
-/GM,LD
-/GM,TN
-/GM,LD
-/GM
-/GM,LD
茄科Solanaceae
心叶烟(Nicotiana glutinosa)
-/GM,FL
-/GM,FL，TN
, 百拇医药 -/GM,FL
-/GM,FL
LCL/CMo,LD
普通烟(N.tabacum)
cv.Havana 38
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/CMo
cv.Samsum-NN
-/GM,LD
, 百拇医药
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/mCMo
cv.Turkish
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM-
-/CMo
cv.White Burley
-/GM,LD
, http://www.100md.com
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM-
-/CMo
cv.Xanthi-NC
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/mCMo
cv.黄苗榆
-/GM
, 百拇医药
-/GM
-/GM
-/mGM
-/mCMo
cv.亮黄烟
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/CMo
本氏烟(N.benthamiana)
-/GM,LD,S
, 百拇医药
-/GM,LD,TN
-/CMo,LD
-/GM,LD,S,D
-/CMo
德氏烟(N.debneyi)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/+
克氏烟(N.clevelandii)
-/GM,LD
, 百拇医药
-/GM,LD,D
-/GM,LD,S
-/GM,LD,S
LCL/CMo
黄花烟(N.rustica)
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/CMo,LD
假酸浆(Nicandra physaloides)
, http://www.100md.com
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/+
蔓陀萝(Datura stramonium)
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/GM,LD
LCL/CMo,LD
-/CMo,LD
番茄(Lycopersicon esculentum)
, http://www.100md.com
cv.Momor
-/GM,FL
-/GM,FL,S
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
cv.苹果青番茄
-/GM,FL
-/GM,FL,S
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
, http://www.100md.com
cv.直房丛生番茄
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,FL
-/GM,LD
辣椒(Capsicum frutescens)
-/GM
-/GM
-/YGM
-/RSM
-/GM
, 百拇医药
大椒(C.annum)cv.Green Giant
LCL/VC,CMo,LD
LCL/CMo,LD
LCL/VC,CMo,LD
LCL/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
洋酸浆(Physalis floridana)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
, 百拇医药
-/GM
矮牵牛(Petunia hybrida)
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC,CMo,LD
-/VC，CMo
龙葵(Solanum nigrum)
-/GM
-/GM
-/GM
, 百拇医药 -/GM
-/GM
玄参科Sorophulariaceae
金鱼草(Antirrhinum majus)
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
豆科Leguminosae
蚕豆(Vicia faba)
-/-
, http://www.100md.com
-/-
-/-
-/-
-/-
碗豆(Pisum sativum)cv. Green-foast
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
豇豆(Vigna unguiculata)
cv.Black eye
, http://www.100md.com
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
cv.黑种二尺
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
cv.长泰豇豆
LNL/-
, http://www.100md.com
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
大豆(Glycine max)cv.诱变33
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
菜豆(Phaseolus vulgaris)
cv.Bountiful
, 百拇医药
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
cv.Pinto
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
cv.Top crop
-/-
, 百拇医药
-/-
-/-
-/-
-/-
长序菜豆(Phaseolus lathyroides)
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
绿豆(Vigna radiata) cv.M7A
LNL/-
, 百拇医药
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
望江南(Cassia occidentalis)
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
决明(C.tora)
-/-
, 百拇医药
-/-
-/-
-/-
-/-
深红三叶草(Triforlium incarnatum)
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
葫芦科Cucurbitaceae
黄瓜(Cucumis sativus)
, 百拇医药
cv.长青黄瓜
LCL/CMo
LCL/CMo,D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
cv.二青黄瓜
LCL/CMo
