黄芪总皂甙对病毒性心肌炎小鼠慢性期SERCA活性的影响
作者：陈相健 陆曙 耿茜 张寄南 马文珠
单位：(210029 江苏省南京医科大学第一附属医院心研所)
关键词：黄芪总皂甙；柯萨奇病毒B3；病毒性心肌炎；肌浆网钙泵
江苏医药001005 【摘要】 目的 探讨黄芪提取物-黄芪总皂甙对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的病毒性心肌炎(VMC)小鼠慢性期心肌肌浆网钙泵(SERCA)活性变化的影响。方法 将BALB/C小鼠分为正常组(31只)、模型组(36只)及黄芪组(26只)，模型组及黄芪组每只小鼠以2×104TCID50CVB3(TCID50为10-5.83)腹腔注射感染。黄芪组每鼠每天腹腔注射0.15ml黄芪总皂甙注射液，正常及模型组予同体积的生理盐水。3个月后，观察各组小鼠死亡率及心肌病理改变，检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量及心肌组织中SERCA活性。结果 (1)和正常组、黄芪组相比，模型组小鼠死亡率显著增高(P<0.05～0.001)。(2)感染3个月后模型组、黄芪组心肌肌钙蛋白I(cTnI)及心肌病理改变与正常组无显著性差异(P>0.05)。(3)模型组心肌SERCA活性显著低于正常组及黄芪组(P<0.01)。结论 黄芪总皂甙可以降低VMC小鼠的死亡率，对慢性期病毒感染所致心肌组织SERCA功能下调有逆转作用。
, 百拇医药
Changes of SERCA activity in chronic viral myocarditis mice treated with astragaloside
CHEN Xiangjian LU Shu GENG Qian et al.
(Research Institute of Cardiovascular Diseases，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，210029)
【Abstract】 Objective To investigate the changes of cardiac Sarco/Endoplasmic Ca2+ ATPase(SERCA) activity in chronic viral myocarditis(VMC) mice treated with Astragaloside. Methods The BALB/C mice were randomly divided into three groups：normal group(N)，model group (M) and Astragaloside group (A).M group and A group were infected by 2×104TCID50 CVB3(TCID5010-5.83)intraperitoneally.The mortality and cardiac pathological changes were observed after 3 months.The serum cTnI and cardiac SERCA activity were measured meanwhile.Results (1)Compared with N group and A group，The mortality of M group was significantly higher (P<0.05～0.001).(2)The cTnI and cardiac pathological changes of M and A groups had no difference with those of N group (P>0.05).(3)The cardiac SERCA activity of V group were significantly lower than those of N group and A group(P<0.01).Conclusion Astragaloside could decrease the mortality of viral myocarditis and reverse the down regulations of the SERCA activity in wice with chronic mice.
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【Key words】 Astragaloside Coxsackievirus B3 Viral myocarditis Sarco/Endoplasmic Ca2+ ATPase
病毒性心肌炎(VMC)是临床较为常见的心血管疾病之一。13%左右的VMC患者可转化为扩张型心肌病(DCM)，部分VMC慢性期(3个月后)有类似DCM的改变[1]。一般认为病毒感染可通过直接溶细胞作用及免疫作用引起心肌细胞损伤。急性期以病毒直接损伤为主，慢性期以免疫损伤为主。这些因素均可导致细胞内钙平衡失调。针对其损伤机制，国内外有报道用抗病毒药物、免疫抑制法、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂、NO抑制剂及中医药等治疗VMC[2]。中药黄芪在临床上被广泛用于VMC患者，疗效较佳，动物实验亦证明黄芪有降低心肌中病毒RNA的滴度，调节免疫，改善心肌异常电活动等作用[3]。本实验探讨黄芪提取物—黄芪总皂甙对慢性期VMC小鼠心肌组织中肌浆网钙泵活性变化的影响。
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材料与方法
