首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准品的研制
作者：杨化新 张培培 孙磊 徐康森
单位：杨化新 张培培 孙磊 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：重组人组织纤溶酶原激活剂；纯度；效价；标准品
药物分析杂志000404 摘要 目的：建立rht-PA效价测定用国家标准品。方法：用UV法测定蛋白含量；HPSEC法分析纯度；体外凝块裂解气泡上升法测定效价；用t-PA国际标准品(86/670)对国家标准品的效价进行标定。结果：标准品的效价为每支30 000 IU，RSD=3.34%(n=10)。结论：建立的rht-PA国家标准品可用于国内同类药物的研究开发和进口药品的质控。
Establishment and Standardization of the National Reference Standard
, 百拇医药
of Recombinant Human Tissue Plasminogen Activator
Yang Huaxin Zhang Peipei Sun Lei Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective：To establish a national reference standard for rht-PA potency.Methods:The protein content,the purity and the potency of rht-PA preparation were analyzed by UV,HPSEC and the clot lysis assay,respectively,using the Second International Standard for t-PA to calibrate national reference standard of rht-PA.Results:The first national reference standard for rht-PA was established,with an assigned potency of 30 000 international units(IU) each ampoule.Conclusion:The National reference standard for rht-PA has been established.It can be useful for the development of analogous drugs produced domestically and the quality control of import medicines.
, 百拇医药
Key words rht-PA,purity,potency,reference standard▲
重组人组织纤溶酶原激活剂(rht-PA)是治疗血栓栓塞性疾病的新药，它与天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)具有相同的功效，尤其是治疗急性心肌梗塞见效快。国外已有产品上市，国内正处在研究开发阶段，并有单位准备申报新药。
t-PA第1次和第2次国际标准品分别于1984年和1987年颁发，其t-PA均来源于melanoma细胞衍生物[1，2]。美国于1990年建立rht-PA国家标准品[3]，欧洲亦于1998年建立了rht-PA的欧洲药典标准品[4]。而我国t-PA标准品尚属空白。为满足t-PA产品的研究开发及进口检验的需求，并与国际接轨，我们研制了rht-PA国家标准品。
1 仪器与材料
, 百拇医药
rht-PA原料：由德国Boeninger Lingelheim公司提供，为冻干品。t-PA标准品：第2次国际标准品(86/670)，每支850 IU。人凝血酶(每瓶1 000单位)、人纤维蛋白原(每瓶500 mg)、人纤维蛋白溶酶原(每瓶1.2 mg)均为Calbiochem-Novabiochem Corporation产品。
岛津LC-10AD HPLC系统；日立UV-3210分光光度计。玻璃恒温水浴，玻璃试管(12 mm×100 mm)，冰浴。其它试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 HPLC法 采用TSK3000SW(7.5 mm×600 mm)色谱柱；流动相为2.76%磷酸二氢钠-0.1%SDS水溶液(pH 6.8)；流速0.5 mL.min-1；检测波长为210 nm；室温下测定非还原性rht-PA溶液(1 mg.mL-1 rht-PA水溶液)和还原性rht-PA溶液(取1 mg.mL-1水溶液与0.02 mol.L-1二硫苏糖醇流动相溶液3 mL，混匀，置80 ℃水浴3～5 min，放冷)，进样量为50 μL。
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2.2 蛋白含量测定 参照文献[4]。
2.3 效价测定
2.3.1 溶液配制
磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠(含2H2O)1.79 g，磷酸氢二钠7.10 g，叠氮化钠0.20 g，吐温-80 0.1 g，加水至1 000 mL。
人凝血酶溶液：取人凝血酶，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL中含33单位的溶液。
人纤维蛋白原溶液：取人纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL含可凝蛋白2 mg的溶液。
人血纤维蛋白溶酶原溶液：取人血纤维蛋白溶酶原，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL含1 mg的溶液。
, http://www.100md.com 混合溶液：临用前取等体积的标准品溶液或供试品溶液与人凝血酶溶液，混匀，置冰浴中。
标准品溶液的制备：取t-PA国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1 mL含850，425，213，107，54，27 IU的溶液。
供试品溶液的制备：取待标定的样品同标准溶液配制。
2.3.2 测定法 取试管6支，加人血纤维蛋白溶酶原溶液20 μL与人纤维蛋白溶液1 mL，混匀，置冰浴中，依次加不同单位的混合溶液200 μL，立即摇匀并置(37±0.5)℃水浴中，分别计时。反应系统应在30 s内凝结，当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点，计时。以rht-PA浓度的对数为横坐标，反应时间(s)的对数为纵坐标，进行线性回归，其相关系数不得低于-0.990 0。同法测定供试品溶液。
3 结果与讨论
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3.1 标准品的原料选择 原料的选择是制备标准品的关键，我们选择了国外的3批rht-PA为原料，对其纯度、蛋白含量及效价进行分析。
3.1.1 HPLC纯度分析 rht-PA是由真核细胞(CHO)表达的一种高分子量糖蛋白。其产品的纯度，除了比活力外，还要检查单体和单链[4，5]。rht-PA是一种含有多个二硫键的单链分子(单体)，但是在其第275～276氨基酸残基之间的肽键容易断开，而二硫键未被破坏时，容易形成含切口的分子(亦称双链)。在非还原条件下，由于链内二硫键的存在，单、双链分子的分子量相同，用HPSEC不能区分2者(见图1-A)，但能检测出产品中的聚合体，从而计算出单体含量；在还原条件下，rht-PA分子中的二硫键被打开，含切口的分子变成了2条肽链(见图1-B)。含切口分子更易受攻击，可能进一步降解成低分子量片断，而影响rht-PA的活性稳定性，因此，标准规定单体含量不少于95%，含单链应大于60%[4，5]。3批原料的单体含量均为99%，单链含量分别为86%，85%，82%。
