用鸡胚绒毛尿囊膜研究血管内皮细胞移动和增殖
作者：武利存 孙公甲 张维东
单位：(山东省医学科学院基础医学研究所， 山东 济南 250062)
关键词：鸡胚；内皮，血管； 细胞
中国病理生理杂志000626
[中图分类号] Q 24 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0572-02
[MeSH] Chick embryo; Endothelium, vascular; Cells
血管生成主要包括内皮细胞的移动与增殖，它不仅存在于胚胎发育、黄体形成等生理过程，而且在许多病理过程如恶性肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病、创伤愈合中起重要作用。因此，血管生成与抑制的研究近年受到广为关注，特别是研究抑制血管生成为控制肿瘤生长和抗转移开辟新途径而日益受到重视[1]。由于大多数血管生长抑制剂都是抑制内皮细胞(endothelial cell,EC)的移动与增殖，因而，研究EC移动与增殖的实验方法显得很重要。
, 百拇医药
本文介绍用鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)研究血管EC移动和增殖的体内方法。鸡胚CAM是在胚龄4～5 d时由绒毛膜的体壁中胚层和尿囊膜的脏层中胚层融合而成。孵育至第6～7 d时CAM及其血管覆盖整个卵黄囊表面。CAM的组织学结构有3层：外胚层，位于壳膜下方，由来自绒毛膜的上皮组成；中胚层，是一层富含毛细血管的结缔组织；内胚层，位于尿囊，由来自尿囊膜的内皮形成。CAM是一体外呼吸器官，随胚龄增加而增大，且毛细血管极其丰富[2]。
材 料 和 方 法
一、材料
Leghorn鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，[3H]-TdR和核Ⅳ型乳胶由北京中国原子能研究院提供，盐酸平阳霉素(pingyangmycin, PY)由天津河北制药厂生产。
, 百拇医药 二、方法
(一)PY对血管EC移动的影响 取胚蛋在38℃和60%相对湿度下孵育至第7 d时，将胚蛋随机分为两组。对照组：分别取胚龄第8、10、12、14、16和18 d的胚蛋各5枚，无菌条件下，在气室端(胚蛋大头端)用电动牙科钻锯1个1 cm×2 cm的小窗，去除蛋壳，暴露壳膜，以10%甲醛固定。实验组：取第8 d的胚蛋10枚，暴露壳膜，将一吸附有5μg PY的玻璃纤维滤纸载体(Ф5mm)置于壳膜中央，用透明玻璃纸密封后放入孵箱。隔日1次取出胚蛋，往载体上滴加5μg PY，密封后放回孵箱。第18 d时，用10%甲醛固定壳膜和CAM。将两组固定后的壳膜和CAM剪取2 cm×2 cm，在10%甲醛中继续固定，待做组织学检查。
(二)PY对血管EC增殖的影响 取胚龄为10 d的胚蛋20枚，分为对照组和实验组，每组10枚。用假气室法，在蛋壳上开1个1 cm×2 cm的小窗，小心拨去蛋壳和壳膜，暴露CAM。实验组将一吸附有5μg PY的载体置于CAM中央；对照组用PBS(pH 7.0)10μL。然后，在每个鸡胚CAM上滴加[3H]-TdR 7.4×105Bg，密封后放回孵箱中。5 h后取出胚蛋，掀去玻璃纸，用适量Carnoy液固定30 min，以载体为中心剪下CAM约2 cm×2 cm，继续固定6～12 h后，做组织学切片，片厚5μm，H-E染色，不封片，在暗室内涂乳胶膜。具体做法是：将盛有配制好的核Ⅳ型乳胶溶液的小烧杯，置入38℃水浴中，将标本加热至37～40℃，在切片上滴少量乳胶(1滴3.0 cm～3.5 cm)，用细玻棒牵引乳胶使之均匀覆盖于切片上，保持37～40℃ 1 min，使乳胶流体均匀，保持水平位置，在室温干燥。将干燥的制片放入暗盒，在4℃冰箱中曝光10～14 d。曝光后显影和定影，观察乳胶透明后，在过2～3 min，放在自来水细流中冲洗约1 h，风干。用中性加拿大树胶封片[3]。
, 百拇医药
结 果
一、PY对血管EC移动的影响
对照组：孵育第8 d时，CAM的3层结构已经形成。毛细血管都位于中胚层内，在绒毛膜上皮细胞下方相互连接成血管网。EC外形扁平，核区稍增厚。CAM毛细血管壁仅有1～2个EC构成。EC核亦呈梭形，核质淡染，含有一明显核仁，核内有少量染色质。不突向管腔，管腔平滑，略呈圆形或椭圆形(图1)。
第10 d时，CAM毛细血管仍位于外胚层上皮细胞之下。EC改变与第8 d相似。
