饮用水有机浓集物对大鼠黄体细胞的毒性研究
作者：李宏霞 田怀军 吴德生 刘科亮 刘贵平
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：饮用水；有机浓集物；黄体细胞；孕酮
卫生研究000306 摘要：采用胰酶消化法建立了大鼠黄体细胞体外分离方法。在整个操作过程中，黄体细胞存活率均在95%以上。研究结果表明：孕期14～20天大鼠、黄体细胞密度106个/ml、培养时间4小时是适宜的体外分离培养条件。在对某市自来水厂氯化饮用水有机浓集物(每孔相当于500、1000、3000、5000ml自来水)进行毒性测试时发现：各试验浓度组均可使黄体细胞孕酮分泌量显著增加(P<0.01)，呈现出明显的剂量-效应关系。故认为氯化饮用水有机浓集物可导致大鼠黄体细胞孕酮分泌量显著增加，从而影响黄体细胞的正常生理功能。
中图分类号：R123.1 TU991.21 R994.6 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)03-0143-02
Toxic effect of organic extracts of drinking-water
on the culture luteal cells of rats
Li Hongxia, Tian Huaijun, Wu Desheng, Liu Keliang, et al.
(School of Public Health, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,China)
Abstract：A separation method of rat luteal cells was established. The results show that the survival rate of the cells is more than 95% during the whole operation. 14～20 days of pregnancy,106 cells/ml and 4 hours of culture are the suitable conditions. The organic extracts of drinking-water produced significant dose-related increases(maximally three-fold) in progesterone concentration in the culture medium. Thus, the effects produced by the organic extracts of drinking-water in vitro may reflect the damage to the luteal cells.
, 百拇医药
Key words:drinking-water, organic extracts, luteal cells, progesterone
近年来，人群中性功能异常、不育、受孕率下降等生殖障碍的发生不断增加，这与环境中化学物质污染日益严重不无关系。
国内外学者对氯化饮用水进行了详细的分析，已从中检出数千种有机物质，并已证明苯、邻苯二甲酸二丁酯、六六六、DDT等数十种物质具有明显的生殖毒性[1]。流行病学调查也发现氯化饮用水与多种癌症发病率增加、流产增加及男性生育力降低有关[2]。
在建立大鼠黄体细胞体外分离培养方法的基础上本文研究了氯化饮用水有机浓集物对大鼠黄体细胞的毒性效应。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 试剂 D-Hanks液(NaCl 4.00g；KCl 0.20g；Na2HPO4*H2O 0.03g；KH2PO4 0.03g；NaHCO3 0.17g；酚红 0.01g，定容至1升，灭菌保存)。2.5 g/L胰蛋白酶(称取1∶250胰蛋白酶0.25g，用D-Hanks液定容至100ml，置4℃冰箱过夜，次日用滤纸过滤，调节pH至7.2～7.4，灭菌保存)。Eagle液(3.575 g Hepes、相应量的MEM培养基、溶于1000 ml三蒸水中，调节pH至7.0～7.2，灭菌保存，临用时加10%小牛血清，8×105IU/ml苄青霉素钠、100mg硫酸链霉素)。饮用水有机浓集物来自某市自来水二厂出厂水。
1.1.2 器材 YJ-1450SA医用净化工作台，WJ-2型CO2细胞培养箱，SH-82型水浴恒温振荡器，800型离心沉淀器，GDX-102树脂。
, 百拇医药
1.1.3 实验动物 受孕14～20天雌性Wistar大鼠，受孕时体重180～220g，由华西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 饮用水有机浓集物的制备 选用GDX-102树脂吸附水中有机物。使用前分别用重蒸甲醇、丙酮、二氯甲烷依次洗脱8小时备用。水样过柱流速为3倍柱体积/分钟，用二氯甲烷洗脱树脂柱，30～35℃减压浓缩至2ml时，取0.2ml用于GC/MS分析，余下挥干，再用二甲基亚砜定容至9ml，使1ml浓集物相当于100L自来水。
1.2.2 大鼠黄体细胞体外分离培养方法的建立 选用孕期14～20天雌性大鼠，脱颈椎处死后无菌取出双侧卵巢，称重，放入盛有少量D-Hanks液的平皿中，剪碎，加入2.5g/L胰蛋白酶溶液(10ml/g黄体组织)消化30min(37℃水浴振荡)，过滤、离心、弃上清液，用适量Eagle液重新悬浮细胞，计数细胞密度并将其调至所需密度。用0.01%台盼兰染色计数细胞活度。将细胞悬液分装于24孔细胞培养板内(1ml/孔)，置于5%CO2、95%空气、37℃培养箱内。一定时间后在倒置显微镜下观察细胞生长情况，放免法测定培养液中孕酮含量。每个样本作4个平行孔。
