鲍温氏病组织人乳头瘤病毒16型结构基因L1的克隆及其序列分析
作者：王立良 宋国兴 陈莲凤 司静懿 刘世德
单位：王立良(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；宋国兴(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；陈莲凤(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；司静懿(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；刘世德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)
关键词：鲍温氏病；HPV16 L1克隆；序列变异
基础医学与临床000205
摘要：本研究采用PCR法从中国妇女鲍温氏病(Bowen's disease)组织标本扩增获得了与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒16型(HPV16)的晚期基因L1，并装入测序载体测序分析了其DNA的序列，与标准型进行了比较，发现有若干变异。此研究对序列及变异意义进行了分析和讨论，为今后L1基因分子流行病学调查、L1蛋白的结构与功能研究、疫苗研制以及HPV相关的基础性研究提供了有用的资料。同时在国内外首次报道了鲍温氏病组织中HPV16L1的序列及其变异情况，并在GenBank[1]申请到序列号(AF08952)。
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中图分类号：R373.1 文献标识码：A
文章编号：1001-6325 (2000)02-0017-05
Cloning of human papillomavirus type 16 L1 gene from Bowen's disease and its sequence analysis
Wang Li-liang， Song Guo-xing，Chen Lian-feng，et al
(Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005， China)
Abstract: To study the biological activity of the L1 gene of human papillomavirus 16(HPV16)， HPV16 L1 gene has been amplified from Bowen's disease of Chinese woman by PCR.The L1 DNA was sequenced and compared with the prototype L1 gene of HPV16.It was showed there are some differences between them.The sequence and significance of variation were analyzed and discussed.The research provides some useful data for epidemiology of HPV16 L1 gene、structure biology of L1 protein、vaccine research and relative basic research of HPV.This is the first report that is dealed with HPV16 L1 variants of Bowen's disease in home and abroad.GenBank accession number of the sequence in upper case in AF08952.
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Key words：Bowen's disease； HPV16 L1 cloning；sequence variation
人乳头瘤病毒( human papillomavirus，HPV)是一类广泛感染人类上皮组织的DNA病毒，可分为皮肤型和粘膜型两大组。而在粘膜组中有两大型：引起人类良性增殖性病变的低危型如HPV6/11等；与人类多种组织恶性肿瘤密切相关的高危型如HPV16、18、31、33、35、45、58等[2]。鲍温氏病是一种广泛的皮肤性疾病的统称，多介于良性病变与恶性病变之间，易于发生恶性病变；部分病例属原位癌。据报道鲍温氏病与多型HPV相关，其中与高危型HPV如16、31、33、35等型尤其与HPV16密切相关[3]。鲍温氏病的发病机制不详，但高危型HPV是其致病的重要原因。对鲍温氏病组织中HPV DNA的序列变异的研究将有助于揭开其发病机理。目前国际上对该病研究局限于临床研究，而对于其病毒病因研究较少，尤其是对鲍温氏病组织HPV的相关基因序列分析研究更是鲜有报道。据报道我国妇女宫颈癌中HPV16 DNA阳性率在80%以上[4] ； 因而对HPV16预防性疫苗的研制十分必要。由于HPV的外壳蛋白很保守而被作为候选疫苗，鉴于目前尚无体外培养的HPV的细胞系，因而L1成为制备HPV基因工程亚单位疫苗的候选基因。为此本文报道了采用PCR技术克隆中国人鲍温氏病组织中HPV16L1基因和研究该基因的序列特征的实验结果。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本的采集：HPV16 阳性的鲍温氏病组织标本由协和医院刘跃华医师提供，标本来自一年轻女性的外阴鲍温氏丘疹样病变(bowenoid papulosis)。保存于-20℃。
1.1.2 菌株与质粒：测序质粒pBluescriptII sk(+)(即pBSSK)和菌株DH5 a为本室保存。
1.1.3 试剂：BamH I、Bg1II、EcoR I、HindIII、T4连接酶购于协和友谊医学生物科技开发公司，高保真Taq酶、X-gal购于B.M公司，氨苄青霉素购于天象人生物工程公司。dNTP等为美国Promega公司产品。
