HER2/neu原癌基因胞外区片段DNA克隆及其在小鼠中诱导的抗体应答
作者：张跃建 何球藻 秦慧莲
单位：张跃建 何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫学教研室 上海 200032)
关键词：HER2/neu原癌基因；胞外区；DNA免疫；流产
中国肿瘤生物治疗杂志000105 摘 要 目的： 研究HER2/neu原癌基因胞外区片段(ECD) DNA直接肌肉注射在小鼠体内表达，体液免疫状况，利用小鼠流产模型观察其体内效应。方法： 克隆并构建了人及大鼠HER2/neu原癌基因胞外区片段真核表达载体pCDNA3-X, 采用肌肉直接注射的方法免疫小鼠，分析目的基因在小鼠体内的表达及其诱导的免疫应答。结果： 在质粒DNA直接注射部位可检测到目的基因的表达， 并诱导了针对HER2/neu的抗体反应；同时诱发小鼠流产，使免疫鼠产仔数减少，可观察到流产结节形成。结论： 通过基因免疫，可诱导针对HER2/neu原癌基因产物的有效免疫应答。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R392.1
Induction of Antibody Response by Intramuscular Immunization with HER2/neu Oncogene Extracellular Domain DNA in Mice
Zhang Yuejian, He Qiuzao, Qin huilian
(Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032)
Abstract Objective: To induce an immune response by intramuscular immunization with HER2/neu oncogene extracellular domain (ECD) DNA and observe the effect in vivo by an abortion model in mice. Methods: Human and rat HER2/neu ECD gene were cloned and inserted into expressive vector pCDNA3. The DNA immunization, expression of HER2/neu ECD, antibody detection and abortion in immunized mice were studied. Results: HER2/neu ECD protein expressed on muscle cells in the injected site, specific antibody to HER2/neu was induced by DNA immunization. The average of the offspring per delivery from immunized mice was significantly lower than that from control group, and the abortive embryos were found in uterus from immunized mice. Conclusion: The results show that both human and rat HER2/neu ECD gene can induced effective immune response by DNA immunization.
, 百拇医药
Key words HER2/neu oncogene； extracellular domain； DNA immunization; abortion
HER2/neu 原癌基因位于人17号染色体，编码185 kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，属表皮细胞生长因子家族[1]。它主要在胚胎发育期间表达，在成人正常组织极少表达[2]。约1/3的乳腺癌和卵巢癌组织中存在HER2/neu原癌基因扩增和/或过度表达[3]。曾报道在部分患者可检测到针对HER2/neu基因产物的抗体和(或)细胞免疫应答，说明机体可以打破针对HER2/neu蛋白的自身耐受，使该蛋白可能成为肿瘤治疗的靶抗原[4]。
我们以前的实验显示，利用HER2/neu蛋白免疫小鼠可诱导出较好的特异免疫应答[5]，但蛋白纯化和保存等技术复杂且要求较高限制了蛋白质免疫的应用。近几年来DNA免疫技术所显示的优点使之迅速发展，利用质粒DNA直接注射的方法研制新型疫苗，特别是针对肿瘤抗原的DNA免疫研究将具有重要意义[6]。本研究克隆并构建了人和大鼠HER2/neu原癌基因ECD片段，通过DNA直接肌肉注射免疫小鼠，观察目的基因在小鼠体内表达情况，并利用流产模型验证了HER2/neu ECD基因免疫诱导的体内免疫效应。
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1 材料与方法
1.1 材料
菌株与质粒E. coli DH5α和质粒pCDNA3由本室保存。质粒pSV2neu由Dr. Yujiao Zhang 提供。人HER2/neu胞外区cDNA由本室克隆。内切酶及其他工具酶分别购自Gibco, Sangon及NEB等公司。抗HER2/neu蛋白多抗及免疫组化试剂购自Dako公司。细胞株SKBR3乳腺癌细胞由本室传代培养。质粒大量抽提纯化试剂盒购自Qiagen公司。胶回收及PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司。动物：BALB/c清洁级小鼠，购自本校动物部并饲养于清洁级动物房。
