不明原因早期流产患者蜕膜淋巴细胞的增殖反应
作者：崔澂 王慧贤 王秀荣 郝淑维 焦炳忠
单位：崔 徵 解放军白求恩医学高等专科学校微生物及寄生虫学教研室 050081 石家庄；王慧贤,王秀荣 河北医科大学基础医学院微生物及免疫学教研室；郝淑维 附属第四医院妇产科；焦炳忠 基础医学院病理教研室
关键词：
中华妇科杂志990822 骨髓来源的淋巴细胞是蜕膜中的主要细胞群,参与了妊娠各个生理过程的免疫调节[1]，一旦其调控作用失衡,就有可能导致自然流产等不良后果。本研究旨在通过观察正常孕妇及不明原因早期自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率、诱生的白细胞介素-2(IL-2)活性的变化,探讨此种疾病的免疫学发病因素。
一、资料与方法
1.研究对象：为1995年3月至1996年1月间在河北医科大学附属第四医院妇产科门诊就诊病例,年龄25～35岁。对照组：25例，健康、孕12周内,未使用任何激素类药物,宫颈、阴道无急性及慢性炎症，未放置宫内节育器,无异常孕育史，自愿要求行人工流产术终止妊娠。流产组：25例，夫妇染色体核型无异常；男方精液检查无异常；常规妇科及B超检查无子宫畸形、子宫肌瘤等病变；近期无急性或慢性传染病；应用聚合酶链反应检查弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类获得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、解脲支原体均阴性；无自身免疫性疾病的临床特征,抗磷脂抗体、抗核抗体均在正常范围;无放射线及有毒物质接触史;无甲状腺功能异常、糖尿病等内分泌及其他合并症；既往月经周期及经量正常,诊断性刮宫、基础体温测定及孕激素、雌激素等激素水平测定均无异常；3个月内未使用任何激素类药物，未放置宫内节育器,无异常孕育史；均在出现流产征兆后未进行任何药物治疗而就诊的早期自然流产患者，其中先兆流产9例、难免流产8例、不全流产6例、完全流产2例。两组年龄分别为(29.9±0.9)岁、(26.8±0.5)岁，孕周为(7.3±0.2)和(7.9±0.3)周，孕次为(1.8±0.1)和(1.4±0.1)次，产次为(0.6±0.1)和(0.4±0.1)次。
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2.方法:(1)标本采集及细胞分离:以无菌方式刮取蜕膜组织,经含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶的消化液处理后收集混合单个细胞悬液,以淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,加至常规RPMI-1640完全培养液中,贴壁孵育。(2)淋巴细胞计数：将两组各10例的混合单个细胞制成涂片,经HE染色,油镜下观察蜕膜组织中的细胞类型,计算淋巴细胞所占百分率。(3)淋巴细胞转化率测定：采用刀豆蛋白A(ConA)刺激非贴壁淋巴细胞(两组各10例)72小时后,取沉淀细胞制成涂片,再经HE染色,油镜下观察淋巴细胞转化情况,计算淋巴细胞转化率。(4)IL-2检测:两组均进行检测。经ConA刺激淋巴细胞48小时后,收获培养上清液,即为待检IL-2样品。取6～8周龄C57BL/6小鼠的脾细胞,经ConA诱导制备脾淋巴母细胞作为IL-2反应细胞,与IL-2待测样品共同孵育,一式3份,并包括阴性对照、培养液对照、ConA对照及阳性对照。48小时后,加入氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，继续培养6小时,将细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上,放入闪烁测量瓶中,以FJ-2115型自动β闪烁液计数仪测定掺入3H-TdR的每分脉冲数(CPM)，判定检测样品中IL-2的活性。
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3.统计学方法: 所有数据以x±s表示；进行方差齐性检验后,采用成组设计两样本均数比较的t或t′检验及直线相关分析。
二、结果
两组蜕膜中均含有大量的淋巴细胞,其中，流产组淋巴细胞百分率[(63.3±2.2)%]及淋巴细胞转化率[(69.0±3.5)%]皆显著高于对照组[(56.1±3.5)%、(52.0±3.9)%，P<0.01]，IL-2活性[(6092.2±821.2)CPM]亦明显强于对照组(3909.2±472.3)CPM，P<0.01]，且IL-2活性与淋巴细胞转化率之间存在显著的直线正相关关系(P<0.01)。
三、讨论
在正常妊娠过程中，蜕膜组织中的淋巴细胞缺乏活化识别结构,在功能上仍处于休止状态[2]。本实验结果显示,不明原因早期自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率及其诱生IL-2的活性均显著升高，提示在某种刺激因素的作用下,自然流产患者蜕膜中的淋巴细胞可能处于高激活状态,使得活化的淋巴细胞分泌较多的IL-2,促进蜕膜组织中γ干扰素(INF-γ)等细胞因子的产生,增强细胞表面粘附分子的表达，通过诱导休止期T淋巴细胞活化,抑制蜕膜分泌生长因子,直接影响滋养层的发育,刺激子宫收缩,改变蜕膜大颗粒淋巴细胞的自然杀伤细胞活性等途径,使母体对胎儿产生免疫攻击,并抑制胚胎的发育,最终引发自然流产[3]。因此，妊娠早期体内淋巴细胞增殖及其产生IL-2活性的异常上调，可能是导致流产发生的免疫学发病机理之一。