LCL/CMo，D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
, 百拇医药
西葫芦(Cucurbita pepo)
LCL/CMo
LCL/CMo,LD,S,D
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/+
笋瓜(Cucurbita maxima)cv.Buffer cup
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
LCL/CMo
, 百拇医药
LCL/CMo
丝瓜(Luffa cylindrica)
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
十字花科Cruciferae
大白菜(Brassica pekinensis)
cv.夏洋白菜
-/-
-/-
, 百拇医药
-/-
-/-
-/-
苋科Amaranthaceae
千日红(Gomphrena globosa)
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/GM,LD
LNL/SNL
老枪谷(Amaranthus caudatus)
, http://www.100md.com
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
LNL/-
菊科Compositae
莴苣(Lactuca sativa)
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM,LD
-/+
, 百拇医药
百日菊(Zinnia elegans)
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
-/GM
番杏科Aizoaceae
番杏(Tetragonia expansa)
LCL/-
LCL/-
LCL/-
LCL/-
, http://www.100md.com
LCL/-
夹竹桃科Apocynaceae
长春花(Catharanthus roseus)
-/GM,LD
-/GM,LD,S
-/GM,LD
-/GM,LD
-/GM
胡麻科Pedaliaceae
白芝麻(Sesamum indicum)
LNL/-
, 百拇医药
LNL/D
LNL/-
LNL/-
LNL/-
唇形科Labiatae
罗勒(Ocimum basilicum)
-/GM
-/GM,LD
-/YGM
-/GM
-/GM
禾本科Poaceae
, 百拇医药
玉米(Zea mays ssp. mays)cv.掖478
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
CMo=Chlorotic mottle退绿斑驳，D=Dead of plants全株死亡，FL=Fern-leaf symptoms厥叶症，GM=Green mosaic绿色花叶，LCL=Local chlorotic lesions局部退绿斑，LD=Leaf distortion畸形，LNL=Local necrotic lesions局部坏死斑，m=Mild轻症，RSM＝Ringspot-mosaic环斑花叶，S=矮化 Stunt,SNL=Systemic necrotic lesions系统坏死斑，TN=Tip necrosis顶端坏死，VN=Vein necrosis叶脉坏死，YGM=Yellow-green mosaic黄绿色花叶，+=Symptomless infection隐症侵染，-=No infection不侵染
, 百拇医药
2.2 体外抗性
5个CMV分离物的体外抗性如表2。
表2 5个CMV分离物的体外抗性
Table 2 Stability in sap of five CMV isolates 病毒分离物
Virus isolate
失毒温度
TIP(℃)
稀释限点
DEP
体外存活期
LIV(d)
, 百拇医药
PE
50～55
10-3～10-4
4～5
PE2
50～55
10-3～10-4
2～3
PC
50～55
10-3～10-4
, 百拇医药
4～5
PF
50～55
10-3～10-4
4～5
PEf
50～55
10-2～10-3
2～3
2.3 蚜虫传毒试验
5个CMV分离物均可通过桃蚜(Myzus persicae)以非持久方式传播，传毒效率无明显差异(表3)。 表3 5个CMV分离物的桃蚜传毒试验结果
, 百拇医药
Table 3 Transmission via Myzus persicae 毒源植物
Source plant
试验植物
Test plant
PE
PE2
PC
PF
PEf
对照
CK
N.tabacum
, 百拇医药
Passiflora edulis
8/10
6/10
8/10
7/10
6/10
0/10
N.tabacum
Passiflora foetida
10/10
8/10
9/10
, http://www.100md.com
10/10
8/10
0/10
饲毒时间为5min(Acquisition feeding time 5min);传毒时间为24h(Inoculation feeding time 24h)；每株10头蚜虫(10 aphids per plant were used);表中数值表示发病株数/接种株数(Diseased plants/inoculated plants)。
2.4 病毒的提纯产量、紫外吸收及粒体
采用Lot等[7]或Mossop等[8]的提纯方法对5个CMV分离物进行粗提纯，然后用10%～40%蔗糖梯度离心进一步提纯，获得纯化病毒。提纯病毒的紫外吸收都显示典型的核蛋白吸收曲线，最高吸收在258nm左右，最低吸收在240nm左右，其A260/280值在1.63～1.72之间，各分离物的提纯产量相差很大，最高产量达783mg/kg鲜叶，最低产量仅24mg/kg鲜叶。电镜观察表明5个分离物的提纯病毒粒体均为球状，直径为24～30nm(表4，图1。)
, 百拇医药
表4 5个CMV分离物的粒体大小、紫外吸收和提纯产量
Table 4 Virions, ultraviolet absorption and purified yields of five CMV isolates 病毒分离物
Virus isolate
粒体大小(nm)
Virion
紫外吸收 Ultraviolet absorption
提纯产量(mg/kg)a
Purified yield
A260
, 百拇医药
A280
A260/280
PE
26～28
0.8530
0.5240
1.63
228b
PE2
24～26
1.3106
0.7620
, 百拇医药 1.72
783b
PC
26～28
0.8040
0.4729
1.70
307c
PF
26～28
1.1810
0.6960
, http://www.100md.com 1.70
24c
PEf
28～30
0.6800
0.3960
1.72
121c
a:最高产量(Highest jield); b:粗提纯按Lot等方法(Partial purified by Lot et al); c:粗提纯按Mossop等的方法(Partial purified by Mossop et al).