1.1.4 引物设计与合成：根据载体多克隆酶切位点以及L1的序列，设计L1的一对引物，用以扩增L1基因内的从A5637T5638G5639至T7152A7153A7154(下标数字为相应碱基在HPV16 基因组的位置)的片段，在引物的5'端加入BglII酶切位点。并经DNASTAR、Primer 4.04等分子生物学软件包分析优化，由上海生工公司合成。引物如下：(框中为Bgl II酶切位点)
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L1 中间测序引物(P3)5'-GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC AAT G-3' 。这是根据第一次测序结果设计的引物。
1.2 方法
1.2.1 组织DNA的提取：组织标本加适量抽提缓冲液(10mmol/L Tris.Cl，pH8.0，0.1mol/L EDTA，pH8.0， 20mg/mL RNA酶，0.5% SDS)，充分研磨裂解后，加蛋白酶K至终浓度100mg/mL，充分混匀，50℃水浴3h，加入等体积酚，充分混匀10min，于室温5 000r/min，离心15min，上清移于另一50mL离心管，等体积酚再抽提两次，上清中加入冰冷两倍体积无水乙醇，充分混匀，DNA立即形成沉淀，将沉淀挑入1.5mL Eppendorf管中，70%乙醇洗两次，空气干燥后，溶于适量的TE(pH8.0)或去离子水中，测OD260和OD280两者比值大于1.8，贮存于4℃备用。
, 百拇医药 1.2.2 聚合酶链反应(PCR)：用从鲍温氏病组织标本中提取的组织DNA作为模板，按高保真PCR体系(Taq酶试剂说明书方法)进行PCR扩增L1基因，产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.3 PCR扩增片段的酶切初步鉴定：分别取10mL PCR扩增产物，在20mL 反应体系中，经BamH I、EcoR I酶切鉴定。
1.2.4 PCR扩增片段的克隆与鉴定：L1 PCR产物经Bgl 酶切后，按常规方法克隆于pBluescript sk(+)的BamH I位点，转化DH5a 菌株，质粒DNA的提取用碱裂解法。根据蓝白斑表型及经BamH I和Hind 双酶切分析筛选阳性克隆。
1.2.5 L1 DNA序列测定：提取质粒DNA，使用pBluescript sk(+)载体的共有引物，按DNA测序试剂盒说明，采用双脱氧末端终止法，并在DNA序列自动分析仪上测序。继而以P3为引物测序。
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2 结果
2.1 HPV16L1基因的扩增
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在1518bp 处出现特异扩增带(图1)。
2.2 HPV16 L1基因扩增产物的初步鉴定
PCR扩增产物，在20mL反应体系中，①BamH I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见1.0kb、500bp两条片段；②经EcoR I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见1.2kb、300bp两条片段，与原设计结果相符。因而初步鉴定扩增产物为目的基因片段(图2)。
2.3 HPV16 L1基因的克隆与鉴定
将L1 PCR产物克隆入pBluescriptIIsk(+)， 经BamH I和HindIII双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，在1.0kb处可见一条带，从而筛选出正向阳性克隆。而反向阳性克隆在500bp处可见一条带(图3)。
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2.4 L1 DNA序列测定结果
应用测序载体中的共有引物(T7、T3启动子引物)及P3引物进行测序，结果见图4。
2.5 DNA序列的变异图表分析
本研究获得的HPV16L1基因序列与最早发表的HPV16 原型L1①基因相比[5]，发现全长编码区内有若干处核苷酸发生突变。具体变异情况见表1。
3 讨论
HPV16的感染与宫颈癌、鲍温氏病等恶性疾病的发生关系密切[3，4]，由病毒感染导致宫颈癌、鲍温氏病发生的分子机制尚不完全清楚。天然HPV 16 L1的表达通常是在终端分化的角质化上皮组织的基底层细胞中，这大大限制了对L1蛋白分子的生物学研究以及对天然HPV16生活史及其疫苗的研究。因此通过基因工程方法对HPV16 L1 的生物学特性进行广泛深入研究十分必要。据报道HPV16在鲍温氏病中呈游离和整合于人染色体两种存在方式[6]。一般良性状态的病变组织HPV DNA是游离存在的，而整合状态的HPVDNA限于恶性病变或癌前病变组织。
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本研究从中国妇女鲍温氏病标本中克隆到HPV16 L1基因，经测序后在GenBank进行同源比较，并向GenBank申请得到序列号(AF08952)。通过DNASTAR、Bluegene等软件包分析，发现此例标本HPV16 L1基因与原型L1序列[5]基本一致，仅有几处不同，详见表1。其中604位C604AT突变为G604AT(His202突变为Asp202)，很多L1变异体的604位为G，这表明：①该位点是恒定突变；②该突变对L1蛋白行使功能是必需的。有四处为同义突变，具体情况见表1；与原型HPV16L1相比，本文L1基因在1264～1266(基因组内的位置为6901～6903)位多出了三核苷酸CAT，而在1312处少了三核苷酸GAT；但与Parton A[7]发表的HPV16 L1的序列以及与很多后来发表的L1序列[1](GenBank同源比较，因篇幅所限，不能将分析过程列出)相比，此区域的序列与他们完全一致。也有人认为对原型在此处的结构报道有误[7]。因此作者认为在1264～1312区段，克隆到L1基因对于原型来说可能是变异，也可能是对原型报道的校正、补充。本研究所获HPV16 L1基因编码202位氨基酸的密码子G604AT编码Asp(原型HPV16L1基因编码202位氨基酸的密码子C604AT编码His)；而Asp202是公认的HPV16 L1蛋白单体高效组装病毒外壳的一个必要条件[8，9]，所以从序列变异情况初步分析表明该例L1基因可以作为预防性疫苗的侯选基因。鲍温氏病组织中HPV16 DNA的序列研究很少，仅有调控区671bp片段序列[1，10]的报道。作为主要壳蛋白基因，L1的变异意义重大；变异的一个可能机制是，在HPV16处于游离状态时其L1基因编码Asp202，而整合型HPV 16L1基因编码His202；这一变化导致L1蛋白组装能力大大下降、L1蛋白的免疫原性丧失，结果在宫颈癌等恶性病变组织中鲜有L1蛋白的表达以及病毒颗粒的形成。研究HPV16 L1的序列变异对其生活史[9]、进化、致癌机理以及防治疫苗的研制均有重要的参考价值和理论依据。
