多重耐药性伤寒杆菌的耐药机理研究
作者：刘陈谊 王宇倩 朱德妹 汪复 张灵
单位：(上海医科大学华山医院抗生素研究所，200040)刘陈谊 王宇倩 朱德妹 汪复；(现在上海市第一人民医院内科)张灵
关键词：伤寒沙门菌；药物耐受性；质粒；β-内酰胺酶类
中华医学杂志910605
摘要 对上海市青浦地区多重耐药性伤寒杆菌的耐药机理初步研究结果，表明多重耐药性由一个分子量约98Md的大分子质粒介导，该质粒可通过接合，完整地转移到大肠杆菌受体中，耐药性也随之转移。该菌对β内酰胺类抗生素的耐药机理可能是产生β内酰胺酶。M1型菌与多重耐药性密切相关。
自1972年耐氯霉素的伤寒杆菌在墨西哥引起大流行后[1]，国内、外陆续报告了多次耐药性伤寒的流行，这些伤寒杆菌不但对氯霉素耐药，同时还对其它多种抗菌药物耐药，给伤寒的防治工作带来一定困难。1987年下半年起，上海市青浦县发生耐药性伤寒的流行，为了掌握该地区伤寒杆菌的耐药状况、了解其耐药机理，为制订有效的防治措施提供依据，我们收集了部分菌株进行耐药机理的研究。
材料和方法
1、菌株来源：1988年11月至1989年6月在上海市青浦县收集到伤寒杆菌142株，均为发热期患者的血培养中得到，经血清学鉴定为伤寒杆菌。接合转移试验和质粒分析部分多重耐药株为1987年在青浦收集得到。
2、药敏试验：用琼脂双倍稀释法测定14种常用抗菌药物对142株伤寒杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。以大肠杆菌ATCC25922为质控菌，药物的临界浓度参考NCCLS标准[2]。
3、β内酰胺酶检测：用头孢硝噻吩纸片(BBL Microbiology Systems)法检测1988～1989年142株伤寒杆菌的产酶特性。
4、接合转移试验：供体菌为60株伤寒杆菌，其中22株为1988～1989年142株中的多重耐药株，另38株为1987年收集的多重耐药株。它们对氯霉素、氨苄青霉素、复方新诺明(磺胺甲基异恶唑SMZ，增效剂TMP)、庆大霉素、四环素、哌拉西林和头孢唑啉等7种药物均耐药，其MIC均≥128mg/L，对利福平则均敏感。
受体菌为E.coliK12，乳糖发酵阳性，对各种抗菌药物均极敏感，但链霉素和利福平的MIC均在128mg/L以上。
接合转移试验采用Grinsted[3]液体接合法。在选择性平板(麦康凯培养基，含利福平100mg/L怀氯霉素50mg/L或氨苄青霉素50mg/L或复方新诺明200：10mg/L联合)上接合子长成红色菌落，经划线分离后进行药敏试验确定耐药类型，并计算接合转移频率，即接合子菌落计数与供体菌菌落计数的比值。
5、质粒分析：对100株七重耐药伤寒杆菌和45株不同耐药谱的接合子做了质粒分析。质粒DNA抽提采用Kado-Liu法[4]，然后进行琼脂糖电泳，EB染色，紫外灯下拍照。用4株带有标准分子量的质粒菌进行平行电泳，其分子量分别为143.7Md、77.6Md、64Md和40Md，计算伤寒杆菌及其接合子的质粒分子量大小。
6、噬菌体分型：用96型伤寒沙门氏菌Vi-II噬体进行分型，该工作由上海市卫生防疫站进行。
结 果
1、药物敏感试验：142株伤寒杆菌的药物敏感结果见表1。本次收集的伤寒杆菌对氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明的耐药率相对较高，约20～30%，而对头孢他啶、头孢三嗪等第三代头孢菌素和较新的氟喹诺酮类抗菌药物敏感率极高。上述结果与本所1979年前和1987年对同一地区细菌测定的结果相比：1979年以前的伤寒杆菌耐药株极少见：1987年伤寒流行期中大部分是多重耐药株，对氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明约80%耐药；而1988～1989年耐药株又明显减少，142株伤寒杆菌中敏感株又上升到70～80%，但仍低于1979年以前的水平(97～100%)。