第12 d时，CAM毛细血管开始向绒毛膜上皮细胞层及其上方移动，与壳膜更加接近。EC核变圆，使核区向血管腔突出，核染色质明显增加。
第14 d时，CAM毛细血管已完成向绒毛膜上皮上方的移动，EC移至外胚层上方，与壳膜紧贴。EC靠近壳膜的一侧明显变薄。
, http://www.100md.com
第16和18 d时，毛细血管EC位于外胚层上皮细胞上方，与壳膜紧贴，与第14 d时所见相同。EC核更圆，核区常向血管腔突出，核染色质深染，富含染色质，EC核多位于远离壳膜的一侧(图2)。
实验组：第18 d时，CAM毛细血管EC移动受到明显抑制，仍停留于外胚层上皮细胞的下方，距壳膜较远(图3)。与对照组中第8和10 d时所见相似。
二、PY对血管EC增殖的影响
光镜下观察处于外胚层绒毛膜上皮细胞下方并与之紧靠的毛细血管或血窦EC的[3H]-TdR 标记率。根据背景，每个细胞大小面积内银粒数少于3个。我们规定如果一个细胞大小面积内银粒数大于10个，则认为这个细胞被标记。在油镜下每次计数100个EC，共4次，对照组与实验组EC的[3H]-TdR 标记率平均值分别为41.5%±3.4%和20.3%±1.5%，两组间有非常显著差异(P<0.01)。
, 百拇医药
Fig 1 Three layers of CAM were formed on the 8th days. Capillaries localized in the mesenchyme, and became net beneath the ectoderm (×200)
图1 胚龄第8d时，CAM的3层结构已经形成。毛细血管都位于中胚层内，在绒毛膜上皮细胞下方相互连接成血管网
Fig2 ECs of CAM migrated above the ectoderm on the 14th day after incubation, and localized closely beneath the shell membrane (×200)
图2 胚龄14d时，CAM EC 移至外胚层上方，与壳膜紧贴
, 百拇医药
Fig 3 EC migration was significantly inhibited. Even on the 18th day of incubation, EC was still under the ectoderm, farther away from the shell membrane (×200)
图3 胚龄18d时，PY可使CAM EC 移至受到明显抑制，仍停留于外胚层之下，距壳膜较远
讨 论
研究EC移动的方法主要有Boyden室法、吞噬动力轨迹法[4]及linear under-agarose assay等，均为体外EC培养法，十分复杂。Ausprunk等报告用电镜观察EC有无伪足来判断EC移动，但费用太高，而且操作与观察技术要求高而复杂。因此作者设想能否用较简单的办法研究EC移动，果然在一次观察CAM组织学结构时发现孵育第9 d的CAM毛细血管EC都位于外胚层绒毛膜上皮之下，而孵育至第14 d后CAM毛细血管EC大都移至上皮之上，紧贴壳膜。这是因为胚胎发育需要越来越多的氧气弥散之故。PY可抑制CAM毛细血管EC的移动，使第18 d胚龄时早已该移至外胚层之上的毛细血管EC仍停留在外胚层上皮细胞层之下。抑制EC移动可能是其抑制血管新生的重要机制之一。
, 百拇医药
在鸡胚发育中，胚龄10 d时CAM毛细血管EC分裂增殖最旺盛，DNA合成达到高峰期，因此，选用第10 d的鸡胚做[3H]-TdR 标记最便于观察。结果表明PY可使CAM毛细血管EC的[3H]-TdR 标记率明显降低，DNA合成减少，即抑制EC增殖，是抑制血管生成的又一重要机制。
CAM上能被[3H]-TdR 标记的细胞除EC外，还有绒毛膜细胞、尿囊内胚层细胞、结缔组织细胞和血细胞。在鉴别一个被标记的细胞是不是EC时，主要根据CAM的组织学结构特点。第10 d时，CAM毛细血管EC大多移近外胚层，集中在绒毛膜上皮下方，毛细血管或血窦管腔清晰，并常可见到红细胞，血管壁上能被标记的细胞只有EC，所以不难识别。
PY是一细胞毒类抗肿瘤抗生素。作者证明它不仅可强烈抑制鸡胚CAM的血管生长，还可抑制S180、Lewis肺癌等肿瘤的血管生成。本实验证明PY抑制血管生成的机制是抑制EC的移动和增殖。另外，郑勤田等在局部注射PY治疗小儿血管瘤和淋巴管瘤这两种内皮细胞增殖性肿瘤临床实践中已取得了满意的疗效[5]。提示PY是一有潜力的血管生长抑制剂。鸡胚CAM可作为研究EC移动和增殖的体内方法，用于血管生成刺激因子和抑制因子的筛选和研究。
, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助(No. 39170829)
[参 考 文 献]
[1] Liu Y, Thor A, Shtivelman, et al. Systemic gene delivery expends the repertoire of effective antiangiogenic agents [J].J Biol Chem, 1999， 274(19):13338～13344.
[2] Leeson TS， Leeson CR. The chorio-allantois of the chick. Light and electron microscopic observations at various times of incubation [J]. J Anat， 1962， 97(4):585～589.
, 百拇医药
[3] Hobson B， Denekamp J. Endothelial proliferation in tumors and normal tissues: continuous labelling studies [J]. Br J Cancer， 1984， 49:405～413.
[4] Zetter BR. Migration of capillary endothelial cells is stimulated by tumor-derived factors [J]. Nature， 1980， 285:41～43.
[5] 郑勤田，伍连康， 容文星，等. 平阳霉素局部注射治疗小儿血管瘤[J]. 中华外科杂志,1991,29(3)：290～291.
[收稿日期]1999-06-11 [修回日期]1999-10-07
, 百拇医药
单位：(山东省医学科学院基础医学研究所， 山东 济南 250062)
关键词：鸡胚；内皮，血管； 细胞
中国病理生理杂志000626
[中图分类号] Q 24 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0572-02
[MeSH] Chick embryo; Endothelium, vascular; Cells
血管生成主要包括内皮细胞的移动与增殖，它不仅存在于胚胎发育、黄体形成等生理过程，而且在许多病理过程如恶性肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病、创伤愈合中起重要作用。因此，血管生成与抑制的研究近年受到广为关注，特别是研究抑制血管生成为控制肿瘤生长和抗转移开辟新途径而日益受到重视[1]。由于大多数血管生长抑制剂都是抑制内皮细胞(endothelial cell,EC)的移动与增殖，因而，研究EC移动与增殖的实验方法显得很重要。
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本文介绍用鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)研究血管EC移动和增殖的体内方法。鸡胚CAM是在胚龄4～5 d时由绒毛膜的体壁中胚层和尿囊膜的脏层中胚层融合而成。孵育至第6～7 d时CAM及其血管覆盖整个卵黄囊表面。CAM的组织学结构有3层：外胚层，位于壳膜下方，由来自绒毛膜的上皮组成；中胚层，是一层富含毛细血管的结缔组织；内胚层，位于尿囊，由来自尿囊膜的内皮形成。CAM是一体外呼吸器官，随胚龄增加而增大，且毛细血管极其丰富[2]。
材 料 和 方 法
一、材料
Leghorn鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，[3H]-TdR和核Ⅳ型乳胶由北京中国原子能研究院提供，盐酸平阳霉素(pingyangmycin, PY)由天津河北制药厂生产。
, 百拇医药 二、方法
(一)PY对血管EC移动的影响 取胚蛋在38℃和60%相对湿度下孵育至第7 d时，将胚蛋随机分为两组。对照组：分别取胚龄第8、10、12、14、16和18 d的胚蛋各5枚，无菌条件下，在气室端(胚蛋大头端)用电动牙科钻锯1个1 cm×2 cm的小窗，去除蛋壳，暴露壳膜，以10%甲醛固定。实验组：取第8 d的胚蛋10枚，暴露壳膜，将一吸附有5μg PY的玻璃纤维滤纸载体(Ф5mm)置于壳膜中央，用透明玻璃纸密封后放入孵箱。隔日1次取出胚蛋，往载体上滴加5μg PY，密封后放回孵箱。第18 d时，用10%甲醛固定壳膜和CAM。将两组固定后的壳膜和CAM剪取2 cm×2 cm，在10%甲醛中继续固定，待做组织学检查。