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表1 鲍温氏病组织标本HPV16 L1基因序列的变异分析
Table 1 Mutation analysis of HPV16 L1 gene sequence in Bowen's disease specimen Mutation number
Corresponding position in HPV 16 genome of the mutated sites
Corresponding position in Ligene sepquence of the mutated sites
correspondign code of the mutated sites in teh prototype Lisequence
Correspondign code of th emutated sites in L1 variant from Bowen's disease
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Encoded amino acids of mutation codes (protoype on the left of arrow and Bowen's right)
mutation1
6240
604
C604AT
G604AT
H202→D202
mutation2
6432
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796
A796CT
G796CT
Thr266→Ala266
mutation3
6582
946
G946CA
A946CA
Ala=→Thr316
, http://www.100md.com mutation4
6629
993
GTT993
GTA993
Val331(synonymy mutation)
mutation5
6665
1029
TCA1029
TCT1029
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Ser343(synonymy mutation)
mutation6
6824
1188
TCC1188
TCT1188
Ser396(synonymy mutation)
mutation7
6901～6903
1265～1267
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-
ACC1264
+C1265AT①
ACA1264
Thr422(synonymy mutation)
C1265AT
-
+TCC1266
+Ser423(insertion mutation)
mutation8
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6951～6593
1315～1317
+G1315AT
-GAT
-Asp439(deletion mutation)
本研究获得L1基因并测序，结果丰富了HPV16 L1基因变异研究的资料；并为检测HPV16相关病变组织中L1基因的存在状况，L1基因的变异情况及HPV16预防性疫苗的研究以及分子流行病学研究提供了条件。在该基因序列变异情况的分析基础上，对HPV16 L1蛋白的生物学特性、结构与功能，有待于进一步研究。
图1 HPV16 L1基因的PCR产物
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Fig 1 The electrophoresis of HPV16 L1 PCR product
1.pBR322/Hinfl 2. PCR product 3.control
图2 HPV16 L1基因的PCR产物酶切鉴定
Fig 2 Primary ldentification of HPV16 L1 PCR product
1.pBR322/Hinfl 2.PCR product
3. BamH Ⅰ cleaved product 4.Hindcleaved products
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图3 pBSSK/L1 克隆的双酶切鉴定
Fig 3 Identification the direction of pBSSK/L1
1.pBR322/Hinfl 2.BamH I/Hind products(normal
direction) 3. BamH I/Hind products (reverse direction)
图4 HPV16L1基因序列
Fig 4 Sequence of HPV16L1 gene
GenBank accession number of the sequence in upper case in AF08952.
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1264-1312区段的分析
基金项目：国家自然科学基金(批准号：39780011)资助
[1]Benson DA，Boguski MS，Lipman DJ， et al.GenBank[J].Nucleic Acids Res，1998，26(1)：1-7.
[2]Zur Hausen H.human papillomavirus in the pathogenesis of anogenital[J].Cancer，1991，184：9-13.