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图1 非还原(A)与还原(B)rht-PA的HPSEC图谱
1.rht-PA单体 2.精氨酸 3.单链rht-PA
4.双链rht-PA 5.二硫苏糖醇
3.1.2 比活力 效价单位数与蛋白含量的比值为比活力(IU.mg-1)。3批rht-PA每瓶蛋白含量分别为53.0，52.0和53.5 mg；每瓶效价分别为27.8×106，29.0×106和33.3×106 IU；比活力分别为5.3×105，5.6×105和5.7×105 IU.mg-1。rht-PA原料的比活力符合要求(不少于5.0×105 IU.mg-1)[1，5]。
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3.2 标准品的制备
3.2.1 配方的选择 配方的选择关系到标准品的稳定性和标准品与供试品的量效曲线是否平行。本文选用了与t-PA国际标准品一致的配方，其中人血清白蛋白(HSA)具有长期稳定的作用，精氨酸在达到一定浓度时，可促进溶解也具有稳定作用；吐温-80具有促溶作用，磷酸盐缓冲液(pH 7.3)最适于t-PA。
3.2.2 分装和熔封 取rht-PA原料，加适量水溶解后，再用含白蛋白的精氨酸磷酸缓冲液制成约60 000 IU.mL-1的溶液，在恒温，避光，无微生物及其它化学物质污染处分装，每支0.5 mL，经冷冻干燥后，熔封，于-20 ℃保存。
3.3 标准品的标定
3.3.1 方法的选择 本文所用体外凝块裂解气泡上升法为国际上公认的方法，是t-PA国际标准品标定、USP和EP均采用的效价测定法，此法要求标准品与样品曲线平行，相关系数在-0.990 0至-1.000 0；重复试验的RSD不得过10%。
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3.3.2 均一性试验 随机抽取冻干后待标品10支，每支用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至5.0 mL，取1.25 mL置25 mL量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液至刻度。按上述效价测定方法测定，10支平均凝块溶解时间为389 s，RSD=1.75%。
3.3 效价单位的标定
按上述效价测定方法，用t-PA国际标准品标定待标品的效价单位数，国际标准品和待标品的线性回归方程分别为：
Y=-0.417X-3.623 r=-0.998 8
Y=-0.413X-3.618 r=-0.999 9
标准品与待标品的量效曲线平行。
标定了10支rht-PA待标品，每支的效价分别为29 650，31 100，31 450，32 050，30 400，31 050，31 150，30 200，32 000和28 800 IU，平均为每支30 785 IU(RSD=3.34%)。由此可见，由测定结果确定国家标准品的效价为每支30 000 IU。
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3.4 稳定性 用费休氏库仑计方法[6]测定国家标准品的水分为3.46%(n=3，RSD=3.0%)。比较冻干前后效价单位，结果基本不变，说明该配方在冻干过程中有保护t-PA活性的作用。长期稳定性还有待于考察。
3.5 小结 首批rht-PA国家标准品均一、稳定，其标定结果准确可靠，该标准品的建立解决了进口检验、新药审批以及溶血栓类药物质控对t-PA标准品的需求问题。■
参考文献
1.Gaffney PJ,Curtis AD.A collaborative study of a proposed international standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1985,53:134
2.Gaffney PJ,Curtis AD.A collaborative study to establish the Second International Standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1987,59:1085
3.Ranby M.On the properity of the International Standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1990,63:139
4.USP.ⅩⅩⅢ.49
5.EP Supplement 1999.248
6.中国药典1995年版1998年增补本.136
(本文于1999年8月26日收到), http://www.100md.com
单位：杨化新 张培培 孙磊 徐康森(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：重组人组织纤溶酶原激活剂；纯度；效价；标准品
药物分析杂志000404 摘要 目的：建立rht-PA效价测定用国家标准品。方法：用UV法测定蛋白含量；HPSEC法分析纯度；体外凝块裂解气泡上升法测定效价；用t-PA国际标准品(86/670)对国家标准品的效价进行标定。结果：标准品的效价为每支30 000 IU，RSD=3.34%(n=10)。结论：建立的rht-PA国家标准品可用于国内同类药物的研究开发和进口药品的质控。
Establishment and Standardization of the National Reference Standard
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of Recombinant Human Tissue Plasminogen Activator
Yang Huaxin Zhang Peipei Sun Lei Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective：To establish a national reference standard for rht-PA potency.Methods:The protein content,the purity and the potency of rht-PA preparation were analyzed by UV,HPSEC and the clot lysis assay,respectively,using the Second International Standard for t-PA to calibrate national reference standard of rht-PA.Results:The first national reference standard for rht-PA was established,with an assigned potency of 30 000 international units(IU) each ampoule.Conclusion:The National reference standard for rht-PA has been established.It can be useful for the development of analogous drugs produced domestically and the quality control of import medicines.
