丙型肝炎病毒侵犯外周血单个核细胞对体外增殖反应的影响
作者：张树林 刘宇卉 任建林 狄鹏超
单位：710061 西安医科大学第一临床医学院肝炎研究室
关键词：
中华传染病杂志/990216
外周血单个核细胞(PBMC)为免疫细胞群体，丙型肝炎病毒(HCV)可侵犯PBMC并在其中复制，然而这种侵犯对免疫功能的影响所知甚少[1]。本研究以逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)检测PBMC中正、负链HCV RNA,以HCV重组抗原刺激PBMC体外增殖，探讨HCV侵犯PBMC对免疫功能的影响。
材料与方法
一、研究对象
41例慢性HCV感染者为1995年6月至1996年9月间本院门诊随访和住院患者，均持续或间断出现转氨酶升高半年以上并曾检出抗-HCV(RIA-2)和血清HCV RNA。7例健康献血员作为对照，转氨酶正常，抗-HCV、HCV RNA阴性。所有病例HBsAg(spRIA)和HBV DNA(nested-PCR)阴性。
, 百拇医药
二、研究方法
(一) 正、负链HCV RNA 采用RT-nested-PCR检测，异硫氰酸胍一步法自血清、PBMC及分离PBMC的最后一次洗液中抽提RNA，在cDNA合成中分别加引物2或引物1，以检测正链或负链HCV RNA。95°C灭活逆转录酶，行PCR扩增，第二次扩增产物经2.2%琼脂糖凝胶电泳出现146bp条带为阳性。引物依HCV基因组5'非编码区设计。外引物：1.5′-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3′(nt28～47),2.5′-CAACACTACTCGGCTAGCAGTC-3′(nt249～228);内引物：3.5′-TTCACGCAGAAAGGGGCT-AG-3′(nt46～65),4.5′-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3′(nt190～171)。
(二) 体外细胞增殖反应 采用同位素掺入法检测，密度梯度法分离PBMC，加入96孔平底培养板(2.5×105/孔)，再加终浓度为2μg/ml的重组HCV抗原：NS3-C75为双表位嵌合型重组抗原，C33C、NS4为非融合HCV重组抗原。37°C、5%CO2条件下培养96小时加入3H-TdR(3.7×104Bq/孔)，再培养16小时后收集细胞、洗涤，液闪计数仪测cpm值。结果以刺激指数(SI)表示：SI=标本管平均cpm/阴性对照管平均cpm。每份标本平行做3孔，每次试验设阴性和空白对照。
, 百拇医药
(三) 抗-HCV和HBV血清标志 以spRIA检测，HBV DNA采用nested-PCR法检测。
三、 统计学处理
采用卡方检验和t检验。
结果
一、正、负链HCV RNA检出情况
7例对照的血清、PBMC及所有病例分离PBMC的最后一次洗液中均未检出正、负链HCV RNA，41例慢性HCV感染者血清中26例正链HCV RNA阳性(64.3%)，但未检出负链HCV RNA；24例(58.5%)PBMC中检出正链HCV RNA，7例检出负链(17.1%)，此7例均为正链阳性。
二、PBMC对HCV重组抗原的增殖反应
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41例慢性HCV感染者中30例(73.2%)至少对一种重组HCV抗原出现增殖反应，11例(26.8%)对三种抗原均无反应(SI≥4.0判为增殖反应阳性)。对NS3-C75、C33C和NS4的增殖反应率分别为51.2%(21/41)、24.4%(10/41)和70.7%(29/41)。7例对照对三种抗原的SI均<4.0。
血清中正链HCV RNA的存在对增殖反应无影响(三种抗原SI比较均P>0.05)。PBMC中正、负链HCV RNA存在与增殖反应的关系见表1。
表1 PBMC中正、负链HCV RNA与SI的关系 HCV
RNA
例数
SI
NS3-C75
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C33C
NS4
正链
+
24
6.8±3.9*
3.9±2.2
7.9±4.0*
-
17
3.9±2.2
2.2±1.6
, 百拇医药
4.6±2.0
负链
+
7
8.8±4.1
3.2±3.5
11.4±5.4*
-
17
6.0±4.9
4.2±2.9
6.4±4.2
, http://www.100md.com * 与相应组比较P<0.05讨论
负链HCV RNA为HCV复制的标志。CHANG等[2]研究发现，82例急性HCV感染者PBMC中均无HCV RNA，而慢性感染者25%(12/48例)PBMC中检出正链HCV RNA，此12例中6例同时检出负链HCV RNA，并证实不是HCV吸附于PBMC所致。本组58.5%(24/41例)慢性HCV感染者PBMC中检出正链HCV RNA，其中7例同时检出负链HCV RNA，并且分离PBMC的末次洗液未检出HCV RNA，也证实HCV可侵犯PBMC并在其中复制。
HCV重组抗原体外刺激PBMC发生增殖反应的主要为主要组织相容复合物(MHC-Ⅱ)限制性CD4+细胞。Botarelli等[3]采用流式细胞仪技术证实HCV重组抗原体外刺激PBMC增殖后，97%以上细胞为CD3+，其中80%～90%为CD4+，10%～20%为CD8+，并且这种增殖反应可被MHC-Ⅱ类分子的单克隆抗体所阻断。本研究见三种HCV重组抗原均可刺激感染者PBMC体外增殖。NS3-C75为双表位嵌合型重组抗原，同时具有NS3和Core区抗原的免疫原性，其刺激PBMC增殖反应率(51.2%)高于C33C(24.4%)。NS4区重组抗原的刺激增殖反应率最高(70.7%)。Botarelli、Minutelb的研究结果均与本文一致，可见NS4免疫原性最强。