本次收集的142株中22株为多重耐药株，对氯霉素、氨苄青霉素、复方新诺明、庆大霉素、四环素、哌拉西林和头孢唑啉均呈耐药，且耐药水平较高：太大霉素的MIC为16mg/L，另6种药物的MIC均大于128mg/L(SMZ/TMP大于200/10mg/L)，与1987年的耐药株相同。
2、β内酰胺酶检测：1988～1989年142株伤寒杆菌中22株7重耐药菌均为产酶株，其余均不产酶。
3、接合转移试验：60株供体伤寒杆菌耐药质粒的可转移率为100%，平均接合转移频率2.51×10-7。3种不同药物选择平板上的接合转移频率差异无显著意义(P>0.05)。
对237株接合子进行了药敏测定，它们的供体是20株七重耐药伤寒杆菌，结果发现有7种不同耐药谱的接合子，分别为ACCzGPSxT、ACCzGPSx、ACzGPSxT、ACzPT、CGSx、GSxT和GSx(A-氨苄青霉素，C-氯霉素，Cz-头孢唑啉，G-庆大霉素，P-哌拉西林，Sx-复方新诺明，T-四环素，下同)。绝大多数接合子(92.0%)全部获得供体菌的7种耐药性，从不同药物选择平板上所得接合子的耐药类型往往相同，这说明多种耐药基因可能存在于同一质粒上。
4、质粒分析：100株七重耐药伤寒杆菌质粒电泳图谱显示它们均带有一条相同的大分子质粒带，分子量约98Md(图1)。而同期收集的伤寒杆菌敏感株均不带有任何质粒带，说明伤寒杆菌的七重耐药性与这一大分子质粒带有关。对26株七重耐药谱接合子和19株其它耐药谱接合子的质粒分析表明，它们都获得了与供体菌相同的大分子质粒带，分子量约98Md，不同耐药谱接合子的质粒电泳图谱相同(图2)。
5、噬菌体分型：142株伤寒杆菌可分为17种噬菌体型(表2)。其中最多的是M1型，共40株(占28.2%)。22株七重耐药菌全部是M1型，其它型中无多重耐药菌。
表1 青浦县不同时期的伤寒杆菌对常用抗菌药的敏感性 抗菌药物临界浓度
1988～1989(n=142)
1987(n=143)
1979(n=39)
MIC90(mg/L)
敏感率(%)
MIC90(mg/L)
敏感率(%)
MIC90(mg/L)
敏感率(%)
氯霉素
8
>128
79.6
>128
21.4
4
100
复方新诺明
67.6
20.0
97.4
SMZ
25
>200
>200
25
TMP
1.25
>10
>10
1.25
氨苄青霉素
8
>128
83.8
>128
21.4
0.25
100
哌拉西林
16
>128
84.5
>128
22.9
1
100
庆大霉素
4
8
67.6
8
20.0
0.5
97.4
阿米卡星
8
1
100
2
98.6
1
97.4
磷霉素
32
32
98.6
>128
72.9
4
97.4
头孢唑啉
8
>128
84.5
—
—
—
—
头孢呋新
8
8
99.3
16
41.4
2
97.4
头孢他啶
8
0.5
100
—
—
—
—
头孢三嗪
8
0.125
100
0.125
100
≤0.06
100
氟哌酸
2
1
97.9
0.25
100
≤0.06
100
氟嗪酸
2
0.25
100
≤0.06
100
≤0.06
100
氟啶酸
2
0.25
100
—
—
—
—
注：n为伤寒杆菌株数表2 142株伤寒杆菌噬菌体分型结果 噬菌体型
株数
百分比(%)
M1
40
28.2
A
22
15.5
E1
22
15.5
D2
18
12.7
B2
9
6.4
K1
7
4.9
M2
4
2.8
D1
3
2.1
D36
3
2.1
D46
3
2.1
E9，B1
1
0.7
C7，F4
1
0.7
F5，J2
1
0.7
不能分型
5
3.5
1.S. typhi 1 (ACCzGPSxT)
2.S. typhi 31(ACCzGPSxT)
3.S. typhi 60(ACCzGPSxT)