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目前,临床上对于首次发生流产的患者,尚缺乏预知性。另外,由于导致不明原因早期流产的病因较复杂,虽然主动及被动免疫治疗已取得了一定的成功,但治疗机理并不十分明确[4]，研讨自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞功能的变化,摸索孕早期外周血淋巴细胞的相应改变，将有助于流产的防治。而对于已发生过流产的患者,特别是习惯性流产者，应留取蜕膜组织进行免疫学直接检测,以确定不同患者各自的主要免疫学致病因素,有针对性地采取适当的保胎措施,可避免预防和治疗中的盲目性。
参考文献
1 Mincheva-Nilsson L, Kling M,Hammarstrom S,et al. Gama, delta T cells of human early pregnancy decidua: evidence for local proliferation, phenotypic heterogeneity, and extrathymic differentiation. J Immunol, 1997,159:3266-3277.
, 百拇医药
2 Slukvin II,Chernyshov VP,Merkulova AA,et al.Differential expression of adhesion and homing molecules by human decidual and peripheral blood lymphocytes in early preg- nancy. Cell Immunol,1994,158:29-45.
3 Burrows TD,King A, Loke YW. Expression of adhesion molecules by human decidual large granular lymphocytes.Cell Immunol, 1993,147:81-94.
4 陈庆华,林其德,赵爱民,等.主动免疫治疗原因不明性习惯性流产患者的子代随访结果.中华妇产科杂志,1997,32:44-45.
(收稿：1998-07-16 修回：1999-03-11), 百拇医药
单位：崔 徵 解放军白求恩医学高等专科学校微生物及寄生虫学教研室 050081 石家庄；王慧贤,王秀荣 河北医科大学基础医学院微生物及免疫学教研室；郝淑维 附属第四医院妇产科；焦炳忠 基础医学院病理教研室
关键词：
中华妇科杂志990822 骨髓来源的淋巴细胞是蜕膜中的主要细胞群,参与了妊娠各个生理过程的免疫调节[1]，一旦其调控作用失衡,就有可能导致自然流产等不良后果。本研究旨在通过观察正常孕妇及不明原因早期自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率、诱生的白细胞介素-2(IL-2)活性的变化,探讨此种疾病的免疫学发病因素。
一、资料与方法
1.研究对象：为1995年3月至1996年1月间在河北医科大学附属第四医院妇产科门诊就诊病例,年龄25～35岁。对照组：25例，健康、孕12周内,未使用任何激素类药物,宫颈、阴道无急性及慢性炎症，未放置宫内节育器,无异常孕育史，自愿要求行人工流产术终止妊娠。流产组：25例，夫妇染色体核型无异常；男方精液检查无异常；常规妇科及B超检查无子宫畸形、子宫肌瘤等病变；近期无急性或慢性传染病；应用聚合酶链反应检查弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类获得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、解脲支原体均阴性；无自身免疫性疾病的临床特征,抗磷脂抗体、抗核抗体均在正常范围;无放射线及有毒物质接触史;无甲状腺功能异常、糖尿病等内分泌及其他合并症；既往月经周期及经量正常,诊断性刮宫、基础体温测定及孕激素、雌激素等激素水平测定均无异常；3个月内未使用任何激素类药物，未放置宫内节育器,无异常孕育史；均在出现流产征兆后未进行任何药物治疗而就诊的早期自然流产患者，其中先兆流产9例、难免流产8例、不全流产6例、完全流产2例。两组年龄分别为(29.9±0.9)岁、(26.8±0.5)岁，孕周为(7.3±0.2)和(7.9±0.3)周，孕次为(1.8±0.1)和(1.4±0.1)次，产次为(0.6±0.1)和(0.4±0.1)次。