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Key words rht-PA,purity,potency,reference standard▲
重组人组织纤溶酶原激活剂(rht-PA)是治疗血栓栓塞性疾病的新药，它与天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)具有相同的功效，尤其是治疗急性心肌梗塞见效快。国外已有产品上市，国内正处在研究开发阶段，并有单位准备申报新药。
t-PA第1次和第2次国际标准品分别于1984年和1987年颁发，其t-PA均来源于melanoma细胞衍生物[1，2]。美国于1990年建立rht-PA国家标准品[3]，欧洲亦于1998年建立了rht-PA的欧洲药典标准品[4]。而我国t-PA标准品尚属空白。为满足t-PA产品的研究开发及进口检验的需求，并与国际接轨，我们研制了rht-PA国家标准品。
1 仪器与材料
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rht-PA原料：由德国Boeninger Lingelheim公司提供，为冻干品。t-PA标准品：第2次国际标准品(86/670)，每支850 IU。人凝血酶(每瓶1 000单位)、人纤维蛋白原(每瓶500 mg)、人纤维蛋白溶酶原(每瓶1.2 mg)均为Calbiochem-Novabiochem Corporation产品。
岛津LC-10AD HPLC系统；日立UV-3210分光光度计。玻璃恒温水浴，玻璃试管(12 mm×100 mm)，冰浴。其它试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 HPLC法 采用TSK3000SW(7.5 mm×600 mm)色谱柱；流动相为2.76%磷酸二氢钠-0.1%SDS水溶液(pH 6.8)；流速0.5 mL.min-1；检测波长为210 nm；室温下测定非还原性rht-PA溶液(1 mg.mL-1 rht-PA水溶液)和还原性rht-PA溶液(取1 mg.mL-1水溶液与0.02 mol.L-1二硫苏糖醇流动相溶液3 mL，混匀，置80 ℃水浴3～5 min，放冷)，进样量为50 μL。
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2.2 蛋白含量测定 参照文献[4]。
2.3 效价测定
2.3.1 溶液配制
磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠(含2H2O)1.79 g，磷酸氢二钠7.10 g，叠氮化钠0.20 g，吐温-80 0.1 g，加水至1 000 mL。
人凝血酶溶液：取人凝血酶，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL中含33单位的溶液。
人纤维蛋白原溶液：取人纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL含可凝蛋白2 mg的溶液。
人血纤维蛋白溶酶原溶液：取人血纤维蛋白溶酶原，加磷酸盐缓冲液制成每1 mL含1 mg的溶液。
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标准品溶液的制备：取t-PA国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1 mL含850，425，213，107，54，27 IU的溶液。
供试品溶液的制备：取待标定的样品同标准溶液配制。
2.3.2 测定法 取试管6支，加人血纤维蛋白溶酶原溶液20 μL与人纤维蛋白溶液1 mL，混匀，置冰浴中，依次加不同单位的混合溶液200 μL，立即摇匀并置(37±0.5)℃水浴中，分别计时。反应系统应在30 s内凝结，当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点，计时。以rht-PA浓度的对数为横坐标，反应时间(s)的对数为纵坐标，进行线性回归，其相关系数不得低于-0.990 0。同法测定供试品溶液。
3 结果与讨论
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3.1 标准品的原料选择 原料的选择是制备标准品的关键，我们选择了国外的3批rht-PA为原料，对其纯度、蛋白含量及效价进行分析。
3.1.1 HPLC纯度分析 rht-PA是由真核细胞(CHO)表达的一种高分子量糖蛋白。其产品的纯度，除了比活力外，还要检查单体和单链[4，5]。rht-PA是一种含有多个二硫键的单链分子(单体)，但是在其第275～276氨基酸残基之间的肽键容易断开，而二硫键未被破坏时，容易形成含切口的分子(亦称双链)。在非还原条件下，由于链内二硫键的存在，单、双链分子的分子量相同，用HPSEC不能区分2者(见图1-A)，但能检测出产品中的聚合体，从而计算出单体含量；在还原条件下，rht-PA分子中的二硫键被打开，含切口的分子变成了2条肽链(见图1-B)。含切口分子更易受攻击，可能进一步降解成低分子量片断，而影响rht-PA的活性稳定性，因此，标准规定单体含量不少于95%，含单链应大于60%[4，5]。3批原料的单体含量均为99%，单链含量分别为86%，85%，82%。
