转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的表达和意义
作者：张 莹 张 郁 金 岩
单位：第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032
关键词：牙胚发育；转化生长因子β受体；免疫组化
转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的表达和意义 摘要 目的：探讨转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达和对牙胚发育的影响。方法：建立小鼠牙胚发育模型，用免疫组织化学检测转化生长因子βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)、Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)、Ⅲ型受体(TβR-Ⅲ)在牙胚发育中的表达。结果：转化生长因子βⅠ型受体、Ⅱ型受体在牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状期以及硬组织形成期均有表达，且随着成釉细胞和成牙本质细胞的逐渐成熟，表达增加，其中Ⅰ型受体比Ⅱ型受体表达量多，Ⅲ型受体仅在蕾状期的成釉器上皮和钟状期的内外釉上皮、牙囊有弱表达。结论：转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达与成釉细胞、成牙本质细胞的分化密切相关。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0011-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：11]
The expression and effect of TGF-β receptors in tooth development
Zhang Ying, Zhang Yu, Jin Yan
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To observe the expression and effect of TGF-β receptors in tooth development. Methods: Establish model of mouse tooth development and examine TβR-Ⅰ,TβR-Ⅱand TβR-Ⅲ by immunohistochemical technique. Results: TβR-Ⅰwas found more intense staining than TβR-Ⅱin tooth bud、cap、 bell and hard tissue morphogenesis stages. TβR-Ⅲ was found only fewer positive cell in the epithelia of the tooth bud and inner and outer enamel epithelia and sac cell of the bell stage. Conclusion: Temporary and spatial expression of TGF-β receptors were closely related with differentiation of ameloblast and odontoblast.
, 百拇医药
Key words tooth development；TGF-β receptors；immunohistochemistry
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):11]
转化生长因子-β超家族成员(TGF-βs)在牙胚发育过程中起诱导和调节作用，有研究表明TGF-βs参与牙胚发生过程中的细胞分化，它们是通过细胞膜受体发挥作用的。有关TGF-βs受体在牙胚发育过程中的作用研究较少,本实验的目的是探讨TGF-βs受体在牙胚发育过程中的时空表达和TGF-βs参与牙胚发育的作用机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源
选昆明种小鼠(第四军医大学动物中心)，雌性10只，雄性5只，体、性成熟后以2：1雌雄同笼，同笼后第一天观察阴栓为第0天，选14d(蕾状期)、15d(帽状期)、18d(钟状早期)、生后1d(前期牙本质生成)4个时间点的胎鼠及新生小鼠头部，40g/L多聚甲醛4℃固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备5μm厚连续切片，研究下颌第一磨牙牙胚情况。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组化主要试剂
TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、TβR-Ⅲ均为多克隆抗体(工作液，博士德公司)。SP试剂盒(美国Zymed公司)。DAB试剂盒(中山公司)。
1.3 免疫组化染色
采用SP法，切片脱蜡至水，3ml/L H2O2室温下10min以消除内源性过氧化物酶，1g/L胰蛋白酶消化，正常羊血清孵育30min，滴加一抗(工作液)，4℃湿盒过夜，37℃复温1h，滴加生物素化二抗(1：100)，37℃孵育30min，酶结合物(1：100)37℃孵育30min，DAB显微镜下控制显色。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。阳性对照用乳腺癌组织，阴性对照用PBS代替一抗，苏木精复染，常规脱水，二甲苯透明，封片。
2 结果
, http://www.100md.com