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2.方法:(1)标本采集及细胞分离:以无菌方式刮取蜕膜组织,经含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶的消化液处理后收集混合单个细胞悬液,以淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,加至常规RPMI-1640完全培养液中,贴壁孵育。(2)淋巴细胞计数：将两组各10例的混合单个细胞制成涂片,经HE染色,油镜下观察蜕膜组织中的细胞类型,计算淋巴细胞所占百分率。(3)淋巴细胞转化率测定：采用刀豆蛋白A(ConA)刺激非贴壁淋巴细胞(两组各10例)72小时后,取沉淀细胞制成涂片,再经HE染色,油镜下观察淋巴细胞转化情况,计算淋巴细胞转化率。(4)IL-2检测:两组均进行检测。经ConA刺激淋巴细胞48小时后,收获培养上清液,即为待检IL-2样品。取6～8周龄C57BL/6小鼠的脾细胞,经ConA诱导制备脾淋巴母细胞作为IL-2反应细胞,与IL-2待测样品共同孵育,一式3份,并包括阴性对照、培养液对照、ConA对照及阳性对照。48小时后,加入氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，继续培养6小时,将细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上,放入闪烁测量瓶中,以FJ-2115型自动β闪烁液计数仪测定掺入3H-TdR的每分脉冲数(CPM)，判定检测样品中IL-2的活性。
, 百拇医药
3.统计学方法: 所有数据以x±s表示；进行方差齐性检验后,采用成组设计两样本均数比较的t或t′检验及直线相关分析。
二、结果
两组蜕膜中均含有大量的淋巴细胞,其中，流产组淋巴细胞百分率[(63.3±2.2)%]及淋巴细胞转化率[(69.0±3.5)%]皆显著高于对照组[(56.1±3.5)%、(52.0±3.9)%，P<0.01]，IL-2活性[(6092.2±821.2)CPM]亦明显强于对照组(3909.2±472.3)CPM，P<0.01]，且IL-2活性与淋巴细胞转化率之间存在显著的直线正相关关系(P<0.01)。
三、讨论
在正常妊娠过程中，蜕膜组织中的淋巴细胞缺乏活化识别结构,在功能上仍处于休止状态[2]。本实验结果显示,不明原因早期自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率及其诱生IL-2的活性均显著升高，提示在某种刺激因素的作用下,自然流产患者蜕膜中的淋巴细胞可能处于高激活状态,使得活化的淋巴细胞分泌较多的IL-2,促进蜕膜组织中γ干扰素(INF-γ)等细胞因子的产生,增强细胞表面粘附分子的表达，通过诱导休止期T淋巴细胞活化,抑制蜕膜分泌生长因子,直接影响滋养层的发育,刺激子宫收缩,改变蜕膜大颗粒淋巴细胞的自然杀伤细胞活性等途径,使母体对胎儿产生免疫攻击,并抑制胚胎的发育,最终引发自然流产[3]。因此，妊娠早期体内淋巴细胞增殖及其产生IL-2活性的异常上调，可能是导致流产发生的免疫学发病机理之一。
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目前,临床上对于首次发生流产的患者,尚缺乏预知性。另外,由于导致不明原因早期流产的病因较复杂,虽然主动及被动免疫治疗已取得了一定的成功,但治疗机理并不十分明确[4]，研讨自然流产患者蜕膜组织中淋巴细胞功能的变化,摸索孕早期外周血淋巴细胞的相应改变，将有助于流产的防治。而对于已发生过流产的患者,特别是习惯性流产者，应留取蜕膜组织进行免疫学直接检测,以确定不同患者各自的主要免疫学致病因素,有针对性地采取适当的保胎措施,可避免预防和治疗中的盲目性。
参考文献
1 Mincheva-Nilsson L, Kling M,Hammarstrom S,et al. Gama, delta T cells of human early pregnancy decidua: evidence for local proliferation, phenotypic heterogeneity, and extrathymic differentiation. J Immunol, 1997,159:3266-3277.
, 百拇医药
2 Slukvin II,Chernyshov VP,Merkulova AA,et al.Differential expression of adhesion and homing molecules by human decidual and peripheral blood lymphocytes in early preg- nancy. Cell Immunol,1994,158:29-45.
3 Burrows TD,King A, Loke YW. Expression of adhesion molecules by human decidual large granular lymphocytes.Cell Immunol, 1993,147:81-94.
4 陈庆华,林其德,赵爱民,等.主动免疫治疗原因不明性习惯性流产患者的子代随访结果.中华妇产科杂志,1997,32:44-45.
(收稿：1998-07-16 修回：1999-03-11), 百拇医药