检测肾综合征出血热血清IgM的ELISA捕捉一步法的建立及初步应用
作者：汤琰 程振球 王发琐 封岩 陈双红
单位：(海军医学研究所，上海 200433)
关键词：肾综合征出血热；免疫球蛋白M；ELISA捕捉一步法
海军医学杂志000206 摘要 目的：建立一种快速、简便、敏感，适合医院和基层门 诊应用的检测肾综合征出血热血清特异性IgM的方法。方法：以羊抗人μ链为包被抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-HFRS病毒特异性单克隆抗体(McAb)与HF RS病毒抗原(Ag)结合成复合物为指示标记物，建立了检测HFRS血清特异性IgM的ELISA反向捕 捉一步法。结果：整个试验过程仅需1 h，操作简便。用该法与 山东 省淄博市生产的ELISA二步法试剂盒对比检测HFRS血清60份，两法均为阳性54份，均为阴性3 份，总符合率95%。结论：ELISA捕捉一步法快速、简便、敏感，适 合医院和基层门诊应用，可用于HFRS的早期诊断及流行病学研究。
, 百拇医药
中图分类号 R446.61 文献标识码 A 文章编号 1009-07 54(2000)02-0111-04
Establishment and Initial Application of One-step Cap ture ELISA for Detecting Anti-HFRS Virus IgM in the Patient Serum
TANG Yan, CHENG Zhen-qiu, WANG Fa-suo, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To establish a rapid, simple and sensitive method of detecting anti-hemorrhagic fever with renal syndrome viru s IgM in the patient serum for hospitals and basic level clinics. Metho ds: With sheep anti-human μ chain as coating antibodies, and the co mpound of anti-HFRS virus specific McAb labeled with HRP and HFRS viral antigen (Ag) as a tracer. One-step capture ELISA of detecting anti-HFRS virus IgM was developed. Results: The whole procedure was finished in o ne hour and the manipulation was simple. The total coincidence rate of the r esul ts of simultaneous determination of 60 serum samples by two-step capture EL ISA made in Zhibo, Shandong and one-step capture ELISA was 95%. Each method pro duced 54 positive results and 3 negative results. Conclusion: One- step capture ELISA, simple, rapid and sensitive, is applicable to hospitals and basic level clinics. It could be used for early diagnosis of hemorrhagic fever w ith renal syndrome and for epidemioligical studies.
, 百拇医药
Key words hemorrhagic fever with renal syndrome; immu noglobulin M; one-step capture ELISA
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是一种常见的人畜 共患病，在各种病毒性出血热中，HFRS是世界上分布最广、发病数量最多、危害最大的一种 。我国是世界上受HFRS危害最严重的国家，HFRS发病数占世界总发病数的90%以上。尽管198 7年后发病率有所下降，但进入90年代，年发病数仍波动在4万至6万这一较高水平[1 ]。由于该病发病急骤，死亡率很高，战争爆发时，敌方有可能利用HFRS病毒作为生物战 剂来削弱对方的战斗力，所以，早期明确诊治直接关系我军的战略部署及患者的预后。为了 能对该病早期作出确切诊断，本研究室以羊抗人μ链抗体包被，以酶标记的抗-HFRS病毒McA b与HFRS病毒抗原结合成复合物为指示标记物，建立了检测抗-HFRS病毒血清IgM的ELISA捕捉 一步法，检测简便快速，灵敏特异，效果满意。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