1.2 方法
1.2.1 HER2/neu原癌基因胞外区基因克隆
大鼠HER2/neu原癌基因胞外区片段采用亚克隆方法，利用HindⅢ和XbaⅠ酶切pSV2-neu, 回收并插入pCDNA3表达载体。人HER2/neu原癌基因胞外区片段利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞株SKBR3克隆，通过T-载体转换，NotⅠ/XbaⅠ酶切并插入pCDNA3表达载体。两者均挑选阳性克隆并测序。
, http://www.100md.com
1.2.2 质粒大量纯化
参照Qiagen公司操作手册，生理盐水溶解，紫外分光法标定质粒浓度。
1.2.3 DNA免疫
0.75%戊巴比妥钠麻醉小鼠，股四头肌注射0.25%丁哌卡因100 μl；24 h后同样麻醉后，在同一注射部位接种质粒DNA 100 μg，2周后眼眶采血检测抗体。
1.2.4 目的基因在体内表达
DNA免疫小鼠后48 h，取注射部位肌肉，福尔马林固定，石蜡包埋切片，以Dako公司抗HER2/neu多抗作免疫组化，观察目的基因的表达。
1.2.5 ELISA检测抗体
以高表达HER2/neu蛋白人乳腺癌细胞铺板，固定后作为抗原，其余同一般ELISA法。
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1.2.6 小鼠流产研究
DNA免疫后2周，按雌雄2∶1比例交配，以阴栓形成表示交配成功。22～24 d后怀孕小鼠即可产仔。计数小鼠产仔率，解剖观察产鼠子宫流产结节。
2 结 果
2.1 测序及酶切鉴定
获得含跨膜区的大鼠HER2/neu原癌基因胞外区和不含跨膜区人HER2/neu胞外区基因正确序列，图1显示了pCDNA3-rECD和pCDNA3-hECD酶切电泳结果，说明表达载体构建正确。
2.2 目的基因在小鼠肌肉表达
图2显示了人HER2/neu ECD免疫后在肌肉表达的免疫组化结果，大鼠HER2/neu ECD基因也显示同样的结果。
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2.3 免疫小鼠产仔数
HER2/neu ECD基因免疫可影响小鼠妊娠结局，对照组平均产仔7.6±0.5只，大鼠ECD基因免疫组平均产仔数为2.4±1.9只，人ECD基因免疫组为3.2±1.9只，说明人和大鼠HER2/neuECD基因免疫均导致小鼠怀孕后产仔数降低，提示针对HER2/neu原癌基因的免疫应答干扰了正常的妊娠过程。
图1 人和大鼠HER2/neu胞外区基因重组质粒酶切电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis analysis of endonuclease
digestion of pCDNA3-hECD and pCDNA3-rECD
, 百拇医药
1： Mark; 2: pcDNA3-rECD; 3: pcDNA3-hECD
图2 HER2/neu胞外区基因直接注射后在小鼠肌肉细胞的表达
Fig.2 Expression of HER2/neu ECD gene on muscle cells
by DNA directed injection
2.4 DNA免疫诱导抗HER2/neu抗体反应
图3显示与对照组相比，ECD基因免疫2周后血清产生了抗HER2/neu抗体的结果。
2.5 免疫鼠流产结节观察
, 百拇医药
小鼠分娩后解剖观察，在HER2/neu ECD质粒免疫组可见明显流产结节及坏死胚胎，对照组子宫未见异常。
3 讨 论
HER2/neu原癌基因编码P185蛋白，主要在胚胎期的组织或器官中表达，而在成年组织或器官极少表达，因而机体免疫系统往往不能有效识别而导致免疫耐受。Disis等用完整P185蛋白不能有效诱导免疫应答，而多肽片段则可有效诱导反应，推测蛋白片段可能暴露了某些次要表位而诱导免疫应答[7]。基于以上这些观点，我们选择了HER2/neu原癌基因胞外区片段，一方面可能暴露部分抗原表位，又避免全长基因表达产物带来的潜在转化危险。此外，人，大鼠和小鼠的HER2/neu基因高度同源，我们将人和大鼠的基因免疫小鼠，所得的结果也较为可靠。从1995年以来，DNA疫苗因为制备简单，保存方便，可操作性强，成为免疫学研究的一个热点。
, 百拇医药
图3 HER2/neu ECD基因免疫诱导特异抗体反应
Fig.3 Specific antibody response induced by
HER2/neu ECD gene immunization
本课题克隆并构建了HER2/neu胞外区片段，并经测序鉴定。将含目的基因的质粒DNA直接接种小鼠肌肉，检测到目的基因的表达和抗HER2/neu基因产物的抗体反应。由于缺乏合适的体内模型，选择了小鼠流产模型作为体内观察指标，我们以前的研究表明，体内的抗P185蛋白抗体可以诱导小鼠流产[8]，当然在本课题研究中我们没有研究细胞免疫是否也发挥了作用。我们的结果说明，利用HER2/neu原癌基因胞外区片段免疫动物可打破机体已有的免疫耐受，并诱导出相应的免疫应答。这些结果提示，DNA免疫，特别是包含潜在抗原表位的DNA疫苗，有可能打破机体原有的耐受，这在诱导机体对肿瘤相关抗原的免疫应答方面具有重要意义。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Coussens L, Yang-Feng TL, Chen YLE， et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 1985, 230: 1132