, http://www.100md.com
Ferri等[4，5]报道HCV侵犯PBMC和骨髓单个核细胞与冷球蛋白血症(MC)发生密切相关；HCV侵犯PBMC可增强患者外周血B细胞体外分泌抗-HCV的能力，证实HCV感染与淋巴细胞增生性疾病有关。本文结果显示，PBMC中正链HCV RNA阳性组对NS3-C75和NS4的增殖反应(SI值分别为6.8±3.9和7.9±4.0)明显高于正链阴性组(分别为3.9±2.2和4.6±2.0)，P<0.05。同时检出负链HCV RNA者对NS4增殖反应高于仅检出正链HCV RNA者(11.4±5.4与6.4±4.2),P<0.05。可见HCV侵犯PBMC使HCV抗原刺激的CD4+增殖反应增强，推测HCV侵犯PBMC后CD4+增殖活化，产生细胞因子间接活化B细胞可能为HCV感染所致冷球蛋白血症和B细胞淋巴瘤发生的机制。
参考文献
1 刘宇卉，张树林.丙型肝炎发病中特异性细胞毒性T细胞的作用及意义.国外医学免疫学分册，1996，19：141-144.
, http://www.100md.com
2 CHANG TT, YONG C, YONG YJ, et al. Hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells. Comparing acute and chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 1996, 23:977-981.
3 Botarelli P, Brunetto MR, Minutello MA, et al. T-lymphocyte response to hepatitis C virus in different clinical course of infection. Gastroenterology, 1993, 104:580-587.
4 Ferri C, Narzo E, Longomgarolo G,et al.Alpha-interferon in mixed cryoglobulinemia patients:a randomized crossover controlled trial. Blood, 1993, 81: 1132-1134.
5 Silvestri F, Pipan C, Barillari G, et al. Prevalence of hepatitis C virus infection in patients with lymphoprolife rative disorders. Blood, 1996,84:4396-4401.
收稿：1997-08-04 修回：1998-07-02, 百拇医药
单位：710061 西安医科大学第一临床医学院肝炎研究室
关键词：
中华传染病杂志/990216
外周血单个核细胞(PBMC)为免疫细胞群体，丙型肝炎病毒(HCV)可侵犯PBMC并在其中复制，然而这种侵犯对免疫功能的影响所知甚少[1]。本研究以逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)检测PBMC中正、负链HCV RNA,以HCV重组抗原刺激PBMC体外增殖，探讨HCV侵犯PBMC对免疫功能的影响。
材料与方法
一、研究对象
41例慢性HCV感染者为1995年6月至1996年9月间本院门诊随访和住院患者，均持续或间断出现转氨酶升高半年以上并曾检出抗-HCV(RIA-2)和血清HCV RNA。7例健康献血员作为对照，转氨酶正常，抗-HCV、HCV RNA阴性。所有病例HBsAg(spRIA)和HBV DNA(nested-PCR)阴性。
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二、研究方法
(一) 正、负链HCV RNA 采用RT-nested-PCR检测，异硫氰酸胍一步法自血清、PBMC及分离PBMC的最后一次洗液中抽提RNA，在cDNA合成中分别加引物2或引物1，以检测正链或负链HCV RNA。95°C灭活逆转录酶，行PCR扩增，第二次扩增产物经2.2%琼脂糖凝胶电泳出现146bp条带为阳性。引物依HCV基因组5'非编码区设计。外引物：1.5′-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3′(nt28～47),2.5′-CAACACTACTCGGCTAGCAGTC-3′(nt249～228);内引物：3.5′-TTCACGCAGAAAGGGGCT-AG-3′(nt46～65),4.5′-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3′(nt190～171)。
(二) 体外细胞增殖反应 采用同位素掺入法检测，密度梯度法分离PBMC，加入96孔平底培养板(2.5×105/孔)，再加终浓度为2μg/ml的重组HCV抗原：NS3-C75为双表位嵌合型重组抗原，C33C、NS4为非融合HCV重组抗原。37°C、5%CO2条件下培养96小时加入3H-TdR(3.7×104Bq/孔)，再培养16小时后收集细胞、洗涤，液闪计数仪测cpm值。结果以刺激指数(SI)表示：SI=标本管平均cpm/阴性对照管平均cpm。每份标本平行做3孔，每次试验设阴性和空白对照。
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(三) 抗-HCV和HBV血清标志 以spRIA检测，HBV DNA采用nested-PCR法检测。
三、 统计学处理
采用卡方检验和t检验。
结果
一、正、负链HCV RNA检出情况