(二)PY对血管EC增殖的影响 取胚龄为10 d的胚蛋20枚，分为对照组和实验组，每组10枚。用假气室法，在蛋壳上开1个1 cm×2 cm的小窗，小心拨去蛋壳和壳膜，暴露CAM。实验组将一吸附有5μg PY的载体置于CAM中央；对照组用PBS(pH 7.0)10μL。然后，在每个鸡胚CAM上滴加[3H]-TdR 7.4×105Bg，密封后放回孵箱中。5 h后取出胚蛋，掀去玻璃纸，用适量Carnoy液固定30 min，以载体为中心剪下CAM约2 cm×2 cm，继续固定6～12 h后，做组织学切片，片厚5μm，H-E染色，不封片，在暗室内涂乳胶膜。具体做法是：将盛有配制好的核Ⅳ型乳胶溶液的小烧杯，置入38℃水浴中，将标本加热至37～40℃，在切片上滴少量乳胶(1滴3.0 cm～3.5 cm)，用细玻棒牵引乳胶使之均匀覆盖于切片上，保持37～40℃ 1 min，使乳胶流体均匀，保持水平位置，在室温干燥。将干燥的制片放入暗盒，在4℃冰箱中曝光10～14 d。曝光后显影和定影，观察乳胶透明后，在过2～3 min，放在自来水细流中冲洗约1 h，风干。用中性加拿大树胶封片[3]。
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结 果
一、PY对血管EC移动的影响
对照组：孵育第8 d时，CAM的3层结构已经形成。毛细血管都位于中胚层内，在绒毛膜上皮细胞下方相互连接成血管网。EC外形扁平，核区稍增厚。CAM毛细血管壁仅有1～2个EC构成。EC核亦呈梭形，核质淡染，含有一明显核仁，核内有少量染色质。不突向管腔，管腔平滑，略呈圆形或椭圆形(图1)。
第10 d时，CAM毛细血管仍位于外胚层上皮细胞之下。EC改变与第8 d相似。
第12 d时，CAM毛细血管开始向绒毛膜上皮细胞层及其上方移动，与壳膜更加接近。EC核变圆，使核区向血管腔突出，核染色质明显增加。
第14 d时，CAM毛细血管已完成向绒毛膜上皮上方的移动，EC移至外胚层上方，与壳膜紧贴。EC靠近壳膜的一侧明显变薄。
, http://www.100md.com
第16和18 d时，毛细血管EC位于外胚层上皮细胞上方，与壳膜紧贴，与第14 d时所见相同。EC核更圆，核区常向血管腔突出，核染色质深染，富含染色质，EC核多位于远离壳膜的一侧(图2)。
实验组：第18 d时，CAM毛细血管EC移动受到明显抑制，仍停留于外胚层上皮细胞的下方，距壳膜较远(图3)。与对照组中第8和10 d时所见相似。
二、PY对血管EC增殖的影响
光镜下观察处于外胚层绒毛膜上皮细胞下方并与之紧靠的毛细血管或血窦EC的[3H]-TdR 标记率。根据背景，每个细胞大小面积内银粒数少于3个。我们规定如果一个细胞大小面积内银粒数大于10个，则认为这个细胞被标记。在油镜下每次计数100个EC，共4次，对照组与实验组EC的[3H]-TdR 标记率平均值分别为41.5%±3.4%和20.3%±1.5%，两组间有非常显著差异(P<0.01)。
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Fig 1 Three layers of CAM were formed on the 8th days. Capillaries localized in the mesenchyme, and became net beneath the ectoderm (×200)
图1 胚龄第8d时，CAM的3层结构已经形成。毛细血管都位于中胚层内，在绒毛膜上皮细胞下方相互连接成血管网
Fig2 ECs of CAM migrated above the ectoderm on the 14th day after incubation, and localized closely beneath the shell membrane (×200)
图2 胚龄14d时，CAM EC 移至外胚层上方，与壳膜紧贴