, 百拇医药
图1 3个CMV分离物的提纯病毒粒体(×140000)
Fig.1 Virions of three CMV isolates (×140000) A:PE； B:PE2； C:PEf
5个CMV分离物的外壳蛋白分子量经多次SDS-PAGE测定，结果表明均为单个亚基组成，经分子量测算软件计算，其分子量均为27kD。
2.6 血清学关系测定
2.6.1 抗血清效价
用分离物PE2和PEf的提纯制剂免疫家兔制备的抗血清，经琼脂双扩散测定，效价分别为1∶256和1∶128。
2.6.2 DAS-ELISA测定
, 百拇医药 用8个单克隆抗体对5个CMV分离物进行DAS-ELISA测定，其结果列于表5。根据文献[12，13]，单克隆抗体21.4和7B3D9仅与ToRS血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体34.2和4H10B12仅与DTL血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体42.3仅与Co血清组的分离物具阳性反应；单克隆抗体2.1、23C10E4及44E9A7与DTL、ToRS两个血清组的分离物均具阳性反应。分离物PEf与单克隆抗体21.4和7B3D9具强阳性反应，而与 单克隆抗体34.2、42.3及4H10B12显阴性反应，属ToRS血清组；分离物PE、PE2、PC、PF与单克隆抗体34.2及4H10B12具强阳性反应，而与单克隆抗体21.4、42.3及7B3D9显阴性反应，属DTL血清组。
表5 5个CMV分离物的DAS-ELISA测定 (A405吸收值a)
Table 5 Absorption values (A405)obtained in DAS-ELISA with eight monoclonal antibodies to five CMV isolates 病毒分离物
, http://www.100md.com
Virus isolate
单 克 隆 抗 体 Monoclonal antibody
2.1
34.2
21.4
42.3
4H10B12
7B3D9
23C10E4
44E9A7
PE
1.496
, 百拇医药
1.337
0.189
0.252
1.174
0.000
1.240
0.928
PE2
1.353
1.200
0.167
0.285
1.275
, 百拇医药
0.002
1.379
0.942
PC
1.239
0.962
0.138
0.245
0.908
0.020
1.200
1.270
PF
, 百拇医药
1.514
1.340
0.231
0.178
1.265
0.021
1.405
1.200
PEf
1.200
0.040
1.200
0.187
, http://www.100md.com
0.000
0.660
1.060
0.716
Healthy tobacco
0.076
0.021
0.034
0.030
0.014
0.003
0.003
, http://www.100md.com 0.000
PBST-PVP
0.105
0.160
0.198
0.150
0.139
0.131
0.060
0.101
a2次实验平均值(Average value in two tests).
3 讨论
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CMV存在众多株系或分离物[14，15]，但是大量的研究表明这些株系或分离物可根据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白的肽链图谱分析、dsRNA分析、核酸杂交、RT-PCR产物的限制酶分析以及核酸序列分析等区分为两个性质不同的亚组[1，16]。根据侵染西番莲属植物的5个CMV分离物在心叶烟等4个鉴别寄主的症状和血清学关系，可将其区分为两个类群，第1类群(包括分离物PE、PE2、PC和PF)属CMV亚组I；第2类群(包括分离物PEf)属CMV亚组II。
CMV侵染西番莲在国内外均有报道[2～6]，但是，对其性质未作系统深入的研究。本研究初步明确了我国侵染西番莲属植物CMV的特性，并将它们鉴定区分为两个亚组。这一结果可为进一步研究我国西番莲病毒病的防治提供参考。
致谢 法国国家科学研究中心M.H.V.Van Regenmortel博士和美国农业部徐惠迪博士赠送CMV单克隆抗体，特此致谢!
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* 福建省自然科学基金资助项目(C95059)
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收稿日期1998-01-21修回日期：1998-05-11, http://www.100md.com