7例对照的血清、PBMC及所有病例分离PBMC的最后一次洗液中均未检出正、负链HCV RNA，41例慢性HCV感染者血清中26例正链HCV RNA阳性(64.3%)，但未检出负链HCV RNA；24例(58.5%)PBMC中检出正链HCV RNA，7例检出负链(17.1%)，此7例均为正链阳性。
二、PBMC对HCV重组抗原的增殖反应
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41例慢性HCV感染者中30例(73.2%)至少对一种重组HCV抗原出现增殖反应，11例(26.8%)对三种抗原均无反应(SI≥4.0判为增殖反应阳性)。对NS3-C75、C33C和NS4的增殖反应率分别为51.2%(21/41)、24.4%(10/41)和70.7%(29/41)。7例对照对三种抗原的SI均<4.0。
血清中正链HCV RNA的存在对增殖反应无影响(三种抗原SI比较均P>0.05)。PBMC中正、负链HCV RNA存在与增殖反应的关系见表1。
表1 PBMC中正、负链HCV RNA与SI的关系 HCV
RNA
例数
SI
NS3-C75
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C33C
NS4
正链
+
24
6.8±3.9*
3.9±2.2
7.9±4.0*
-
17
3.9±2.2
2.2±1.6
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4.6±2.0
负链
+
7
8.8±4.1
3.2±3.5
11.4±5.4*
-
17
6.0±4.9
4.2±2.9
6.4±4.2
, http://www.100md.com * 与相应组比较P<0.05讨论
负链HCV RNA为HCV复制的标志。CHANG等[2]研究发现，82例急性HCV感染者PBMC中均无HCV RNA，而慢性感染者25%(12/48例)PBMC中检出正链HCV RNA，此12例中6例同时检出负链HCV RNA，并证实不是HCV吸附于PBMC所致。本组58.5%(24/41例)慢性HCV感染者PBMC中检出正链HCV RNA，其中7例同时检出负链HCV RNA，并且分离PBMC的末次洗液未检出HCV RNA，也证实HCV可侵犯PBMC并在其中复制。
HCV重组抗原体外刺激PBMC发生增殖反应的主要为主要组织相容复合物(MHC-Ⅱ)限制性CD4+细胞。Botarelli等[3]采用流式细胞仪技术证实HCV重组抗原体外刺激PBMC增殖后，97%以上细胞为CD3+，其中80%～90%为CD4+，10%～20%为CD8+，并且这种增殖反应可被MHC-Ⅱ类分子的单克隆抗体所阻断。本研究见三种HCV重组抗原均可刺激感染者PBMC体外增殖。NS3-C75为双表位嵌合型重组抗原，同时具有NS3和Core区抗原的免疫原性，其刺激PBMC增殖反应率(51.2%)高于C33C(24.4%)。NS4区重组抗原的刺激增殖反应率最高(70.7%)。Botarelli、Minutelb的研究结果均与本文一致，可见NS4免疫原性最强。
, http://www.100md.com
Ferri等[4，5]报道HCV侵犯PBMC和骨髓单个核细胞与冷球蛋白血症(MC)发生密切相关；HCV侵犯PBMC可增强患者外周血B细胞体外分泌抗-HCV的能力，证实HCV感染与淋巴细胞增生性疾病有关。本文结果显示，PBMC中正链HCV RNA阳性组对NS3-C75和NS4的增殖反应(SI值分别为6.8±3.9和7.9±4.0)明显高于正链阴性组(分别为3.9±2.2和4.6±2.0)，P<0.05。同时检出负链HCV RNA者对NS4增殖反应高于仅检出正链HCV RNA者(11.4±5.4与6.4±4.2),P<0.05。可见HCV侵犯PBMC使HCV抗原刺激的CD4+增殖反应增强，推测HCV侵犯PBMC后CD4+增殖活化，产生细胞因子间接活化B细胞可能为HCV感染所致冷球蛋白血症和B细胞淋巴瘤发生的机制。
参考文献
1 刘宇卉，张树林.丙型肝炎发病中特异性细胞毒性T细胞的作用及意义.国外医学免疫学分册，1996，19：141-144.
, http://www.100md.com
2 CHANG TT, YONG C, YONG YJ, et al. Hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells. Comparing acute and chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 1996, 23:977-981.
3 Botarelli P, Brunetto MR, Minutello MA, et al. T-lymphocyte response to hepatitis C virus in different clinical course of infection. Gastroenterology, 1993, 104:580-587.
4 Ferri C, Narzo E, Longomgarolo G,et al.Alpha-interferon in mixed cryoglobulinemia patients:a randomized crossover controlled trial. Blood, 1993, 81: 1132-1134.
5 Silvestri F, Pipan C, Barillari G, et al. Prevalence of hepatitis C virus infection in patients with lymphoprolife rative disorders. Blood, 1996,84:4396-4401.
收稿：1997-08-04 修回：1998-07-02, 百拇医药