羊抗人μ链抗体：购于Sigma公司；抗肾综合征出血热单克隆抗体：购于北京病毒研究所； 抗肾综合征出血热病毒抗原：购于卫生部生物制品检定所；辣根过氧化物酶：上海丽珠东风 生物有限公司；肾综合征出血热血清IgM ELISA试剂盒：购于上海市传染病医院，由山东省 淄博市生产；血清标本：由山东省平邑县和莒南县人民医院传染科及西安第四军医大学附属 医院传染科提供。
1.2 实验方法
1.2.1 酶标抗体的制备[2]：取辣根过氧化物酶(HRP)5 mg加双蒸水0.5 ml及60 m mol /L NaIO4 0.5 ml反应20 min，再加0.16 mol/L乙二醇0.5 ml反应50 min，然后再加 HFRS病毒M cAb 0.5 ml，装透析袋对Na2CO3包被液透析过夜，吸出加5 mg/ml的KBH4 0.2 ml ，放置4 h后再装袋，对PBS(pH7.4)透析，换液4次，吸出加入甘油，置4 ℃冰箱备用 。
, 百拇医药
1.2.2 酶标抗体抗原复合物的制备：北京检定所的HFRS病毒抗原用PBS稀释成1 mg/ml后与A b-HRP混合(Ag:Ab=400:1)，置4 ℃冰箱中结合过夜。
1.2.3 肾综合征出血热血清IgM的检测：用Tris-HC1包被液稀释羊抗人μ链抗体至10 μl/m l ，包被聚苯乙烯微孔板100 μl/孔，4 ℃36 h，甩干。待检血清用生理盐水1：100稀释，50 μl/孔加入包被孔中，再直接加入Ag-Ab-HRP复合物50 μl/孔，于37 ℃恒温箱中40 min， 取出后 用洗涤液洗5遍，甩干，加底物液100 μl/孔，室温避光反应10 min，加2 mol H2SO4 50 μl/孔终止反应，用酶标检测仪测定各孔A值。
2 结 果
2.1 ELISA捕捉一步法与淄博ELISA捕捉二步法试剂盒比较 对比检测肾 综合征出血热患者血清60份，结果见表1，两法总符合率为95%，经χ2检验P>0 .05。
, 百拇医药
表1 两法检测60份患者血清抗-HFRS病毒
IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA捕捉二步法
合 计
阳 性
阴 性
阳 性
54
2
56
阴 性
1
, 百拇医药
3
4
合 计
55
5
60
2.2 ELISA捕捉一步法与ELISA间接法的比较
2.2.1 对比检测HFRS阳性与阴性血清共60份，结果见表2，两法符合率为40%，经χ2 检验P<0.05。表2 两法检测60份血清抗-HFRS病毒IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA间接法
合 计
, http://www.100md.com
阳 性
阴 性
阳 性
32
4
36
阴 性
20
4
24
合 计
52
8
60
, 百拇医药
2.2.2 对比检测同2.2.1血清60份(去除类风湿因子)，结果见表3，两法总符合率 为90%，经χ2检验P>0.05。表3 两法检测60份血清抗-HFRS病毒IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA间接法
合 计
阳 性
阴 性
阳 性
32
4
36
阴 性
, 百拇医药 2
22
24
合 计
34
26
60
2.2.3 ELISA捕捉一步法检测抗-HFRS病毒特异性IgM与IgG的比较：用羊抗人μ链包被检测 特异性IgM和用葡萄球菌A蛋白(SPA)包被检测IgG，用两法检测不同病日HFRS患者血清中特异 性IgM和IgG抗体，结果见表4。表4 不同病日抗-HFRS病毒血清IgM和IgG的检出率 病 日
IgM
IgG
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阳性数/检测数
百分 比(%)
阳性数/检 测数
百分比(%)
2～5
17/18
94
12/18
66
6～10
22/22
100
21/22
, http://www.100md.com
91
11～15
18/18
100
17/18
94
16～20
13/15
87
15/15
100
21～30
13/16
, http://www.100md.com
81
14/16
87
2.2.4 重复性试验：选择抗-HFRS病毒阳性血清3份，分别做批内和批间试验来观察它的重 复性，批内试验为每份血清做10个复孔，结果A值的平均变异系数为6.4%；批间试验为每份 血清做6次，每次间隔3d，结果A值的平均变异系数为9.8%。
2.2.5 特异性试验：用ELISA捕捉一步法检测20份乙型肝炎患者血清和20份T3、T4阳性血清 及40份健康人血清，结果抗HFRS病毒IgM抗体均为阴性。
2.2.6 阻断试验：随机抽取阳性标本20份，1：50生理盐水稀释，各取25 μl分别加入等 量HFRS病毒抗原，经抗原中和后测得的A值平均抑制率为82%。
, 百拇医药 3 讨 论
