斑点免疫结合试验直接检测末梢血甲胎蛋白的研究和应用*
作者：贺海平 唐东平
单位：广西肿瘤防治研究所 南宁 530021
关键词：斑点免疫结合试验；甲胎蛋白；肝癌
广西医科大学学报990103
摘要 目的：探讨建立一种方便使用、检测人末梢血甲胎蛋白(AFP)的方法。方法：用斑点免疫结合试验(DIBA)直接检测人末梢血(全血)AFP。结果：DIBA检测的条件在37℃或室温，孵育时间为10 min×2时，敏感度达25 μg/L。用此法和放射免疫法同时检测住院肝癌病人90例的末梢血和血清AFP，结果符合率为96.67%，以AFP 50 μg/L判为阴性，两结果的阳性符合率达100%。并用此法检测普查的正常人群1 200例，检出末梢血AFP浓度为50～100 μg/L有3例，与血清DIBA和RIA检测结果相符。结论：DIBA试剂盒检测人末梢血(全血)AFP，具有特异性强、敏感度高，与常规检测法有较好的符合性，而且具有简便、省料、快速、可直接检测末梢血(全血)等优点。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R730.45
THE STUDY AND APPLICATION OF DOT IMMUNOBINDING ASSAY
FOR DIRECT DETECTION OF ALPHA FETOPROTEIN IN FULL BLOOD
He Haiping,Tang Dongping(Department of Immunology,Guangxi Cancer
Institute，Nanning 530021)
Abstract Objective:To establish a simple method for detecting human alph fetoprotein (AFP) in full blood.Method:Establishing and using a dot immunobindin assay (DIBA) for direct detection of AFP in full blood.Results:The sensitivity of DIBA for the AFP was 25μg/L when the incubation was conducted in 37℃ or in room temperature and the incubation time was 10 minutes×2.When AFP concentrations of 90 full blood samples from patients with cancer were detected by the method and at the same time by radioimmunoassay,it was showed that the coincidence rate of the two methods was up to 96.67% and the coincidence rate in positive was 100% (when of AFP concentration of less than 50 μg/L was negative).The concentrations of three in 1 200 full blood samples were 50 to 100 μg/L and the other less than 50 μg/L when DIBA was adopted.The results were the same as those produced by RIA method.Conclusion:In detection of AFP in full blood ,DIBA shows its advantage of specificity,sensitivity and simplicity,and it is fast and economical,thus can be used widely in hospital labs and general survey for liver cancer.
, 百拇医药
Key words dot immunobinding assay；alpha fetoproten；PLC
原发性肝癌是发病率高发展迅速的癌症，由于症状隐匿，难以早期发现。如能早期发现，及时进行治疗，疗效甚佳。近年来的实验证明，早期发现肝癌病人，最重要的手段之一是靠人群普查和对慢性肝炎患者血清甲胎蛋白(AFP)的定期检测，但目前检测AFP的方法还仅能检测血清的AFP[1～3]，需要对受检人员行静脉采血，但静脉采血成本高，不利于人群的普查。而末梢血采集方便，成本低，人们能普遍接受，对早期发现病人有利。为此我们在成功地建立斑点免疫结合试验检测血清AFP的基础上[4]，开展了检测末梢血(全血)AFP的研究并进行了现场普查验证。
1 材料和方法
1.1斑点免疫结合试验试剂盒：本室制备。采用双抗体夹心法，即大鼠抗人AFP单抗(HRA802)包被于硝酸纤维素膜(NC)上，酶标抗体为大鼠抗人AFP单抗(HRA864)酶标记物(HRA864-HRP)，底物为DAB。
, 百拇医药
1.2 AFP参比浓度液：用AFP阳性血清混合或脐带血清，经RIA测定AFP含量，稀释，分装后，作为AFP参比浓度液，-20℃储存备用。