一、动物 4周龄雄性纯种BALB/c小鼠(南京医科大学动物中心提供)，体重12g左右。
二、病毒 CVB3由上海第二医科大学微生物学教研室刘晶星教授赠送。在人胚肾细胞中繁殖传代，并测定其50%组织感染率(TCID50)为10-5.83。
三、黄芪总皂甙提取：具体方法参照文献[4]，调pH为7.4，过滤除菌，4℃贮存备用，浓度1mg/ml。
四、模型制备及分组：BALB/c小鼠随机分成模型组(36只)、正常组(31只)及黄芪组(26只)。模型组及黄芪组于实验当天每鼠腹腔注射(ip)0.1ml，2×104TCID50CVB3；正常对照组每鼠ip0.1ml不含病毒的病毒培养液。黄芪组每鼠每天腹腔注射0.15ml无菌黄芪总皂甙注射液，正常组及模型组每鼠每天腹腔注射同体积的生理盐水，一个月之后，间断给药。感染3个月后，存活小鼠眼眶取血，分离血清待检；取血后处死，取心脏中下1/3处心肌，用10%甲醛固定待用。取其余心室肌组织，-70℃保存备用。部分小鼠标本用于如下检测，余另作他用。
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五、观察指标：(1)小鼠死亡率。(2)cTnI：采用本室建立的改良Bodor夹心ELISA法测定[5]，浓度单位为ng/ml。(3)病理组织学检查：10%甲醛固定的心肌用石蜡包埋后，取2～3个不同部位作连续切片，HE染色，光镜下观察心肌的病理改变。(4)心肌细胞SERCA活性测定：采用本室改良建立的pNPP法测定[6]，单位为μmol/gpro.min。
六、统计学分析：计量资料采用均数±标准差。均数组间比较用t检验，率的比较用χ2检验，cTnI数据用秩和检验。
结果
一、死亡率：感染病毒至3个月，模型组小鼠死亡率为33.3%(12/36)；黄芪组小鼠死亡率为7.69%(2/26)。正常对照组未见死亡。死亡小鼠发生时间均为感染后一周内。模型组与正常组、黄芪组相比差异显著(P<0.05～0.001)。
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二、血清cTnI测定结果：感染3个月后，正常组、模型组及黄芪组小鼠cTnI分别为：1.36±1.17ng/ml(n＝6)、2.42±2.0ng/ml(n＝6)及2.26±2.20ng/ml(n＝5)，经秩和检验，各组比较无显著性差异(P>0.05)。
三、心肌病理改变：感染3个月后，模型组、黄芪组小鼠心肌见少量炎症、坏死灶，与正常组无显著性差异。
四、心肌组织SERCA活性测定结果：感染3个月后，正常组、模型组及黄芪组小鼠心肌组织SERCA活性，分别为：1.99±0.13μmol/gpro.min(n＝6)、1.04±0.14μmol/gpro.min(n＝5)及1.71±0.15μmol/gpro.min(n＝6)。模型组小鼠与正常组、黄芪组相比明显降低(P<0.01)。
讨论
VMC急性期，主要是炎症细胞浸润，心肌细胞的溶解坏死；慢性期，以心肌肥厚，间质细胞纤维化改变为主。Figulla等[7]报道小鼠感染CVB3病毒9天后，约13%心肌细胞可受染。30天后，仅0.01%心肌细胞受染。用EMCV感染的DBA/2小鼠，14天后即不能在心肌中分离出感染性的病毒，90天后心肌大量纤维化，而无心肌坏死及细胞浸润。
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病毒在心肌持续复制、免疫介导的损伤及细胞凋亡被认为是促进转化的主要原因。而这些因素均可使心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)升高，导致钙超载，引起心肌损伤。SERCA是将胞内游离钙主动摄入肌浆网(SR)内储存的一种钙转运蛋白，与SR钙释放通道一起调节心肌细胞内[Ca2+]i，在保持[Ca2+]i平衡中发挥重要作用。SERCA有3种基因类型，SERCA2型基因主要在心肌中表达。有报道抗SERCA自身抗体可抑制70%的SERCA活力，胞内钙超载，从而引发小鼠自身免疫性心肌炎和DCM[8]。而心肌肥厚、DCM等各种病因所致的心力衰竭时SERCA2型mRNA的含量及稳定性均是下降的。本实验结果提示：CVB3病毒感染3个月后的BALB/C小鼠，血清cTnI、心肌病理改变与正常组无显著差异，但VMC慢性期心肌组织SERCA活性明显降低，说明VMC慢性期无活动性心肌损伤，但心肌部分功能仍未恢复至正常，SERCA功能下降可能与VMC向DCM转化有关。
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黄芪总皂甙是黄芪治疗VMC的有效成分之一，本实验观察到：黄芪总皂甙不仅可以降低VMC小鼠的死亡率，而且能恢复慢性期SERCA的功能活性，可能对VMC向DCM转化起逆转作用。
基金项目：国家“九五”攻关基金(96-906-02-13)、江苏省科委社会发展基金(BS97028与BS98039)及江苏省卫生厅项目(H9701)
参考文献
1，Andredetti L，Hober D，Becquart P，et al.Experimental CVB3-Induced Chronic Myocarditis in Two Murine Strains：Evidents of Interrelationships Between Virus Replication and Myocardial Damage in Persistent Cardiac Infection.Journal of Medical Virology，1997，52：206-214.