[3]Ikenberg H，Gissmann L，Gross G，et al.Human papillomavirus type-16-related DNA in genital Bowen's disease and in Bowenoid papulosis[J].Int J Cancer ，1983，32(5)：563-565.
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[4]Si JY，Song GX，Lee K，et al.A research for the relationship between human papillomavirus and human uterine cervical carcinoma.I.The identification of viral genome and subgenomic sequences in biopsis of Chinese patients[J].J Cancer Res Clin Oncol，1991，117：454-458.
[5]Seedorf K，Krammer G，Durst M，et al.Human papillomavirus type 16 DNA sequence[J].Virology，1985，145，181-185.
[6]Bergeron C，Naghashfar Z，Canaan C，et al.Human papillomavirus type 16 in intraepithelial neoplasia (bowenoid papulosis)and coexistent invasive carcinoma of the vulva[J].Int J Gynecol Pathol，1987，6(1)：1-11.
, 百拇医药
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[9]王立良，宋国兴.人乳头瘤病毒外壳蛋白研究进展[J].国外医学分子生物学分册，1998，20(3)：137-140.
[10]Fang BS.Guedes AC，Munoz LC， et al.Human papillomavirus type 16 variants isolated from vulvar Bowenoid papulosis[J].J Med Virol，1993，41(1)：49-54.
收稿日期：1998-10-30；修订日期：1999-05-11, 百拇医药
单位：王立良(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；宋国兴(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；陈莲凤(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；司静懿(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)；刘世德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所，北京100005)
关键词：鲍温氏病；HPV16 L1克隆；序列变异
基础医学与临床000205
摘要：本研究采用PCR法从中国妇女鲍温氏病(Bowen's disease)组织标本扩增获得了与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒16型(HPV16)的晚期基因L1，并装入测序载体测序分析了其DNA的序列，与标准型进行了比较，发现有若干变异。此研究对序列及变异意义进行了分析和讨论，为今后L1基因分子流行病学调查、L1蛋白的结构与功能研究、疫苗研制以及HPV相关的基础性研究提供了有用的资料。同时在国内外首次报道了鲍温氏病组织中HPV16L1的序列及其变异情况，并在GenBank[1]申请到序列号(AF08952)。
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中图分类号：R373.1 文献标识码：A
文章编号：1001-6325 (2000)02-0017-05
Cloning of human papillomavirus type 16 L1 gene from Bowen's disease and its sequence analysis
Wang Li-liang， Song Guo-xing，Chen Lian-feng，et al
(Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005， China)
Abstract: To study the biological activity of the L1 gene of human papillomavirus 16(HPV16)， HPV16 L1 gene has been amplified from Bowen's disease of Chinese woman by PCR.The L1 DNA was sequenced and compared with the prototype L1 gene of HPV16.It was showed there are some differences between them.The sequence and significance of variation were analyzed and discussed.The research provides some useful data for epidemiology of HPV16 L1 gene、structure biology of L1 protein、vaccine research and relative basic research of HPV.This is the first report that is dealed with HPV16 L1 variants of Bowen's disease in home and abroad.GenBank accession number of the sequence in upper case in AF08952.