肾综合征出血热患者多见于农村、牧区、林区等医疗条件相对较差的地区，许多患者因无法 得到早期诊断而延误病情，致使死亡率很高。目前，临床上以ELISA方法检测肾综合征出血 热患者血清特异性IgM作为诊断的主要依据，而检测IgM的ELISA方法主要有间接法和反向捕 捉法，间接法以抗原包被反应孔，如果抗原不纯或血清中存在一些变异因素，很容易出现假 阳性。从表2和表3看出，类风湿因子[3]是造成假阳性的主要因素，如果去除血清 中的类风湿因子，假阳性基本消失。尽管采用某些手段也可以达到检测目的，但显得比较繁 琐，现临床很少采用间接法。本研究室建立的ELISA一步法比ELISA二步法快速、简便、敏感 ，从表4可看出特异性IgM抗体在发病2～5 d即开始出现，6～15 d达高峰。此期间用本 方法检 测抗-HFRS病毒IgM的阳性率达94%～100%，说明一步ELISA检测IgM抗体是非常灵敏特异的早 期诊断方法，对HFRS的早期诊治有重要价值。但IgM的阳性率随着病程增加而逐步下降，而 此时特异性IgG抗体阳性率却逐步增高，IgG的检测对HFRS的诊治和流行病的调查也有一定意 义。 参考文献
1，杨为松.肾综合征出血热.第1版.北京：人民军医出版社，1990.2
2，Gunther RA, Herbert RL. Highly sensitive enzyme immunoassay for hum an lymphotoxin. Journal of Immunological Methods, 1990, 130:177
3，倪若愚.特异性IgM抗体的检测及意义.中华医学检验杂志，1989， 12(2)：121
(收稿：2000-01-04), 百拇医药
单位：(海军医学研究所，上海 200433)
关键词：肾综合征出血热；免疫球蛋白M；ELISA捕捉一步法
海军医学杂志000206 摘要 目的：建立一种快速、简便、敏感，适合医院和基层门 诊应用的检测肾综合征出血热血清特异性IgM的方法。方法：以羊抗人μ链为包被抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-HFRS病毒特异性单克隆抗体(McAb)与HF RS病毒抗原(Ag)结合成复合物为指示标记物，建立了检测HFRS血清特异性IgM的ELISA反向捕 捉一步法。结果：整个试验过程仅需1 h，操作简便。用该法与 山东 省淄博市生产的ELISA二步法试剂盒对比检测HFRS血清60份，两法均为阳性54份，均为阴性3 份，总符合率95%。结论：ELISA捕捉一步法快速、简便、敏感，适 合医院和基层门诊应用，可用于HFRS的早期诊断及流行病学研究。
, 百拇医药
中图分类号 R446.61 文献标识码 A 文章编号 1009-07 54(2000)02-0111-04
Establishment and Initial Application of One-step Cap ture ELISA for Detecting Anti-HFRS Virus IgM in the Patient Serum
TANG Yan, CHENG Zhen-qiu, WANG Fa-suo, et al
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To establish a rapid, simple and sensitive method of detecting anti-hemorrhagic fever with renal syndrome viru s IgM in the patient serum for hospitals and basic level clinics. Metho ds: With sheep anti-human μ chain as coating antibodies, and the co mpound of anti-HFRS virus specific McAb labeled with HRP and HFRS viral antigen (Ag) as a tracer. One-step capture ELISA of detecting anti-HFRS virus IgM was developed. Results: The whole procedure was finished in o ne hour and the manipulation was simple. The total coincidence rate of the r esul ts of simultaneous determination of 60 serum samples by two-step capture EL ISA made in Zhibo, Shandong and one-step capture ELISA was 95%. Each method pro duced 54 positive results and 3 negative results. Conclusion: One- step capture ELISA, simple, rapid and sensitive, is applicable to hospitals and basic level clinics. It could be used for early diagnosis of hemorrhagic fever w ith renal syndrome and for epidemioligical studies.