, 百拇医药
2，Anandasabapathy S，Frishman WH.Innovative Drug Treatments for Viral and Autoimmune Myocarditis.Journal of Clinical Pharmacology，1998，38：295-308.
3，陆曙，张寄南.黄芪的心血管药理作用研究进展.中草药，1998，29：59-61.
4，吕归宝，吕曙华，张国庆，等.黄芪中黄酮类化合物的分离鉴定.中草药，1984，15：20-22.
5，张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379-382.
6，祝宝华，张寄南，马文珠等.肌浆网钙泵测定及其在高血压心肌中的变化.南京医科大学学报，1998，18：390-392.
, http://www.100md.com
7，Figulla H R，Kandolt R，McManus B.Idiopathic Dilated Cardiomyopathy：Cellualar and Molecular Mechanisms，Clinical Consequences.Springer-Verlag Berlin Herdelberg 1993，267-283.
8，Khaw BA，Narula J，Sharaff AR，et al.SR-Ca2+-ATPase an autoimmunogental in experimental myocarditis.Eur Heart J，1995，16：92-96.
收稿：2000-06-12
修回：2000-06-20, http://www.100md.com
单位：(210029 江苏省南京医科大学第一附属医院心研所)
关键词：黄芪总皂甙；柯萨奇病毒B3；病毒性心肌炎；肌浆网钙泵
江苏医药001005 【摘要】 目的 探讨黄芪提取物-黄芪总皂甙对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的病毒性心肌炎(VMC)小鼠慢性期心肌肌浆网钙泵(SERCA)活性变化的影响。方法 将BALB/C小鼠分为正常组(31只)、模型组(36只)及黄芪组(26只)，模型组及黄芪组每只小鼠以2×104TCID50CVB3(TCID50为10-5.83)腹腔注射感染。黄芪组每鼠每天腹腔注射0.15ml黄芪总皂甙注射液，正常及模型组予同体积的生理盐水。3个月后，观察各组小鼠死亡率及心肌病理改变，检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量及心肌组织中SERCA活性。结果 (1)和正常组、黄芪组相比，模型组小鼠死亡率显著增高(P<0.05～0.001)。(2)感染3个月后模型组、黄芪组心肌肌钙蛋白I(cTnI)及心肌病理改变与正常组无显著性差异(P>0.05)。(3)模型组心肌SERCA活性显著低于正常组及黄芪组(P<0.01)。结论 黄芪总皂甙可以降低VMC小鼠的死亡率，对慢性期病毒感染所致心肌组织SERCA功能下调有逆转作用。
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Changes of SERCA activity in chronic viral myocarditis mice treated with astragaloside
CHEN Xiangjian LU Shu GENG Qian et al.