, 百拇医药
实验观察如下内容：①黄体细胞密度与孕酮分泌量的关系：取14天孕鼠，细胞密度为0.25×106、0.50×106、1.00×106个/ml，培养4小时。②培养时间与黄体细胞孕酮分泌量的关系：14天孕鼠，细胞密度为106个/ml，培养时间为2、4、7小时。③不同孕期对大鼠黄体细胞孕酮分泌量的影响：细胞密度为106个/ml，培养时间4小时，孕期为14、20天。
1.2.3 氯化饮用水有机浓集物对大鼠黄体细胞的毒性研究 孕鼠孕期20天，细胞密度106个/ml，每孔加入0.1ml不同浓度的氯化饮用水有机浓集物，使每孔相当于500、1000、3000、5000ml自来水，培养时间4小时。观察细胞生长情况，测定培养液中孕酮含量。每个剂量组作4个平行样。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 不同孕期、培养时间及黄体细胞密度与孕酮分泌量的关系
表1 不同孕期、培养时间及黄体细胞密度与孕酮分泌量 孕期(天)
孕酮浓度
(μg/L)
培养时间
(h)
孕酮浓度
(μg/L)
细胞密度
(106/ml)
孕酮浓度
, http://www.100md.com
(μg/L)
14
12.73±0.21
2
6.43±1.09
0.25
2.95±0.68
20
22.40±0.84
4
12.73±0.21
0.50
, http://www.100md.com 6.40±3.36
7
5.30±0.74
1.00
12.73±0.21
表1显示：随着黄体细胞密度的增加，孕酮浓度也增加，二者呈明显的正相关，相关系数r=0.9998。在4小时内，随着时间的延长，孕酮含量增加；在7小时时，孕酮含量显著下降。受孕14及20天的孕鼠黄体细胞均有旺盛的分泌功能，均可用于体外黄体细胞的分离培养。在黄体细胞的分离培养过程中观察到：胰酶消化法是一种简便有效的体外分离黄体细胞的方法，细胞分离完毕后存活率在95%以上。细胞分装于培养板各孔后有一段平衡期，培养2小时后细胞开始繁殖；4小时生长良好；7小时可见有死亡细胞漂浮于培养液中。
2.2 氯化饮用水有机浓集物对黄体细胞的毒性效应
, http://www.100md.com
表2 氯化饮用水有机浓集物对黄体细胞的毒性效应(
±s) 有机浓集物相当的水量
(ml/孔)
孕酮浓度
(μg/L)
0
22.40±0.84
500
29.14±2.42(1)
1000
33.35±3.38(1)
, http://www.100md.com
3000
41.79±7.44
5000
67.48±9.27(1)
注：(1)与对照组比较P<0.01 表2显示随着氯化饮用水有机浓集物的增加，黄体细胞孕酮分泌量亦增加，与对照组比较，均有显著意义(P<0.01)，且呈现出明显的剂量-效应关系。
3 讨论
实验结果显示：胰蛋白酶消化法是一种简便而有效的体外分离培养大鼠黄体细胞的方法，其适宜条件为：14～20天的大鼠、细胞密度106个/ml、培养时间4小时。
本研究结果还表明：该自来水厂的氯化饮用水有机浓集物可促进黄体细胞分泌孕酮，并呈剂量-效应关系，说明该有机浓集物对体外培养系统中的黄体细胞具有一定的毒性效应。田怀军等曾对该市氯化饮用水有机污染物进行了气-质联机(GC/MS)分析，结果表明该市氯化饮用水中含有酯类、脂肪酸、卤化物、烷烃、多环芳烃、杂环化合物、酮、酚、胺等有机物，且邻苯二甲酸酯类含量相对较高[3]。推测本实验结果与饮用水有机物污染有关，但其机理还有待进一步研究。
, 百拇医药
作者简介：李宏霞，女，硕士，讲师
参考文献
1，WHO.Guidelines for drinking water quality. Vol 2. 2nd ed.Geneva:WHO,1996,530—540
2，David AS, Kurtis WA, Lisa MP.Drinking water and pregnancy outcome in central North Carolina:source, amount, and trihalomethane levels. Environ Health Perspect,1995,103(6):592—596
3，田怀军，吴德生，黎源倩，等.某市饮用水源水、出厂水中污染GC/MS定性分析.现代预防医学，1999，26(2)：133—136
(1999-09-06收稿), 百拇医药
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：饮用水；有机浓集物；黄体细胞；孕酮
卫生研究000306 摘要：采用胰酶消化法建立了大鼠黄体细胞体外分离方法。在整个操作过程中，黄体细胞存活率均在95%以上。研究结果表明：孕期14～20天大鼠、黄体细胞密度106个/ml、培养时间4小时是适宜的体外分离培养条件。在对某市自来水厂氯化饮用水有机浓集物(每孔相当于500、1000、3000、5000ml自来水)进行毒性测试时发现：各试验浓度组均可使黄体细胞孕酮分泌量显著增加(P<0.01)，呈现出明显的剂量-效应关系。故认为氯化饮用水有机浓集物可导致大鼠黄体细胞孕酮分泌量显著增加，从而影响黄体细胞的正常生理功能。
中图分类号：R123.1 TU991.21 R994.6 文献标识码：A
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文章编号：1000-8020(2000)03-0143-02
Toxic effect of organic extracts of drinking-water
on the culture luteal cells of rats
Li Hongxia, Tian Huaijun, Wu Desheng, Liu Keliang, et al.