4.S. typhi 121(ACCzGPSxT)
5.28 R-823,分子量143.7 Md
6.40 R-448,分子量77.6Md
7.40 R-268,分子量64Md
40 R-626,分子量40Md
8.1987年S.typhi5(ACCzGPSxT)
9.1987年S.typhi15(ACCzGPSxT)
10.1987年S.typhi25(ACCzGPSxT)
11.1987年S.typhi35(ACCzGPSxT)
图1 七重耐药伤寒杆菌质粒图谱
1.S.typhi 98(ACCzGPSxT)
2.C 219 (S.typhi 107×K12,ACCzGPSx)
3.C 223 (S.typhi 122×K12,ACzGPSxT)
4.C 224 (S.typhi 36×K12,ACzPT)
5.28 R-823,分子量143.7 Md
6.40 R-448,分子量77.6Md
7.40 R-268,分子量64Md
40 R-626,分子量40Md
8.C 225 (S.typhi 98×K12,CGSx)
9.C 230 (S.typhi 98×K12,GSxT)
10.C 237 (S.typhi 83×K12,GSx)
11.受体 E.Coli K12
图2 供、受体及接合子质粒图谱
讨 论
70年代以来，耐药伤寒的流行不断增多，在国内遍及十几个省市和地区，尤以1983～1987年间为甚[5，6]。于1988年11月至1989年6我们在青浦收集的142株伤寒杆菌，对常用的氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明的敏感率约70～80%，高于1987年流行期菌株敏感率，但仍低于1979年以前非流行期菌株的水平，表明这些细菌代表了1987年该地区耐药菌株流行的余波，其中小部分是耐药株，大部分是敏感株。22株多重耐药株除对上述三种药物耐药外，还对哌拉西林、头孢唑啉、庆大霉素和四环素等耐药。经测定它们均能产生β内酰胺酶，提示其对氨苄青霉素、哌拉西林和头孢唑啉的耐药机理可能与之有关。本实验还证实多重耐药性伤寒杆菌都带有一个约98Md的大分子质粒带，而敏感菌则没有。该质粒带可以通过接合转移到受体菌E.coli K 12，对于抗菌药物的多重耐药性也随之转移。接合转移后，接合子表现出不同的耐药谱，但其质粒带仍相同，其原因可能是转移过程中质粒的某些耐药基因丢失，但与98Md的大分子量质粒相比，基因片段的分子量很小，几种耐药性还可能共处一个基因，因此常用的电泳方法难以区别。另一种可能是供体(伤寒杆菌)和受体(大肠杆菌)对质粒所带耐药基因的感受性不同，造成了接合后基因复制和翻译上的差异，致使某些耐药性得不到表达。如果用限制性内切酶将质粒DNA酶切后电泳，再进行分子序列分析，就可能更准确地定位基因。
伤寒杆菌的噬菌体分型方法在许多次流行病学调查和传染源追踪中行之有效。我们这次收集的142株伤寒杆菌中，M1型为数最多，尽管M1型不全是耐药株，但M1型菌与耐药性的关系最为密切，这与国内其它耐药伤寒流行区的报道相同[7，8]。随着对伤寒杆菌耐药质粒认识的不断深入，质粒分析的方法已逐渐用于流行病学研究[9，10]。由于耐药质粒的接合转移，在细菌感染的传播扩散中起主要作用的往往是流行的质粒，而不是细菌本身，这种情况在抗生素的选择压力下更为明显。因此，质粒分析方法不但可用于细菌感染的流行病学追踪和监测，而且可用于研究细菌耐药性的发生机理，即质粒的演变[11～13]。随着分子生物学的发展及其技术方法在临床上的不 断应用，对伤寒杆菌耐药质粒的分析研究将对耐药性伤寒的流行病学调查、传染源追踪及其防治发挥更大的指导作用。
本文中噬菌体分型工作承上海市卫生防疫站肠道科宦彭成、沈小婷等同志协助完成，伤寒杆菌系青浦传染病院及青浦人民医院协助收集，特志谢
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