(Research Institute of Cardiovascular Diseases，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，210029)
【Abstract】 Objective To investigate the changes of cardiac Sarco/Endoplasmic Ca2+ ATPase(SERCA) activity in chronic viral myocarditis(VMC) mice treated with Astragaloside. Methods The BALB/C mice were randomly divided into three groups：normal group(N)，model group (M) and Astragaloside group (A).M group and A group were infected by 2×104TCID50 CVB3(TCID5010-5.83)intraperitoneally.The mortality and cardiac pathological changes were observed after 3 months.The serum cTnI and cardiac SERCA activity were measured meanwhile.Results (1)Compared with N group and A group，The mortality of M group was significantly higher (P<0.05～0.001).(2)The cTnI and cardiac pathological changes of M and A groups had no difference with those of N group (P>0.05).(3)The cardiac SERCA activity of V group were significantly lower than those of N group and A group(P<0.01).Conclusion Astragaloside could decrease the mortality of viral myocarditis and reverse the down regulations of the SERCA activity in wice with chronic mice.
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【Key words】 Astragaloside Coxsackievirus B3 Viral myocarditis Sarco/Endoplasmic Ca2+ ATPase
病毒性心肌炎(VMC)是临床较为常见的心血管疾病之一。13%左右的VMC患者可转化为扩张型心肌病(DCM)，部分VMC慢性期(3个月后)有类似DCM的改变[1]。一般认为病毒感染可通过直接溶细胞作用及免疫作用引起心肌细胞损伤。急性期以病毒直接损伤为主，慢性期以免疫损伤为主。这些因素均可导致细胞内钙平衡失调。针对其损伤机制，国内外有报道用抗病毒药物、免疫抑制法、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂、NO抑制剂及中医药等治疗VMC[2]。中药黄芪在临床上被广泛用于VMC患者，疗效较佳，动物实验亦证明黄芪有降低心肌中病毒RNA的滴度，调节免疫，改善心肌异常电活动等作用[3]。本实验探讨黄芪提取物—黄芪总皂甙对慢性期VMC小鼠心肌组织中肌浆网钙泵活性变化的影响。
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材料与方法
一、动物 4周龄雄性纯种BALB/c小鼠(南京医科大学动物中心提供)，体重12g左右。
二、病毒 CVB3由上海第二医科大学微生物学教研室刘晶星教授赠送。在人胚肾细胞中繁殖传代，并测定其50%组织感染率(TCID50)为10-5.83。
三、黄芪总皂甙提取：具体方法参照文献[4]，调pH为7.4，过滤除菌，4℃贮存备用，浓度1mg/ml。
四、模型制备及分组：BALB/c小鼠随机分成模型组(36只)、正常组(31只)及黄芪组(26只)。模型组及黄芪组于实验当天每鼠腹腔注射(ip)0.1ml，2×104TCID50CVB3；正常对照组每鼠ip0.1ml不含病毒的病毒培养液。黄芪组每鼠每天腹腔注射0.15ml无菌黄芪总皂甙注射液，正常组及模型组每鼠每天腹腔注射同体积的生理盐水，一个月之后，间断给药。感染3个月后，存活小鼠眼眶取血，分离血清待检；取血后处死，取心脏中下1/3处心肌，用10%甲醛固定待用。取其余心室肌组织，-70℃保存备用。部分小鼠标本用于如下检测，余另作他用。
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五、观察指标：(1)小鼠死亡率。(2)cTnI：采用本室建立的改良Bodor夹心ELISA法测定[5]，浓度单位为ng/ml。(3)病理组织学检查：10%甲醛固定的心肌用石蜡包埋后，取2～3个不同部位作连续切片，HE染色，光镜下观察心肌的病理改变。(4)心肌细胞SERCA活性测定：采用本室改良建立的pNPP法测定[6]，单位为μmol/gpro.min。
六、统计学分析：计量资料采用均数±标准差。均数组间比较用t检验，率的比较用χ2检验，cTnI数据用秩和检验。
结果