(School of Public Health, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,China)
Abstract：A separation method of rat luteal cells was established. The results show that the survival rate of the cells is more than 95% during the whole operation. 14～20 days of pregnancy,106 cells/ml and 4 hours of culture are the suitable conditions. The organic extracts of drinking-water produced significant dose-related increases(maximally three-fold) in progesterone concentration in the culture medium. Thus, the effects produced by the organic extracts of drinking-water in vitro may reflect the damage to the luteal cells.
, 百拇医药
Key words:drinking-water, organic extracts, luteal cells, progesterone
近年来，人群中性功能异常、不育、受孕率下降等生殖障碍的发生不断增加，这与环境中化学物质污染日益严重不无关系。
国内外学者对氯化饮用水进行了详细的分析，已从中检出数千种有机物质，并已证明苯、邻苯二甲酸二丁酯、六六六、DDT等数十种物质具有明显的生殖毒性[1]。流行病学调查也发现氯化饮用水与多种癌症发病率增加、流产增加及男性生育力降低有关[2]。
在建立大鼠黄体细胞体外分离培养方法的基础上本文研究了氯化饮用水有机浓集物对大鼠黄体细胞的毒性效应。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 试剂 D-Hanks液(NaCl 4.00g；KCl 0.20g；Na2HPO4*H2O 0.03g；KH2PO4 0.03g；NaHCO3 0.17g；酚红 0.01g，定容至1升，灭菌保存)。2.5 g/L胰蛋白酶(称取1∶250胰蛋白酶0.25g，用D-Hanks液定容至100ml，置4℃冰箱过夜，次日用滤纸过滤，调节pH至7.2～7.4，灭菌保存)。Eagle液(3.575 g Hepes、相应量的MEM培养基、溶于1000 ml三蒸水中，调节pH至7.0～7.2，灭菌保存，临用时加10%小牛血清，8×105IU/ml苄青霉素钠、100mg硫酸链霉素)。饮用水有机浓集物来自某市自来水二厂出厂水。
1.1.2 器材 YJ-1450SA医用净化工作台，WJ-2型CO2细胞培养箱，SH-82型水浴恒温振荡器，800型离心沉淀器，GDX-102树脂。
, 百拇医药
1.1.3 实验动物 受孕14～20天雌性Wistar大鼠，受孕时体重180～220g，由华西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 饮用水有机浓集物的制备 选用GDX-102树脂吸附水中有机物。使用前分别用重蒸甲醇、丙酮、二氯甲烷依次洗脱8小时备用。水样过柱流速为3倍柱体积/分钟，用二氯甲烷洗脱树脂柱，30～35℃减压浓缩至2ml时，取0.2ml用于GC/MS分析，余下挥干，再用二甲基亚砜定容至9ml，使1ml浓集物相当于100L自来水。
1.2.2 大鼠黄体细胞体外分离培养方法的建立 选用孕期14～20天雌性大鼠，脱颈椎处死后无菌取出双侧卵巢，称重，放入盛有少量D-Hanks液的平皿中，剪碎，加入2.5g/L胰蛋白酶溶液(10ml/g黄体组织)消化30min(37℃水浴振荡)，过滤、离心、弃上清液，用适量Eagle液重新悬浮细胞，计数细胞密度并将其调至所需密度。用0.01%台盼兰染色计数细胞活度。将细胞悬液分装于24孔细胞培养板内(1ml/孔)，置于5%CO2、95%空气、37℃培养箱内。一定时间后在倒置显微镜下观察细胞生长情况，放免法测定培养液中孕酮含量。每个样本作4个平行孔。