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Key words：Bowen's disease； HPV16 L1 cloning；sequence variation
人乳头瘤病毒( human papillomavirus，HPV)是一类广泛感染人类上皮组织的DNA病毒，可分为皮肤型和粘膜型两大组。而在粘膜组中有两大型：引起人类良性增殖性病变的低危型如HPV6/11等；与人类多种组织恶性肿瘤密切相关的高危型如HPV16、18、31、33、35、45、58等[2]。鲍温氏病是一种广泛的皮肤性疾病的统称，多介于良性病变与恶性病变之间，易于发生恶性病变；部分病例属原位癌。据报道鲍温氏病与多型HPV相关，其中与高危型HPV如16、31、33、35等型尤其与HPV16密切相关[3]。鲍温氏病的发病机制不详，但高危型HPV是其致病的重要原因。对鲍温氏病组织中HPV DNA的序列变异的研究将有助于揭开其发病机理。目前国际上对该病研究局限于临床研究，而对于其病毒病因研究较少，尤其是对鲍温氏病组织HPV的相关基因序列分析研究更是鲜有报道。据报道我国妇女宫颈癌中HPV16 DNA阳性率在80%以上[4] ； 因而对HPV16预防性疫苗的研制十分必要。由于HPV的外壳蛋白很保守而被作为候选疫苗，鉴于目前尚无体外培养的HPV的细胞系，因而L1成为制备HPV基因工程亚单位疫苗的候选基因。为此本文报道了采用PCR技术克隆中国人鲍温氏病组织中HPV16L1基因和研究该基因的序列特征的实验结果。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本的采集：HPV16 阳性的鲍温氏病组织标本由协和医院刘跃华医师提供，标本来自一年轻女性的外阴鲍温氏丘疹样病变(bowenoid papulosis)。保存于-20℃。
1.1.2 菌株与质粒：测序质粒pBluescriptII sk(+)(即pBSSK)和菌株DH5 a为本室保存。
1.1.3 试剂：BamH I、Bg1II、EcoR I、HindIII、T4连接酶购于协和友谊医学生物科技开发公司，高保真Taq酶、X-gal购于B.M公司，氨苄青霉素购于天象人生物工程公司。dNTP等为美国Promega公司产品。
1.1.4 引物设计与合成：根据载体多克隆酶切位点以及L1的序列，设计L1的一对引物，用以扩增L1基因内的从A5637T5638G5639至T7152A7153A7154(下标数字为相应碱基在HPV16 基因组的位置)的片段，在引物的5'端加入BglII酶切位点。并经DNASTAR、Primer 4.04等分子生物学软件包分析优化，由上海生工公司合成。引物如下：(框中为Bgl II酶切位点)
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L1 中间测序引物(P3)5'-GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC AAT G-3' 。这是根据第一次测序结果设计的引物。
1.2 方法
1.2.1 组织DNA的提取：组织标本加适量抽提缓冲液(10mmol/L Tris.Cl，pH8.0，0.1mol/L EDTA，pH8.0， 20mg/mL RNA酶，0.5% SDS)，充分研磨裂解后，加蛋白酶K至终浓度100mg/mL，充分混匀，50℃水浴3h，加入等体积酚，充分混匀10min，于室温5 000r/min，离心15min，上清移于另一50mL离心管，等体积酚再抽提两次，上清中加入冰冷两倍体积无水乙醇，充分混匀，DNA立即形成沉淀，将沉淀挑入1.5mL Eppendorf管中，70%乙醇洗两次，空气干燥后，溶于适量的TE(pH8.0)或去离子水中，测OD260和OD280两者比值大于1.8，贮存于4℃备用。
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1.2.3 PCR扩增片段的酶切初步鉴定：分别取10mL PCR扩增产物，在20mL 反应体系中，经BamH I、EcoR I酶切鉴定。
1.2.4 PCR扩增片段的克隆与鉴定：L1 PCR产物经Bgl 酶切后，按常规方法克隆于pBluescript sk(+)的BamH I位点，转化DH5a 菌株，质粒DNA的提取用碱裂解法。根据蓝白斑表型及经BamH I和Hind 双酶切分析筛选阳性克隆。
1.2.5 L1 DNA序列测定：提取质粒DNA，使用pBluescript sk(+)载体的共有引物，按DNA测序试剂盒说明，采用双脱氧末端终止法，并在DNA序列自动分析仪上测序。继而以P3为引物测序。
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2 结果
2.1 HPV16L1基因的扩增