转化生长因子-β超家族成员的3种受体(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)的染色部位位于细胞膜和细胞浆。本组观察到在牙胚发育的蕾状期,TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在整个成釉器上皮细胞呈阳性，周围的间充质细胞呈弱阳性(图1)，TβR-Ⅲ在成釉器上皮呈弱阳性(图2)。在帽状期TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在内釉上皮为阳性，在星网状层和周围的间充质细胞为弱阳性或阴性(图3)，TβR-Ⅲ呈阴性。在钟状早期，成釉器，牙乳头细胞开始出现分化,但尚未分泌硬组织基质, 内釉上皮、牙乳头细胞尚未分化为成熟的成釉细胞和成牙本质细胞，TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在前成釉细胞、外釉上皮细胞、中间层细胞、牙囊细胞、前成牙本质细胞为阳性，在星网状层和牙乳头细胞为阴性(图4)，TβR-Ⅲ在前成釉细胞、外釉上皮细胞和牙囊细胞为弱阳性，在星网状层和牙乳头细胞为阴性。硬组织形成期(生后1d)，内釉上皮细胞和牙乳头细胞在牙齿的生长中心分化成熟，TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在成釉细胞、内釉上皮细胞、外釉上皮细胞、中间层细胞以及正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞、牙囊细胞呈强阳性，成釉器附近的牙乳头细胞阳性，在星网状层阴性(图5)。TβR-Ⅲ在整个牙胚中均为阴性。其中TβR-Ⅰ在各时间点的表达均比TβR-Ⅱ强。
, 百拇医药
图1 蕾状期 TβR-Ⅰ在整个成釉器上皮细胞呈阳性，周围的间充质细胞呈弱阳性 40×6.7
图2 蕾状期 TβR-Ⅲ在成釉器上皮呈弱阳性,周围的间充质细胞呈阴性 40×6.7
图3 帽状期 TβR-Ⅰ在内釉上皮为阳性，星网状层和周围的间充质细胞为弱阳性 40×3.3
, 百拇医药
图4 钟状早期 TβR-Ⅱ在前成釉细胞、中间层细胞、前成牙本质细胞为阳性，星网状层和牙乳头细胞为阴性 40×3.3
图5 硬组织形成期 TβR-Ⅰ在成釉细胞、中间层细胞及正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞呈强阳性，成釉器附近的牙乳头细胞阳性，星网状层阴性 40×6.7
3 讨论
牙胚的发育起源于外胚层(牙板)与外胚间充质的相互作用，经过蕾状期、帽状期、钟状期、硬组织形成期等一系列过程逐步发育成熟，上皮与间质的相互诱导作用调节牙齿发育的各个阶段。尽管这种相互诱导的分子学机理还未完全搞清，但大量研究表明TGF-βs参与了牙胚的发生、发展和成熟过程[1，2]。
, 百拇医药
TGF-βs功能的发挥与TGF-βs受体的类型和分布是密切相关的，目前已发现三种TGF-β受体。TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ属于跨膜的丝氨酸-苏氨酸激酶，参与TGF-β信号转导，TGF-β首先与TβR-Ⅱ结合，再激活TβR-Ⅰ，形成受体复合物，将信号转导进细胞内。TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ对介导TGF-β的信号转导是缺一不可的, TβR-Ⅲ不直接参与信号转导，但有浓集TGF-β的作用，能间接调节TGF-β的作用[3]。免疫组化结果表明蕾状期成釉器细胞TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ均为阳性，与Iseki的研究结果一致[4]，表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体参与了成釉器的发生，到了帽状期，随着细胞分化的开始，阳性细胞主要集中在成釉器的周边部位，而成釉器的中心部位染色明显变弱，周围的间充质细胞呈弱阳性或阴性，这提示TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体可能与成釉器星网状层的分化有密切关系。牙胚发育至钟状早期，内釉上皮开始成熟，但尚未出现高柱状的成釉细胞，成牙本质细胞也尚未出现极化，此时前成釉细胞、内釉上皮、外釉上皮、前成牙本质细胞TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体均表现阳性，染色比蕾状期和帽状期明显变强，但只有到了硬组织形成期，正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞和分化成熟的成釉细胞、内釉上皮、外釉上皮细胞、中间层细胞以及牙囊细胞染色变为强阳性，而牙乳头细胞染色较弱，星网状层为阴性，表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体参与了牙胚发生的全过程，且随着成釉器和成牙本质细胞的功能分化表达逐渐增强。Cam等认为在前期成牙本质细胞和内釉上皮细胞 TGF-β1多肽表达较弱，而在分化成熟、具有分泌牙本质基质功能的成牙本质细胞中TGF-β1多肽表达增强[5]，本组结果表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体的表达基本上与TGF-β1的表达一致，从受体水平上证明了TGF-β1参与牙胚发育的作用机制。另外，本组TβR-Ⅰ在各时间点的表达均比TβR-Ⅱ强，其原因可能是Ⅰ型受体所占比例较大，虽然绝大多数细胞都有此两种受体，但比例不同，对TGF-β的反应性也大不相同[3]。Cam1997年报道前期成釉细胞表达TβR-Ⅲ[5]，本组观察到TβR-Ⅲ在蕾状期牙胚的成釉器上皮和钟状期牙胚的内、外釉上皮、牙囊细胞呈弱阳性表达，表明TβR-Ⅲ也可能参与了牙胚的发育和成熟，但未起主要作用。