1.3 检测末梢血AFP方法：用钉书的打孔器将滤纸切成直径6 mm的圆形小纸片，用镊子夹住小纸片直接蘸取末梢血后，将小滤纸片紧贴到检测孔上，室温孵育10 min，夹去纸片，加酶标抗体，再孵育10 min，洗涤后加DAB底物液显色。
1.4 斑点免疫结合试验检测AFP敏感度试验：将已知不同AFP含量的参比液依次分别置于稀释板的孔中，再抽取AFP阴性(<12.5 μg/L)的正常人静脉血，迅速地定量加入各稀释板的AFP孔中，将AFP稀释成含量为12.5、25、50、100和200 μg/L浓度系列，迅速吹打混匀，在血液凝固前用镊子蘸取全血后，紧贴于加样孔上，设置37℃和20℃两组孵育温度，每组又分5、10和20 min 3种不同的孵育时间。孵育后，夹去纸片，加入酶标抗体孵育10 min，用洗涤液冲洗后，加DAB底物液显色。
, 百拇医药
1.5 临床检测验证：抽取90例肝癌病人静脉血用放射免疫测定法(RIA)检测AFP(由我所ECT室协作测定，试剂盒为中国同位素公司，北方免疫试剂研究所生产)。同时，刺取病人末梢血，按上述进行检测，比较两方法的检测结果。
1.6 人群普查验证：①普查对象：南宁市内某工厂职工1 200例；②方法：抽取静脉血后，迅速在注射针头上用镊子蘸取全血，紧贴于加样孔上，随后方法同上。血清同用DIBA法和酶联免疫法测定AFP(由我单位检验科协助测定)。比较各法检测结果。
2 结 果
2.1敏感度试验
2.1.1 用小滤纸片蘸取血清的加样法与直接吸取血清滴入的加样法比较检测的敏感度，直接吸取血清滴入法在加样后室温孵育5 min和加酶标抗体孵育5 min，其检测AFP的敏感度可达25 μg/L，而小滤纸片加样法，在孵育条件相同的情况下敏感度下降为50 μg/L，但延长孵育时间至10 min，敏感度即可达25 μg/L。
, 百拇医药
2.1.2 用小滤纸片全血法测定的结果显示，37℃或室温孵育，检测的敏感度无明显差别。当孵育时间为5 min时，敏感度为50 μg/L，如孵育时间增加到10 min敏感度相应增加到25 μg/L。
2.2 检测90例癌症病人末梢全血AFP(DIBA法)和血清AFP(RIA)的结果见表1。
与RIA法检测结果比较，DIBA法测定AFP浓度的符合率为96.67%，以AFP<50 μg/L判为阴性，两结果的阳性符合率达100%。
表1 末梢全血DIBA法、血清RIA法测定
90例癌症病人AFP结果比较(例) DIBA
(ρB/μg.L-1)
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RIA(ρB/μg.L-1)
合计
<50
50
100
200
400
<50
30
0
0
0
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30
50
0
6
0
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6
100
0
0
5
1
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1
7
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39
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合计
30
6
6
8
40
90
注：AFP的质量浓度为μg/L
2.3 末梢全血法DIBA普查1200例，检出AFP浓度50～100μg/L 3例，与血清DIBA和RIA结果相符。检出的3例AFP阳性者，2例为孕妇，1例最后确诊为小肝癌。
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3 讨 论
实验结果表明我们研制的斑点免疫结合试验试剂盒检测人末梢全血AFP，具有特异性强、敏感度高，与常规检测法有较好的符合性，而且具有简便、省料、快速、可直接检测末梢血(全血)等优点，适宜于基层医院和人群肝癌普查使用。
在实验过程中，发现作为载体的NC在整个检测过程中，必须保持湿润，否则全血干于NC上会影响实验结果，同时还需注意点样后的滤纸一定要紧贴于加样孔的膜上，一般小滤纸片约能吸取10～15 μl全血，在蘸取全血时尽可能使滤纸醮满血。在夹去加样的小滤纸片后，NC无需洗涤，即可加酶标抗体，不会影响检测结果，但用洗液洗涤1～2次效果更好。检测样品的溶血、红细胞及凝血对检测结果不影响。用小滤纸片取全血，与AFP或酶标抗体作用时间为10 min以上为适。
目前还没有直接检测末梢血(全血)抗原或抗体的较好的免疫学方法，国内外尚没有直接检测末梢血(全血)的AFP试剂盒。本试剂盒能很好地解决检测末梢血(全血)的问题，可满足多方面的要求，有助于人群的肝癌普查，早期诊断、早期发现病人和早期治疗肝癌，有较好的实用和推广价值。
, 百拇医药
*本项目为卫生厅资助课题
参考文献
1 曹锡坤.滴金免疫测定法在检测血清甲胎蛋白中的应用.上海免疫学杂志，1991，11(3)：154
2 刘 杲.抗人甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其应用.上海免疫学杂志，1986，6(6)：321
3 Micheel B,Fiebach H,Karsten D,et al.Monoclonal antibodies to different epitopes of human alpha-fetoprotein (AFP).Eur J Cancer Clin Oncol,1983,19(9):1 239