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在1518bp 处出现特异扩增带(图1)。
2.2 HPV16 L1基因扩增产物的初步鉴定
PCR扩增产物，在20mL反应体系中，①BamH I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见1.0kb、500bp两条片段；②经EcoR I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见1.2kb、300bp两条片段，与原设计结果相符。因而初步鉴定扩增产物为目的基因片段(图2)。
2.3 HPV16 L1基因的克隆与鉴定
将L1 PCR产物克隆入pBluescriptIIsk(+)， 经BamH I和HindIII双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，在1.0kb处可见一条带，从而筛选出正向阳性克隆。而反向阳性克隆在500bp处可见一条带(图3)。
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2.4 L1 DNA序列测定结果
应用测序载体中的共有引物(T7、T3启动子引物)及P3引物进行测序，结果见图4。
2.5 DNA序列的变异图表分析
本研究获得的HPV16L1基因序列与最早发表的HPV16 原型L1①基因相比[5]，发现全长编码区内有若干处核苷酸发生突变。具体变异情况见表1。
3 讨论
HPV16的感染与宫颈癌、鲍温氏病等恶性疾病的发生关系密切[3，4]，由病毒感染导致宫颈癌、鲍温氏病发生的分子机制尚不完全清楚。天然HPV 16 L1的表达通常是在终端分化的角质化上皮组织的基底层细胞中，这大大限制了对L1蛋白分子的生物学研究以及对天然HPV16生活史及其疫苗的研究。因此通过基因工程方法对HPV16 L1 的生物学特性进行广泛深入研究十分必要。据报道HPV16在鲍温氏病中呈游离和整合于人染色体两种存在方式[6]。一般良性状态的病变组织HPV DNA是游离存在的，而整合状态的HPVDNA限于恶性病变或癌前病变组织。
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本研究从中国妇女鲍温氏病标本中克隆到HPV16 L1基因，经测序后在GenBank进行同源比较，并向GenBank申请得到序列号(AF08952)。通过DNASTAR、Bluegene等软件包分析，发现此例标本HPV16 L1基因与原型L1序列[5]基本一致，仅有几处不同，详见表1。其中604位C604AT突变为G604AT(His202突变为Asp202)，很多L1变异体的604位为G，这表明：①该位点是恒定突变；②该突变对L1蛋白行使功能是必需的。有四处为同义突变，具体情况见表1；与原型HPV16L1相比，本文L1基因在1264～1266(基因组内的位置为6901～6903)位多出了三核苷酸CAT，而在1312处少了三核苷酸GAT；但与Parton A[7]发表的HPV16 L1的序列以及与很多后来发表的L1序列[1](GenBank同源比较，因篇幅所限，不能将分析过程列出)相比，此区域的序列与他们完全一致。也有人认为对原型在此处的结构报道有误[7]。因此作者认为在1264～1312区段，克隆到L1基因对于原型来说可能是变异，也可能是对原型报道的校正、补充。本研究所获HPV16 L1基因编码202位氨基酸的密码子G604AT编码Asp(原型HPV16L1基因编码202位氨基酸的密码子C604AT编码His)；而Asp202是公认的HPV16 L1蛋白单体高效组装病毒外壳的一个必要条件[8，9]，所以从序列变异情况初步分析表明该例L1基因可以作为预防性疫苗的侯选基因。鲍温氏病组织中HPV16 DNA的序列研究很少，仅有调控区671bp片段序列[1，10]的报道。作为主要壳蛋白基因，L1的变异意义重大；变异的一个可能机制是，在HPV16处于游离状态时其L1基因编码Asp202，而整合型HPV 16L1基因编码His202；这一变化导致L1蛋白组装能力大大下降、L1蛋白的免疫原性丧失，结果在宫颈癌等恶性病变组织中鲜有L1蛋白的表达以及病毒颗粒的形成。研究HPV16 L1的序列变异对其生活史[9]、进化、致癌机理以及防治疫苗的研制均有重要的参考价值和理论依据。
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表1 鲍温氏病组织标本HPV16 L1基因序列的变异分析
Table 1 Mutation analysis of HPV16 L1 gene sequence in Bowen's disease specimen Mutation number
Corresponding position in HPV 16 genome of the mutated sites