, 百拇医药
揭示TGF-βs受体在牙胚发育过程中的表达对了解TGF-βs在牙胚发育过程中的作用机理具有重要意义，生长因子作用的发挥一方面依赖于自身分泌水平的高低，另一方面受体的表达及分布对生长因子功能的发挥也起着重要的调节作用。若TβR-Ⅰ水平不变，提高TβR-Ⅱ的表达水平则降低对TGF-β的敏感性，相反TβR-Ⅱ水平不变，提高TβR-Ⅰ的表达水平则增加了对TGF-β的敏感性[6]。TGF-βs通过细胞膜受体将信号转导进细胞内又启动了哪些转录因子参与细胞分化还有待于进一步研究。
参考文献
1 Thesleff I , Vaahtokari A , Vainio S et al. Molecular mechanisms of cell and tissue interactions during early tooth development. Anat Rec,1996,245(2):151
, 百拇医药
2 Martin A, Unda F J , Begue-kirn C et al. Effects of aFGF, bFGF, TGFβ1 and IGF-1 on odontoblast differentiation in vitro. Eur J Oral Sci ,1998,106(suppl 1):117
3 李京红 综述. 转化生长因子β受体研究进展. 国外医学生理、病理科学与临床分册, 1998,18：28
4 Iseki S,Osumi Y, Miyazono K et al. Localization of transforming growth factor-β tyte Ⅰ and tyte Ⅱ receptors in mouse development. Exlp.Cel Res,1995,219:339
5 Cam Y ,Lesot H ,Colosetti P et al. Distribution of transforming growth factorβ1binding protein and low-affinity receptors during odontoblast differentiation in the mouse. Archs Oral Biol,1997,42:385
6 刘化驰 综述. 转化生长因子β受体的研究进展. 国外医学分子生物学分册, 1998.20.114
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032
关键词：牙胚发育；转化生长因子β受体；免疫组化
转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的表达和意义 摘要 目的：探讨转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达和对牙胚发育的影响。方法：建立小鼠牙胚发育模型，用免疫组织化学检测转化生长因子βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)、Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)、Ⅲ型受体(TβR-Ⅲ)在牙胚发育中的表达。结果：转化生长因子βⅠ型受体、Ⅱ型受体在牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状期以及硬组织形成期均有表达，且随着成釉细胞和成牙本质细胞的逐渐成熟，表达增加，其中Ⅰ型受体比Ⅱ型受体表达量多，Ⅲ型受体仅在蕾状期的成釉器上皮和钟状期的内外釉上皮、牙囊有弱表达。结论：转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达与成釉细胞、成牙本质细胞的分化密切相关。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0011-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：11]
The expression and effect of TGF-β receptors in tooth development
Zhang Ying, Zhang Yu, Jin Yan
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To observe the expression and effect of TGF-β receptors in tooth development. Methods: Establish model of mouse tooth development and examine TβR-Ⅰ,TβR-Ⅱand TβR-Ⅲ by immunohistochemical technique. Results: TβR-Ⅰwas found more intense staining than TβR-Ⅱin tooth bud、cap、 bell and hard tissue morphogenesis stages. TβR-Ⅲ was found only fewer positive cell in the epithelia of the tooth bud and inner and outer enamel epithelia and sac cell of the bell stage. Conclusion: Temporary and spatial expression of TGF-β receptors were closely related with differentiation of ameloblast and odontoblast.