, 百拇医药
Key words hemorrhagic fever with renal syndrome; immu noglobulin M; one-step capture ELISA
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是一种常见的人畜 共患病，在各种病毒性出血热中，HFRS是世界上分布最广、发病数量最多、危害最大的一种 。我国是世界上受HFRS危害最严重的国家，HFRS发病数占世界总发病数的90%以上。尽管198 7年后发病率有所下降，但进入90年代，年发病数仍波动在4万至6万这一较高水平[1 ]。由于该病发病急骤，死亡率很高，战争爆发时，敌方有可能利用HFRS病毒作为生物战 剂来削弱对方的战斗力，所以，早期明确诊治直接关系我军的战略部署及患者的预后。为了 能对该病早期作出确切诊断，本研究室以羊抗人μ链抗体包被，以酶标记的抗-HFRS病毒McA b与HFRS病毒抗原结合成复合物为指示标记物，建立了检测抗-HFRS病毒血清IgM的ELISA捕捉 一步法，检测简便快速，灵敏特异，效果满意。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
羊抗人μ链抗体：购于Sigma公司；抗肾综合征出血热单克隆抗体：购于北京病毒研究所； 抗肾综合征出血热病毒抗原：购于卫生部生物制品检定所；辣根过氧化物酶：上海丽珠东风 生物有限公司；肾综合征出血热血清IgM ELISA试剂盒：购于上海市传染病医院，由山东省 淄博市生产；血清标本：由山东省平邑县和莒南县人民医院传染科及西安第四军医大学附属 医院传染科提供。
1.2 实验方法
1.2.1 酶标抗体的制备[2]：取辣根过氧化物酶(HRP)5 mg加双蒸水0.5 ml及60 m mol /L NaIO4 0.5 ml反应20 min，再加0.16 mol/L乙二醇0.5 ml反应50 min，然后再加 HFRS病毒M cAb 0.5 ml，装透析袋对Na2CO3包被液透析过夜，吸出加5 mg/ml的KBH4 0.2 ml ，放置4 h后再装袋，对PBS(pH7.4)透析，换液4次，吸出加入甘油，置4 ℃冰箱备用 。
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1.2.2 酶标抗体抗原复合物的制备：北京检定所的HFRS病毒抗原用PBS稀释成1 mg/ml后与A b-HRP混合(Ag:Ab=400:1)，置4 ℃冰箱中结合过夜。
1.2.3 肾综合征出血热血清IgM的检测：用Tris-HC1包被液稀释羊抗人μ链抗体至10 μl/m l ，包被聚苯乙烯微孔板100 μl/孔，4 ℃36 h，甩干。待检血清用生理盐水1：100稀释，50 μl/孔加入包被孔中，再直接加入Ag-Ab-HRP复合物50 μl/孔，于37 ℃恒温箱中40 min， 取出后 用洗涤液洗5遍，甩干，加底物液100 μl/孔，室温避光反应10 min，加2 mol H2SO4 50 μl/孔终止反应，用酶标检测仪测定各孔A值。
2 结 果
2.1 ELISA捕捉一步法与淄博ELISA捕捉二步法试剂盒比较 对比检测肾 综合征出血热患者血清60份，结果见表1，两法总符合率为95%，经χ2检验P>0 .05。
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表1 两法检测60份患者血清抗-HFRS病毒
IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA捕捉二步法
合 计
阳 性
阴 性
阳 性
54
2
56
阴 性
1
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3
4
合 计
55
5
60
2.2 ELISA捕捉一步法与ELISA间接法的比较
2.2.1 对比检测HFRS阳性与阴性血清共60份，结果见表2，两法符合率为40%，经χ2 检验P<0.05。表2 两法检测60份血清抗-HFRS病毒IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA间接法
合 计
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阳 性
阴 性
阳 性
32
4
36
阴 性
20