Corresponding position in Ligene sepquence of the mutated sites
correspondign code of the mutated sites in teh prototype Lisequence
Correspondign code of th emutated sites in L1 variant from Bowen's disease
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Encoded amino acids of mutation codes (protoype on the left of arrow and Bowen's right)
mutation1
6240
604
C604AT
G604AT
H202→D202
mutation2
6432
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796
A796CT
G796CT
Thr266→Ala266
mutation3
6582
946
G946CA
A946CA
Ala=→Thr316
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6629
993
GTT993
GTA993
Val331(synonymy mutation)
mutation5
6665
1029
TCA1029
TCT1029
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Ser343(synonymy mutation)
mutation6
6824
1188
TCC1188
TCT1188
Ser396(synonymy mutation)
mutation7
6901～6903
1265～1267
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-
ACC1264
+C1265AT①
ACA1264
Thr422(synonymy mutation)
C1265AT
-
+TCC1266
+Ser423(insertion mutation)
mutation8
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6951～6593
1315～1317
+G1315AT
-GAT
-Asp439(deletion mutation)
本研究获得L1基因并测序，结果丰富了HPV16 L1基因变异研究的资料；并为检测HPV16相关病变组织中L1基因的存在状况，L1基因的变异情况及HPV16预防性疫苗的研究以及分子流行病学研究提供了条件。在该基因序列变异情况的分析基础上，对HPV16 L1蛋白的生物学特性、结构与功能，有待于进一步研究。
图1 HPV16 L1基因的PCR产物
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Fig 1 The electrophoresis of HPV16 L1 PCR product
1.pBR322/Hinfl 2. PCR product 3.control
图2 HPV16 L1基因的PCR产物酶切鉴定
Fig 2 Primary ldentification of HPV16 L1 PCR product
1.pBR322/Hinfl 2.PCR product
3. BamH Ⅰ cleaved product 4.Hindcleaved products
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图3 pBSSK/L1 克隆的双酶切鉴定
Fig 3 Identification the direction of pBSSK/L1
1.pBR322/Hinfl 2.BamH I/Hind products(normal
direction) 3. BamH I/Hind products (reverse direction)
图4 HPV16L1基因序列
Fig 4 Sequence of HPV16L1 gene
GenBank accession number of the sequence in upper case in AF08952.
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1264-1312区段的分析
基金项目：国家自然科学基金(批准号：39780011)资助
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收稿日期：1998-10-30；修订日期：1999-05-11, 百拇医药