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图1 非还原(A)与还原(B)rht-PA的HPSEC图谱
1.rht-PA单体 2.精氨酸 3.单链rht-PA
4.双链rht-PA 5.二硫苏糖醇
3.1.2 比活力 效价单位数与蛋白含量的比值为比活力(IU.mg-1)。3批rht-PA每瓶蛋白含量分别为53.0，52.0和53.5 mg；每瓶效价分别为27.8×106，29.0×106和33.3×106 IU；比活力分别为5.3×105，5.6×105和5.7×105 IU.mg-1。rht-PA原料的比活力符合要求(不少于5.0×105 IU.mg-1)[1，5]。
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3.2 标准品的制备
3.2.1 配方的选择 配方的选择关系到标准品的稳定性和标准品与供试品的量效曲线是否平行。本文选用了与t-PA国际标准品一致的配方，其中人血清白蛋白(HSA)具有长期稳定的作用，精氨酸在达到一定浓度时，可促进溶解也具有稳定作用；吐温-80具有促溶作用，磷酸盐缓冲液(pH 7.3)最适于t-PA。
3.2.2 分装和熔封 取rht-PA原料，加适量水溶解后，再用含白蛋白的精氨酸磷酸缓冲液制成约60 000 IU.mL-1的溶液，在恒温，避光，无微生物及其它化学物质污染处分装，每支0.5 mL，经冷冻干燥后，熔封，于-20 ℃保存。
3.3 标准品的标定
3.3.1 方法的选择 本文所用体外凝块裂解气泡上升法为国际上公认的方法，是t-PA国际标准品标定、USP和EP均采用的效价测定法，此法要求标准品与样品曲线平行，相关系数在-0.990 0至-1.000 0；重复试验的RSD不得过10%。
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3.3.2 均一性试验 随机抽取冻干后待标品10支，每支用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至5.0 mL，取1.25 mL置25 mL量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液至刻度。按上述效价测定方法测定，10支平均凝块溶解时间为389 s，RSD=1.75%。
3.3 效价单位的标定
按上述效价测定方法，用t-PA国际标准品标定待标品的效价单位数，国际标准品和待标品的线性回归方程分别为：
Y=-0.417X-3.623 r=-0.998 8
Y=-0.413X-3.618 r=-0.999 9
标准品与待标品的量效曲线平行。
标定了10支rht-PA待标品，每支的效价分别为29 650，31 100，31 450，32 050，30 400，31 050，31 150，30 200，32 000和28 800 IU，平均为每支30 785 IU(RSD=3.34%)。由此可见，由测定结果确定国家标准品的效价为每支30 000 IU。
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3.4 稳定性 用费休氏库仑计方法[6]测定国家标准品的水分为3.46%(n=3，RSD=3.0%)。比较冻干前后效价单位，结果基本不变，说明该配方在冻干过程中有保护t-PA活性的作用。长期稳定性还有待于考察。
3.5 小结 首批rht-PA国家标准品均一、稳定，其标定结果准确可靠，该标准品的建立解决了进口检验、新药审批以及溶血栓类药物质控对t-PA标准品的需求问题。■
参考文献
1.Gaffney PJ,Curtis AD.A collaborative study of a proposed international standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1985,53:134
2.Gaffney PJ,Curtis AD.A collaborative study to establish the Second International Standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1987,59:1085
3.Ranby M.On the properity of the International Standard for tissue plasminogen activator(t-PA).Thromb Haemost,1990,63:139
4.USP.ⅩⅩⅢ.49
5.EP Supplement 1999.248
6.中国药典1995年版1998年增补本.136
(本文于1999年8月26日收到), http://www.100md.com