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实验观察如下内容：①黄体细胞密度与孕酮分泌量的关系：取14天孕鼠，细胞密度为0.25×106、0.50×106、1.00×106个/ml，培养4小时。②培养时间与黄体细胞孕酮分泌量的关系：14天孕鼠，细胞密度为106个/ml，培养时间为2、4、7小时。③不同孕期对大鼠黄体细胞孕酮分泌量的影响：细胞密度为106个/ml，培养时间4小时，孕期为14、20天。
1.2.3 氯化饮用水有机浓集物对大鼠黄体细胞的毒性研究 孕鼠孕期20天，细胞密度106个/ml，每孔加入0.1ml不同浓度的氯化饮用水有机浓集物，使每孔相当于500、1000、3000、5000ml自来水，培养时间4小时。观察细胞生长情况，测定培养液中孕酮含量。每个剂量组作4个平行样。
2 结果
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表1 不同孕期、培养时间及黄体细胞密度与孕酮分泌量 孕期(天)
孕酮浓度
(μg/L)
培养时间
(h)
孕酮浓度
(μg/L)
细胞密度
(106/ml)
孕酮浓度
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(μg/L)
14
12.73±0.21
2
6.43±1.09
0.25
2.95±0.68
20
22.40±0.84
4
12.73±0.21
0.50
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7
5.30±0.74
1.00
12.73±0.21
表1显示：随着黄体细胞密度的增加，孕酮浓度也增加，二者呈明显的正相关，相关系数r=0.9998。在4小时内，随着时间的延长，孕酮含量增加；在7小时时，孕酮含量显著下降。受孕14及20天的孕鼠黄体细胞均有旺盛的分泌功能，均可用于体外黄体细胞的分离培养。在黄体细胞的分离培养过程中观察到：胰酶消化法是一种简便有效的体外分离黄体细胞的方法，细胞分离完毕后存活率在95%以上。细胞分装于培养板各孔后有一段平衡期，培养2小时后细胞开始繁殖；4小时生长良好；7小时可见有死亡细胞漂浮于培养液中。
2.2 氯化饮用水有机浓集物对黄体细胞的毒性效应
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表2 氯化饮用水有机浓集物对黄体细胞的毒性效应(
±s) 有机浓集物相当的水量(ml/孔)
孕酮浓度
(μg/L)
0
22.40±0.84
500
29.14±2.42(1)
1000
33.35±3.38(1)
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3000
41.79±7.44
5000
67.48±9.27(1)
注：(1)与对照组比较P<0.01 表2显示随着氯化饮用水有机浓集物的增加，黄体细胞孕酮分泌量亦增加，与对照组比较，均有显著意义(P<0.01)，且呈现出明显的剂量-效应关系。
3 讨论
实验结果显示：胰蛋白酶消化法是一种简便而有效的体外分离培养大鼠黄体细胞的方法，其适宜条件为：14～20天的大鼠、细胞密度106个/ml、培养时间4小时。
本研究结果还表明：该自来水厂的氯化饮用水有机浓集物可促进黄体细胞分泌孕酮，并呈剂量-效应关系，说明该有机浓集物对体外培养系统中的黄体细胞具有一定的毒性效应。田怀军等曾对该市氯化饮用水有机污染物进行了气-质联机(GC/MS)分析，结果表明该市氯化饮用水中含有酯类、脂肪酸、卤化物、烷烃、多环芳烃、杂环化合物、酮、酚、胺等有机物，且邻苯二甲酸酯类含量相对较高[3]。推测本实验结果与饮用水有机物污染有关，但其机理还有待进一步研究。
, 百拇医药
作者简介：李宏霞，女，硕士，讲师
参考文献
1，WHO.Guidelines for drinking water quality. Vol 2. 2nd ed.Geneva:WHO,1996,530—540
2，David AS, Kurtis WA, Lisa MP.Drinking water and pregnancy outcome in central North Carolina:source, amount, and trihalomethane levels. Environ Health Perspect,1995,103(6):592—596
3，田怀军，吴德生，黎源倩，等.某市饮用水源水、出厂水中污染GC/MS定性分析.现代预防医学，1999，26(2)：133—136
(1999-09-06收稿), 百拇医药