2，Kokay Y, Cohen JA, Drebin JA， et al. Stage-and tissue-specific expression of neu oncogene in rat development. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 8498
3，Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovary cancer. Science, 1989, 244: 707
, 百拇医药
4，Disis ML， Calenoff E, McLaughlin G， et al. Existent T cell and antibody immunity to HER-2/neu protein in patients with breast cancer. Cancer Res, 1994, 54: 16
5，李晓华， 秦慧莲， 何球藻. 原癌基因HER2/neu表达产物p185蛋白免疫原性研究. 中国免疫学杂志， 1998， 14： 191
6，Bright RT, Shearer MH, Kennedy RC. Nucleic acid vaccination against virally induced tumors. Ann NY Acad Sci, 1995, 272: 241
7，Disis ML, Gralow JR, Bernhard H， et al. Peptide-based but not whole protein vaccines elicit immunity to HER2/neu, an oncogenic self-protein. J Immunol, 1996, 156: 3151
8，李晓华， 秦慧莲， Disis ML， 等. P185抗体可致小鼠流产的研究. 中华微生物学和免疫学杂志， 1998， 18： 460
(1999-02-05收稿； 1999-03-20修回), 百拇医药
单位：张跃建 何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫学教研室 上海 200032)
关键词：HER2/neu原癌基因；胞外区；DNA免疫；流产
中国肿瘤生物治疗杂志000105 摘 要 目的： 研究HER2/neu原癌基因胞外区片段(ECD) DNA直接肌肉注射在小鼠体内表达，体液免疫状况，利用小鼠流产模型观察其体内效应。方法： 克隆并构建了人及大鼠HER2/neu原癌基因胞外区片段真核表达载体pCDNA3-X, 采用肌肉直接注射的方法免疫小鼠，分析目的基因在小鼠体内的表达及其诱导的免疫应答。结果： 在质粒DNA直接注射部位可检测到目的基因的表达， 并诱导了针对HER2/neu的抗体反应；同时诱发小鼠流产，使免疫鼠产仔数减少，可观察到流产结节形成。结论： 通过基因免疫，可诱导针对HER2/neu原癌基因产物的有效免疫应答。
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《中国图书资料分类法》分类号 R392.1
Induction of Antibody Response by Intramuscular Immunization with HER2/neu Oncogene Extracellular Domain DNA in Mice
Zhang Yuejian, He Qiuzao, Qin huilian
(Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032)
Abstract Objective: To induce an immune response by intramuscular immunization with HER2/neu oncogene extracellular domain (ECD) DNA and observe the effect in vivo by an abortion model in mice. Methods: Human and rat HER2/neu ECD gene were cloned and inserted into expressive vector pCDNA3. The DNA immunization, expression of HER2/neu ECD, antibody detection and abortion in immunized mice were studied. Results: HER2/neu ECD protein expressed on muscle cells in the injected site, specific antibody to HER2/neu was induced by DNA immunization. The average of the offspring per delivery from immunized mice was significantly lower than that from control group, and the abortive embryos were found in uterus from immunized mice. Conclusion: The results show that both human and rat HER2/neu ECD gene can induced effective immune response by DNA immunization.