4
24
合 计
52
8
60
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2.2.2 对比检测同2.2.1血清60份(去除类风湿因子)，结果见表3，两法总符合率 为90%，经χ2检验P>0.05。表3 两法检测60份血清抗-HFRS病毒IgM结果(份数) ELISA捕捉一步法
ELISA间接法
合 计
阳 性
阴 性
阳 性
32
4
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合 计
34
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2.2.3 ELISA捕捉一步法检测抗-HFRS病毒特异性IgM与IgG的比较：用羊抗人μ链包被检测 特异性IgM和用葡萄球菌A蛋白(SPA)包被检测IgG，用两法检测不同病日HFRS患者血清中特异 性IgM和IgG抗体，结果见表4。表4 不同病日抗-HFRS病毒血清IgM和IgG的检出率 病 日
IgM
IgG
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阳性数/检测数
百分 比(%)
阳性数/检 测数
百分比(%)
2～5
17/18
94
12/18
66
6～10
22/22
100
21/22
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91
11～15
18/18
100
17/18
94
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13/15
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100
21～30
13/16
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81
14/16
87
2.2.4 重复性试验：选择抗-HFRS病毒阳性血清3份，分别做批内和批间试验来观察它的重 复性，批内试验为每份血清做10个复孔，结果A值的平均变异系数为6.4%；批间试验为每份 血清做6次，每次间隔3d，结果A值的平均变异系数为9.8%。
2.2.5 特异性试验：用ELISA捕捉一步法检测20份乙型肝炎患者血清和20份T3、T4阳性血清 及40份健康人血清，结果抗HFRS病毒IgM抗体均为阴性。
2.2.6 阻断试验：随机抽取阳性标本20份，1：50生理盐水稀释，各取25 μl分别加入等 量HFRS病毒抗原，经抗原中和后测得的A值平均抑制率为82%。
, 百拇医药 3 讨 论
肾综合征出血热患者多见于农村、牧区、林区等医疗条件相对较差的地区，许多患者因无法 得到早期诊断而延误病情，致使死亡率很高。目前，临床上以ELISA方法检测肾综合征出血 热患者血清特异性IgM作为诊断的主要依据，而检测IgM的ELISA方法主要有间接法和反向捕 捉法，间接法以抗原包被反应孔，如果抗原不纯或血清中存在一些变异因素，很容易出现假 阳性。从表2和表3看出，类风湿因子[3]是造成假阳性的主要因素，如果去除血清 中的类风湿因子，假阳性基本消失。尽管采用某些手段也可以达到检测目的，但显得比较繁 琐，现临床很少采用间接法。本研究室建立的ELISA一步法比ELISA二步法快速、简便、敏感 ，从表4可看出特异性IgM抗体在发病2～5 d即开始出现，6～15 d达高峰。此期间用本 方法检 测抗-HFRS病毒IgM的阳性率达94%～100%，说明一步ELISA检测IgM抗体是非常灵敏特异的早 期诊断方法，对HFRS的早期诊治有重要价值。但IgM的阳性率随着病程增加而逐步下降，而 此时特异性IgG抗体阳性率却逐步增高，IgG的检测对HFRS的诊治和流行病的调查也有一定意 义。 参考文献
1，杨为松.肾综合征出血热.第1版.北京：人民军医出版社，1990.2
2，Gunther RA, Herbert RL. Highly sensitive enzyme immunoassay for hum an lymphotoxin. Journal of Immunological Methods, 1990, 130:177
3，倪若愚.特异性IgM抗体的检测及意义.中华医学检验杂志，1989， 12(2)：121
(收稿：2000-01-04), 百拇医药