, 百拇医药
Key words tooth development；TGF-β receptors；immunohistochemistry
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):11]
转化生长因子-β超家族成员(TGF-βs)在牙胚发育过程中起诱导和调节作用，有研究表明TGF-βs参与牙胚发生过程中的细胞分化，它们是通过细胞膜受体发挥作用的。有关TGF-βs受体在牙胚发育过程中的作用研究较少,本实验的目的是探讨TGF-βs受体在牙胚发育过程中的时空表达和TGF-βs参与牙胚发育的作用机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源
选昆明种小鼠(第四军医大学动物中心)，雌性10只，雄性5只，体、性成熟后以2：1雌雄同笼，同笼后第一天观察阴栓为第0天，选14d(蕾状期)、15d(帽状期)、18d(钟状早期)、生后1d(前期牙本质生成)4个时间点的胎鼠及新生小鼠头部，40g/L多聚甲醛4℃固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备5μm厚连续切片，研究下颌第一磨牙牙胚情况。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组化主要试剂
TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、TβR-Ⅲ均为多克隆抗体(工作液，博士德公司)。SP试剂盒(美国Zymed公司)。DAB试剂盒(中山公司)。
1.3 免疫组化染色
采用SP法，切片脱蜡至水，3ml/L H2O2室温下10min以消除内源性过氧化物酶，1g/L胰蛋白酶消化，正常羊血清孵育30min，滴加一抗(工作液)，4℃湿盒过夜，37℃复温1h，滴加生物素化二抗(1：100)，37℃孵育30min，酶结合物(1：100)37℃孵育30min，DAB显微镜下控制显色。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。阳性对照用乳腺癌组织，阴性对照用PBS代替一抗，苏木精复染，常规脱水，二甲苯透明，封片。
2 结果
, http://www.100md.com
转化生长因子-β超家族成员的3种受体(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)的染色部位位于细胞膜和细胞浆。本组观察到在牙胚发育的蕾状期,TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在整个成釉器上皮细胞呈阳性，周围的间充质细胞呈弱阳性(图1)，TβR-Ⅲ在成釉器上皮呈弱阳性(图2)。在帽状期TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在内釉上皮为阳性，在星网状层和周围的间充质细胞为弱阳性或阴性(图3)，TβR-Ⅲ呈阴性。在钟状早期，成釉器，牙乳头细胞开始出现分化,但尚未分泌硬组织基质, 内釉上皮、牙乳头细胞尚未分化为成熟的成釉细胞和成牙本质细胞，TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在前成釉细胞、外釉上皮细胞、中间层细胞、牙囊细胞、前成牙本质细胞为阳性，在星网状层和牙乳头细胞为阴性(图4)，TβR-Ⅲ在前成釉细胞、外釉上皮细胞和牙囊细胞为弱阳性，在星网状层和牙乳头细胞为阴性。硬组织形成期(生后1d)，内釉上皮细胞和牙乳头细胞在牙齿的生长中心分化成熟，TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ在成釉细胞、内釉上皮细胞、外釉上皮细胞、中间层细胞以及正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞、牙囊细胞呈强阳性，成釉器附近的牙乳头细胞阳性，在星网状层阴性(图5)。TβR-Ⅲ在整个牙胚中均为阴性。其中TβR-Ⅰ在各时间点的表达均比TβR-Ⅱ强。
, 百拇医药
图1 蕾状期 TβR-Ⅰ在整个成釉器上皮细胞呈阳性，周围的间充质细胞呈弱阳性 40×6.7
图2 蕾状期 TβR-Ⅲ在成釉器上皮呈弱阳性,周围的间充质细胞呈阴性 40×6.7
图3 帽状期 TβR-Ⅰ在内釉上皮为阳性，星网状层和周围的间充质细胞为弱阳性 40×3.3
, 百拇医药
图4 钟状早期 TβR-Ⅱ在前成釉细胞、中间层细胞、前成牙本质细胞为阳性，星网状层和牙乳头细胞为阴性 40×3.3
图5 硬组织形成期 TβR-Ⅰ在成釉细胞、中间层细胞及正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞呈强阳性，成釉器附近的牙乳头细胞阳性，星网状层阴性 40×6.7
3 讨论
牙胚的发育起源于外胚层(牙板)与外胚间充质的相互作用，经过蕾状期、帽状期、钟状期、硬组织形成期等一系列过程逐步发育成熟，上皮与间质的相互诱导作用调节牙齿发育的各个阶段。尽管这种相互诱导的分子学机理还未完全搞清，但大量研究表明TGF-βs参与了牙胚的发生、发展和成熟过程[1，2]。
, 百拇医药