4 贺海平，唐东平，田春林，等.快速点免疫结合测定法检测血清甲胎蛋白及其临床应用.上海医学检验杂志，1994，9(3)：162
收稿日期：1997-09-22, 百拇医药
单位：广西肿瘤防治研究所 南宁 530021
关键词：斑点免疫结合试验；甲胎蛋白；肝癌
广西医科大学学报990103
摘要 目的：探讨建立一种方便使用、检测人末梢血甲胎蛋白(AFP)的方法。方法：用斑点免疫结合试验(DIBA)直接检测人末梢血(全血)AFP。结果：DIBA检测的条件在37℃或室温，孵育时间为10 min×2时，敏感度达25 μg/L。用此法和放射免疫法同时检测住院肝癌病人90例的末梢血和血清AFP，结果符合率为96.67%，以AFP 50 μg/L判为阴性，两结果的阳性符合率达100%。并用此法检测普查的正常人群1 200例，检出末梢血AFP浓度为50～100 μg/L有3例，与血清DIBA和RIA检测结果相符。结论：DIBA试剂盒检测人末梢血(全血)AFP，具有特异性强、敏感度高，与常规检测法有较好的符合性，而且具有简便、省料、快速、可直接检测末梢血(全血)等优点。
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中国图书资料分类法分类号 R730.45
THE STUDY AND APPLICATION OF DOT IMMUNOBINDING ASSAY
FOR DIRECT DETECTION OF ALPHA FETOPROTEIN IN FULL BLOOD
He Haiping,Tang Dongping(Department of Immunology,Guangxi Cancer
Institute，Nanning 530021)
Abstract Objective:To establish a simple method for detecting human alph fetoprotein (AFP) in full blood.Method:Establishing and using a dot immunobindin assay (DIBA) for direct detection of AFP in full blood.Results:The sensitivity of DIBA for the AFP was 25μg/L when the incubation was conducted in 37℃ or in room temperature and the incubation time was 10 minutes×2.When AFP concentrations of 90 full blood samples from patients with cancer were detected by the method and at the same time by radioimmunoassay,it was showed that the coincidence rate of the two methods was up to 96.67% and the coincidence rate in positive was 100% (when of AFP concentration of less than 50 μg/L was negative).The concentrations of three in 1 200 full blood samples were 50 to 100 μg/L and the other less than 50 μg/L when DIBA was adopted.The results were the same as those produced by RIA method.Conclusion:In detection of AFP in full blood ,DIBA shows its advantage of specificity,sensitivity and simplicity,and it is fast and economical,thus can be used widely in hospital labs and general survey for liver cancer.
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Key words dot immunobinding assay；alpha fetoproten；PLC
原发性肝癌是发病率高发展迅速的癌症，由于症状隐匿，难以早期发现。如能早期发现，及时进行治疗，疗效甚佳。近年来的实验证明，早期发现肝癌病人，最重要的手段之一是靠人群普查和对慢性肝炎患者血清甲胎蛋白(AFP)的定期检测，但目前检测AFP的方法还仅能检测血清的AFP[1～3]，需要对受检人员行静脉采血，但静脉采血成本高，不利于人群的普查。而末梢血采集方便，成本低，人们能普遍接受，对早期发现病人有利。为此我们在成功地建立斑点免疫结合试验检测血清AFP的基础上[4]，开展了检测末梢血(全血)AFP的研究并进行了现场普查验证。
1 材料和方法
1.1斑点免疫结合试验试剂盒：本室制备。采用双抗体夹心法，即大鼠抗人AFP单抗(HRA802)包被于硝酸纤维素膜(NC)上，酶标抗体为大鼠抗人AFP单抗(HRA864)酶标记物(HRA864-HRP)，底物为DAB。