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Key words HER2/neu oncogene； extracellular domain； DNA immunization; abortion
HER2/neu 原癌基因位于人17号染色体，编码185 kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，属表皮细胞生长因子家族[1]。它主要在胚胎发育期间表达，在成人正常组织极少表达[2]。约1/3的乳腺癌和卵巢癌组织中存在HER2/neu原癌基因扩增和/或过度表达[3]。曾报道在部分患者可检测到针对HER2/neu基因产物的抗体和(或)细胞免疫应答，说明机体可以打破针对HER2/neu蛋白的自身耐受，使该蛋白可能成为肿瘤治疗的靶抗原[4]。
我们以前的实验显示，利用HER2/neu蛋白免疫小鼠可诱导出较好的特异免疫应答[5]，但蛋白纯化和保存等技术复杂且要求较高限制了蛋白质免疫的应用。近几年来DNA免疫技术所显示的优点使之迅速发展，利用质粒DNA直接注射的方法研制新型疫苗，特别是针对肿瘤抗原的DNA免疫研究将具有重要意义[6]。本研究克隆并构建了人和大鼠HER2/neu原癌基因ECD片段，通过DNA直接肌肉注射免疫小鼠，观察目的基因在小鼠体内表达情况，并利用流产模型验证了HER2/neu ECD基因免疫诱导的体内免疫效应。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
菌株与质粒E. coli DH5α和质粒pCDNA3由本室保存。质粒pSV2neu由Dr. Yujiao Zhang 提供。人HER2/neu胞外区cDNA由本室克隆。内切酶及其他工具酶分别购自Gibco, Sangon及NEB等公司。抗HER2/neu蛋白多抗及免疫组化试剂购自Dako公司。细胞株SKBR3乳腺癌细胞由本室传代培养。质粒大量抽提纯化试剂盒购自Qiagen公司。胶回收及PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司。动物：BALB/c清洁级小鼠，购自本校动物部并饲养于清洁级动物房。
1.2 方法
1.2.1 HER2/neu原癌基因胞外区基因克隆
大鼠HER2/neu原癌基因胞外区片段采用亚克隆方法，利用HindⅢ和XbaⅠ酶切pSV2-neu, 回收并插入pCDNA3表达载体。人HER2/neu原癌基因胞外区片段利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞株SKBR3克隆，通过T-载体转换，NotⅠ/XbaⅠ酶切并插入pCDNA3表达载体。两者均挑选阳性克隆并测序。
, http://www.100md.com
1.2.2 质粒大量纯化
参照Qiagen公司操作手册，生理盐水溶解，紫外分光法标定质粒浓度。
1.2.3 DNA免疫
0.75%戊巴比妥钠麻醉小鼠，股四头肌注射0.25%丁哌卡因100 μl；24 h后同样麻醉后，在同一注射部位接种质粒DNA 100 μg，2周后眼眶采血检测抗体。
1.2.4 目的基因在体内表达
DNA免疫小鼠后48 h，取注射部位肌肉，福尔马林固定，石蜡包埋切片，以Dako公司抗HER2/neu多抗作免疫组化，观察目的基因的表达。
1.2.5 ELISA检测抗体
以高表达HER2/neu蛋白人乳腺癌细胞铺板，固定后作为抗原，其余同一般ELISA法。
, 百拇医药
1.2.6 小鼠流产研究
DNA免疫后2周，按雌雄2∶1比例交配，以阴栓形成表示交配成功。22～24 d后怀孕小鼠即可产仔。计数小鼠产仔率，解剖观察产鼠子宫流产结节。
2 结 果
2.1 测序及酶切鉴定
获得含跨膜区的大鼠HER2/neu原癌基因胞外区和不含跨膜区人HER2/neu胞外区基因正确序列，图1显示了pCDNA3-rECD和pCDNA3-hECD酶切电泳结果，说明表达载体构建正确。
2.2 目的基因在小鼠肌肉表达
图2显示了人HER2/neu ECD免疫后在肌肉表达的免疫组化结果，大鼠HER2/neu ECD基因也显示同样的结果。
, 百拇医药
2.3 免疫小鼠产仔数
HER2/neu ECD基因免疫可影响小鼠妊娠结局，对照组平均产仔7.6±0.5只，大鼠ECD基因免疫组平均产仔数为2.4±1.9只，人ECD基因免疫组为3.2±1.9只，说明人和大鼠HER2/neuECD基因免疫均导致小鼠怀孕后产仔数降低，提示针对HER2/neu原癌基因的免疫应答干扰了正常的妊娠过程。
图1 人和大鼠HER2/neu胞外区基因重组质粒酶切电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis analysis of endonuclease
digestion of pCDNA3-hECD and pCDNA3-rECD
, 百拇医药
1： Mark; 2: pcDNA3-rECD; 3: pcDNA3-hECD