一、死亡率：感染病毒至3个月，模型组小鼠死亡率为33.3%(12/36)；黄芪组小鼠死亡率为7.69%(2/26)。正常对照组未见死亡。死亡小鼠发生时间均为感染后一周内。模型组与正常组、黄芪组相比差异显著(P<0.05～0.001)。
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二、血清cTnI测定结果：感染3个月后，正常组、模型组及黄芪组小鼠cTnI分别为：1.36±1.17ng/ml(n＝6)、2.42±2.0ng/ml(n＝6)及2.26±2.20ng/ml(n＝5)，经秩和检验，各组比较无显著性差异(P>0.05)。
三、心肌病理改变：感染3个月后，模型组、黄芪组小鼠心肌见少量炎症、坏死灶，与正常组无显著性差异。
四、心肌组织SERCA活性测定结果：感染3个月后，正常组、模型组及黄芪组小鼠心肌组织SERCA活性，分别为：1.99±0.13μmol/gpro.min(n＝6)、1.04±0.14μmol/gpro.min(n＝5)及1.71±0.15μmol/gpro.min(n＝6)。模型组小鼠与正常组、黄芪组相比明显降低(P<0.01)。
讨论
VMC急性期，主要是炎症细胞浸润，心肌细胞的溶解坏死；慢性期，以心肌肥厚，间质细胞纤维化改变为主。Figulla等[7]报道小鼠感染CVB3病毒9天后，约13%心肌细胞可受染。30天后，仅0.01%心肌细胞受染。用EMCV感染的DBA/2小鼠，14天后即不能在心肌中分离出感染性的病毒，90天后心肌大量纤维化，而无心肌坏死及细胞浸润。
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病毒在心肌持续复制、免疫介导的损伤及细胞凋亡被认为是促进转化的主要原因。而这些因素均可使心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)升高，导致钙超载，引起心肌损伤。SERCA是将胞内游离钙主动摄入肌浆网(SR)内储存的一种钙转运蛋白，与SR钙释放通道一起调节心肌细胞内[Ca2+]i，在保持[Ca2+]i平衡中发挥重要作用。SERCA有3种基因类型，SERCA2型基因主要在心肌中表达。有报道抗SERCA自身抗体可抑制70%的SERCA活力，胞内钙超载，从而引发小鼠自身免疫性心肌炎和DCM[8]。而心肌肥厚、DCM等各种病因所致的心力衰竭时SERCA2型mRNA的含量及稳定性均是下降的。本实验结果提示：CVB3病毒感染3个月后的BALB/C小鼠，血清cTnI、心肌病理改变与正常组无显著差异，但VMC慢性期心肌组织SERCA活性明显降低，说明VMC慢性期无活动性心肌损伤，但心肌部分功能仍未恢复至正常，SERCA功能下降可能与VMC向DCM转化有关。
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黄芪总皂甙是黄芪治疗VMC的有效成分之一，本实验观察到：黄芪总皂甙不仅可以降低VMC小鼠的死亡率，而且能恢复慢性期SERCA的功能活性，可能对VMC向DCM转化起逆转作用。
基金项目：国家“九五”攻关基金(96-906-02-13)、江苏省科委社会发展基金(BS97028与BS98039)及江苏省卫生厅项目(H9701)
参考文献
1，Andredetti L，Hober D，Becquart P，et al.Experimental CVB3-Induced Chronic Myocarditis in Two Murine Strains：Evidents of Interrelationships Between Virus Replication and Myocardial Damage in Persistent Cardiac Infection.Journal of Medical Virology，1997，52：206-214.
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2，Anandasabapathy S，Frishman WH.Innovative Drug Treatments for Viral and Autoimmune Myocarditis.Journal of Clinical Pharmacology，1998，38：295-308.
3，陆曙，张寄南.黄芪的心血管药理作用研究进展.中草药，1998，29：59-61.
4，吕归宝，吕曙华，张国庆，等.黄芪中黄酮类化合物的分离鉴定.中草药，1984，15：20-22.
5，张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379-382.
6，祝宝华，张寄南，马文珠等.肌浆网钙泵测定及其在高血压心肌中的变化.南京医科大学学报，1998，18：390-392.
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7，Figulla H R，Kandolt R，McManus B.Idiopathic Dilated Cardiomyopathy：Cellualar and Molecular Mechanisms，Clinical Consequences.Springer-Verlag Berlin Herdelberg 1993，267-283.
8，Khaw BA，Narula J，Sharaff AR，et al.SR-Ca2+-ATPase an autoimmunogental in experimental myocarditis.Eur Heart J，1995，16：92-96.
收稿：2000-06-12
修回：2000-06-20, http://www.100md.com