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1.2 AFP参比浓度液：用AFP阳性血清混合或脐带血清，经RIA测定AFP含量，稀释，分装后，作为AFP参比浓度液，-20℃储存备用。
1.3 检测末梢血AFP方法：用钉书的打孔器将滤纸切成直径6 mm的圆形小纸片，用镊子夹住小纸片直接蘸取末梢血后，将小滤纸片紧贴到检测孔上，室温孵育10 min，夹去纸片，加酶标抗体，再孵育10 min，洗涤后加DAB底物液显色。
1.4 斑点免疫结合试验检测AFP敏感度试验：将已知不同AFP含量的参比液依次分别置于稀释板的孔中，再抽取AFP阴性(<12.5 μg/L)的正常人静脉血，迅速地定量加入各稀释板的AFP孔中，将AFP稀释成含量为12.5、25、50、100和200 μg/L浓度系列，迅速吹打混匀，在血液凝固前用镊子蘸取全血后，紧贴于加样孔上，设置37℃和20℃两组孵育温度，每组又分5、10和20 min 3种不同的孵育时间。孵育后，夹去纸片，加入酶标抗体孵育10 min，用洗涤液冲洗后，加DAB底物液显色。
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1.5 临床检测验证：抽取90例肝癌病人静脉血用放射免疫测定法(RIA)检测AFP(由我所ECT室协作测定，试剂盒为中国同位素公司，北方免疫试剂研究所生产)。同时，刺取病人末梢血，按上述进行检测，比较两方法的检测结果。
1.6 人群普查验证：①普查对象：南宁市内某工厂职工1 200例；②方法：抽取静脉血后，迅速在注射针头上用镊子蘸取全血，紧贴于加样孔上，随后方法同上。血清同用DIBA法和酶联免疫法测定AFP(由我单位检验科协助测定)。比较各法检测结果。
2 结 果
2.1敏感度试验
2.1.1 用小滤纸片蘸取血清的加样法与直接吸取血清滴入的加样法比较检测的敏感度，直接吸取血清滴入法在加样后室温孵育5 min和加酶标抗体孵育5 min，其检测AFP的敏感度可达25 μg/L，而小滤纸片加样法，在孵育条件相同的情况下敏感度下降为50 μg/L，但延长孵育时间至10 min，敏感度即可达25 μg/L。
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2.1.2 用小滤纸片全血法测定的结果显示，37℃或室温孵育，检测的敏感度无明显差别。当孵育时间为5 min时，敏感度为50 μg/L，如孵育时间增加到10 min敏感度相应增加到25 μg/L。
2.2 检测90例癌症病人末梢全血AFP(DIBA法)和血清AFP(RIA)的结果见表1。
与RIA法检测结果比较，DIBA法测定AFP浓度的符合率为96.67%，以AFP<50 μg/L判为阴性，两结果的阳性符合率达100%。
表1 末梢全血DIBA法、血清RIA法测定
90例癌症病人AFP结果比较(例) DIBA
(ρB/μg.L-1)
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RIA(ρB/μg.L-1)
合计
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注：AFP的质量浓度为μg/L
2.3 末梢全血法DIBA普查1200例，检出AFP浓度50～100μg/L 3例，与血清DIBA和RIA结果相符。检出的3例AFP阳性者，2例为孕妇，1例最后确诊为小肝癌。
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3 讨 论
实验结果表明我们研制的斑点免疫结合试验试剂盒检测人末梢全血AFP，具有特异性强、敏感度高，与常规检测法有较好的符合性，而且具有简便、省料、快速、可直接检测末梢血(全血)等优点，适宜于基层医院和人群肝癌普查使用。
在实验过程中，发现作为载体的NC在整个检测过程中，必须保持湿润，否则全血干于NC上会影响实验结果，同时还需注意点样后的滤纸一定要紧贴于加样孔的膜上，一般小滤纸片约能吸取10～15 μl全血，在蘸取全血时尽可能使滤纸醮满血。在夹去加样的小滤纸片后，NC无需洗涤，即可加酶标抗体，不会影响检测结果，但用洗液洗涤1～2次效果更好。检测样品的溶血、红细胞及凝血对检测结果不影响。用小滤纸片取全血，与AFP或酶标抗体作用时间为10 min以上为适。
目前还没有直接检测末梢血(全血)抗原或抗体的较好的免疫学方法，国内外尚没有直接检测末梢血(全血)的AFP试剂盒。本试剂盒能很好地解决检测末梢血(全血)的问题，可满足多方面的要求，有助于人群的肝癌普查，早期诊断、早期发现病人和早期治疗肝癌，有较好的实用和推广价值。
, 百拇医药
*本项目为卫生厅资助课题
参考文献
1 曹锡坤.滴金免疫测定法在检测血清甲胎蛋白中的应用.上海免疫学杂志，1991，11(3)：154
2 刘 杲.抗人甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其应用.上海免疫学杂志，1986，6(6)：321
3 Micheel B,Fiebach H,Karsten D,et al.Monoclonal antibodies to different epitopes of human alpha-fetoprotein (AFP).Eur J Cancer Clin Oncol,1983,19(9):1 239
4 贺海平，唐东平，田春林，等.快速点免疫结合测定法检测血清甲胎蛋白及其临床应用.上海医学检验杂志，1994，9(3)：162
收稿日期：1997-09-22, 百拇医药