TGF-βs功能的发挥与TGF-βs受体的类型和分布是密切相关的，目前已发现三种TGF-β受体。TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ属于跨膜的丝氨酸-苏氨酸激酶，参与TGF-β信号转导，TGF-β首先与TβR-Ⅱ结合，再激活TβR-Ⅰ，形成受体复合物，将信号转导进细胞内。TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ对介导TGF-β的信号转导是缺一不可的, TβR-Ⅲ不直接参与信号转导，但有浓集TGF-β的作用，能间接调节TGF-β的作用[3]。免疫组化结果表明蕾状期成釉器细胞TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ均为阳性，与Iseki的研究结果一致[4]，表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体参与了成釉器的发生，到了帽状期，随着细胞分化的开始，阳性细胞主要集中在成釉器的周边部位，而成釉器的中心部位染色明显变弱，周围的间充质细胞呈弱阳性或阴性，这提示TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体可能与成釉器星网状层的分化有密切关系。牙胚发育至钟状早期，内釉上皮开始成熟，但尚未出现高柱状的成釉细胞，成牙本质细胞也尚未出现极化，此时前成釉细胞、内釉上皮、外釉上皮、前成牙本质细胞TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体均表现阳性，染色比蕾状期和帽状期明显变强，但只有到了硬组织形成期，正在分泌牙本质基质的成牙本质细胞和分化成熟的成釉细胞、内釉上皮、外釉上皮细胞、中间层细胞以及牙囊细胞染色变为强阳性，而牙乳头细胞染色较弱，星网状层为阴性，表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体参与了牙胚发生的全过程，且随着成釉器和成牙本质细胞的功能分化表达逐渐增强。Cam等认为在前期成牙本质细胞和内釉上皮细胞 TGF-β1多肽表达较弱，而在分化成熟、具有分泌牙本质基质功能的成牙本质细胞中TGF-β1多肽表达增强[5]，本组结果表明TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体的表达基本上与TGF-β1的表达一致，从受体水平上证明了TGF-β1参与牙胚发育的作用机制。另外，本组TβR-Ⅰ在各时间点的表达均比TβR-Ⅱ强，其原因可能是Ⅰ型受体所占比例较大，虽然绝大多数细胞都有此两种受体，但比例不同，对TGF-β的反应性也大不相同[3]。Cam1997年报道前期成釉细胞表达TβR-Ⅲ[5]，本组观察到TβR-Ⅲ在蕾状期牙胚的成釉器上皮和钟状期牙胚的内、外釉上皮、牙囊细胞呈弱阳性表达，表明TβR-Ⅲ也可能参与了牙胚的发育和成熟，但未起主要作用。
, 百拇医药
揭示TGF-βs受体在牙胚发育过程中的表达对了解TGF-βs在牙胚发育过程中的作用机理具有重要意义，生长因子作用的发挥一方面依赖于自身分泌水平的高低，另一方面受体的表达及分布对生长因子功能的发挥也起着重要的调节作用。若TβR-Ⅰ水平不变，提高TβR-Ⅱ的表达水平则降低对TGF-β的敏感性，相反TβR-Ⅱ水平不变，提高TβR-Ⅰ的表达水平则增加了对TGF-β的敏感性[6]。TGF-βs通过细胞膜受体将信号转导进细胞内又启动了哪些转录因子参与细胞分化还有待于进一步研究。
参考文献
1 Thesleff I , Vaahtokari A , Vainio S et al. Molecular mechanisms of cell and tissue interactions during early tooth development. Anat Rec,1996,245(2):151
, 百拇医药
2 Martin A, Unda F J , Begue-kirn C et al. Effects of aFGF, bFGF, TGFβ1 and IGF-1 on odontoblast differentiation in vitro. Eur J Oral Sci ,1998,106(suppl 1):117
3 李京红 综述. 转化生长因子β受体研究进展. 国外医学生理、病理科学与临床分册, 1998,18：28
4 Iseki S,Osumi Y, Miyazono K et al. Localization of transforming growth factor-β tyte Ⅰ and tyte Ⅱ receptors in mouse development. Exlp.Cel Res,1995,219:339
5 Cam Y ,Lesot H ,Colosetti P et al. Distribution of transforming growth factorβ1binding protein and low-affinity receptors during odontoblast differentiation in the mouse. Archs Oral Biol,1997,42:385
6 刘化驰 综述. 转化生长因子β受体的研究进展. 国外医学分子生物学分册, 1998.20.114
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药