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Fig 3 EC migration was significantly inhibited. Even on the 18th day of incubation, EC was still under the ectoderm, farther away from the shell membrane (×200)
图3 胚龄18d时，PY可使CAM EC 移至受到明显抑制，仍停留于外胚层之下，距壳膜较远
讨 论
研究EC移动的方法主要有Boyden室法、吞噬动力轨迹法[4]及linear under-agarose assay等，均为体外EC培养法，十分复杂。Ausprunk等报告用电镜观察EC有无伪足来判断EC移动，但费用太高，而且操作与观察技术要求高而复杂。因此作者设想能否用较简单的办法研究EC移动，果然在一次观察CAM组织学结构时发现孵育第9 d的CAM毛细血管EC都位于外胚层绒毛膜上皮之下，而孵育至第14 d后CAM毛细血管EC大都移至上皮之上，紧贴壳膜。这是因为胚胎发育需要越来越多的氧气弥散之故。PY可抑制CAM毛细血管EC的移动，使第18 d胚龄时早已该移至外胚层之上的毛细血管EC仍停留在外胚层上皮细胞层之下。抑制EC移动可能是其抑制血管新生的重要机制之一。
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在鸡胚发育中，胚龄10 d时CAM毛细血管EC分裂增殖最旺盛，DNA合成达到高峰期，因此，选用第10 d的鸡胚做[3H]-TdR 标记最便于观察。结果表明PY可使CAM毛细血管EC的[3H]-TdR 标记率明显降低，DNA合成减少，即抑制EC增殖，是抑制血管生成的又一重要机制。
CAM上能被[3H]-TdR 标记的细胞除EC外，还有绒毛膜细胞、尿囊内胚层细胞、结缔组织细胞和血细胞。在鉴别一个被标记的细胞是不是EC时，主要根据CAM的组织学结构特点。第10 d时，CAM毛细血管EC大多移近外胚层，集中在绒毛膜上皮下方，毛细血管或血窦管腔清晰，并常可见到红细胞，血管壁上能被标记的细胞只有EC，所以不难识别。
PY是一细胞毒类抗肿瘤抗生素。作者证明它不仅可强烈抑制鸡胚CAM的血管生长，还可抑制S180、Lewis肺癌等肿瘤的血管生成。本实验证明PY抑制血管生成的机制是抑制EC的移动和增殖。另外，郑勤田等在局部注射PY治疗小儿血管瘤和淋巴管瘤这两种内皮细胞增殖性肿瘤临床实践中已取得了满意的疗效[5]。提示PY是一有潜力的血管生长抑制剂。鸡胚CAM可作为研究EC移动和增殖的体内方法，用于血管生成刺激因子和抑制因子的筛选和研究。
, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助(No. 39170829)
[参 考 文 献]
[1] Liu Y, Thor A, Shtivelman, et al. Systemic gene delivery expends the repertoire of effective antiangiogenic agents [J].J Biol Chem, 1999， 274(19):13338～13344.
[2] Leeson TS， Leeson CR. The chorio-allantois of the chick. Light and electron microscopic observations at various times of incubation [J]. J Anat， 1962， 97(4):585～589.
, 百拇医药
[3] Hobson B， Denekamp J. Endothelial proliferation in tumors and normal tissues: continuous labelling studies [J]. Br J Cancer， 1984， 49:405～413.
[4] Zetter BR. Migration of capillary endothelial cells is stimulated by tumor-derived factors [J]. Nature， 1980， 285:41～43.
[5] 郑勤田，伍连康， 容文星，等. 平阳霉素局部注射治疗小儿血管瘤[J]. 中华外科杂志,1991,29(3)：290～291.
[收稿日期]1999-06-11 [修回日期]1999-10-07
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