图2 HER2/neu胞外区基因直接注射后在小鼠肌肉细胞的表达
Fig.2 Expression of HER2/neu ECD gene on muscle cells
by DNA directed injection
2.4 DNA免疫诱导抗HER2/neu抗体反应
图3显示与对照组相比，ECD基因免疫2周后血清产生了抗HER2/neu抗体的结果。
2.5 免疫鼠流产结节观察
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小鼠分娩后解剖观察，在HER2/neu ECD质粒免疫组可见明显流产结节及坏死胚胎，对照组子宫未见异常。
3 讨 论
HER2/neu原癌基因编码P185蛋白，主要在胚胎期的组织或器官中表达，而在成年组织或器官极少表达，因而机体免疫系统往往不能有效识别而导致免疫耐受。Disis等用完整P185蛋白不能有效诱导免疫应答，而多肽片段则可有效诱导反应，推测蛋白片段可能暴露了某些次要表位而诱导免疫应答[7]。基于以上这些观点，我们选择了HER2/neu原癌基因胞外区片段，一方面可能暴露部分抗原表位，又避免全长基因表达产物带来的潜在转化危险。此外，人，大鼠和小鼠的HER2/neu基因高度同源，我们将人和大鼠的基因免疫小鼠，所得的结果也较为可靠。从1995年以来，DNA疫苗因为制备简单，保存方便，可操作性强，成为免疫学研究的一个热点。
, 百拇医药
图3 HER2/neu ECD基因免疫诱导特异抗体反应
Fig.3 Specific antibody response induced by
HER2/neu ECD gene immunization
本课题克隆并构建了HER2/neu胞外区片段，并经测序鉴定。将含目的基因的质粒DNA直接接种小鼠肌肉，检测到目的基因的表达和抗HER2/neu基因产物的抗体反应。由于缺乏合适的体内模型，选择了小鼠流产模型作为体内观察指标，我们以前的研究表明，体内的抗P185蛋白抗体可以诱导小鼠流产[8]，当然在本课题研究中我们没有研究细胞免疫是否也发挥了作用。我们的结果说明，利用HER2/neu原癌基因胞外区片段免疫动物可打破机体已有的免疫耐受，并诱导出相应的免疫应答。这些结果提示，DNA免疫，特别是包含潜在抗原表位的DNA疫苗，有可能打破机体原有的耐受，这在诱导机体对肿瘤相关抗原的免疫应答方面具有重要意义。
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参 考 文 献
1，Coussens L, Yang-Feng TL, Chen YLE， et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 1985, 230: 1132
2，Kokay Y, Cohen JA, Drebin JA， et al. Stage-and tissue-specific expression of neu oncogene in rat development. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 8498
3，Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovary cancer. Science, 1989, 244: 707
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4，Disis ML， Calenoff E, McLaughlin G， et al. Existent T cell and antibody immunity to HER-2/neu protein in patients with breast cancer. Cancer Res, 1994, 54: 16
5，李晓华， 秦慧莲， 何球藻. 原癌基因HER2/neu表达产物p185蛋白免疫原性研究. 中国免疫学杂志， 1998， 14： 191
6，Bright RT, Shearer MH, Kennedy RC. Nucleic acid vaccination against virally induced tumors. Ann NY Acad Sci, 1995, 272: 241
7，Disis ML, Gralow JR, Bernhard H， et al. Peptide-based but not whole protein vaccines elicit immunity to HER2/neu, an oncogenic self-protein. J Immunol, 1996, 156: 3151
8，李晓华， 秦慧莲， Disis ML， 等. P185抗体可致小鼠流产的研究. 中华微生物学和免疫学杂志， 1998， 18： 460
(1999-02-05收稿； 1999-03-20修回), 百拇医药