病毒性心肌炎急性期心肌胶原增生与TGF－β1的表达
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法医学杂志 2000年第4期第16卷 论著
作者：成建定 陈玉川 胡丙杰 黄旭平
单位：中山医科大学法医病理教研室,广东广州510080
关键词：病毒性心肌炎；TGF-β1；病理学；免疫组织化学；胶原
法医学杂志000406
[摘要]目的：研究病毒性心肌炎急性期组织修复性病理改变，探索轻度病毒性心肌炎的法医病理学诊断方法。方法：以适量CoxsackieB3病毒感染Balb/c小鼠造成小鼠轻度病毒性心肌炎。利用苦味酸-酸性品红染色法观察病鼠心肌组织胶原纤维的增生情况，并对病鼠及9例人心肌炎心肌进行TGF-β1的LSAB免疫组化研究。结果：病鼠心肌组织内胶原纤维呈不同程度增生；心肌炎鼠及人心肌炎心肌组织可见大量TGF-β1表达；TGF-β1的表达与胶原纤维的增生呈正相关。结论：病毒性心肌炎急性期即存在组织修复性病理改变，TGF-β1的阳性表达是反映心肌炎症性损伤修复的灵敏指标。
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[中图分类号]DF795.1[文献标识码]A[文章编号]1004-5619(2000)04-0208-02
Expression of TGF- β1 and proliferation of collagen in myocardium in viral myocarditis
Cheng Jianding
(Department of Forensic Pathology, Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
To investigate the tissue repair of acute viral myocarditis,and to explore the diagnostic method of slight viral myocarditis in forensic pathology. Slight viral myocarditis model was induced in Balb/c murine by CVB3. Collagen proliferation in myocardium of mice with myocarditis was observed by special staining.The hearts of mice and human(9 cases) with myocarditis were studied LSAB- immunohistochemically with anti- TGF- β 1 antibody.In the study, the proliferation of collagen was seen in myocardium in acute viral myocarditis. Generous expression of TGF- β 1 was found in the myocardium of mice and human with myocarditis. The quantity of collagen proliferation and expression of TGF- β 1 was positive correlation. It is concluded that the tissue repair exists in acute viral myocarditis and that positive staining of myocardium for TGF- β 1 is a sensitive index of myocardial damage and tissue repair.
, 百拇医药
Key words:viral myocarditis,TGF- β 1,pathology,immunohistochemistry, collagen
近年来，轻度病毒性心肌炎猝死的案例有增多趋势。而心肌变质不明显，间质炎细胞浸润较少的案例是否符合心肌炎的诊断、能否导致猝死存有争议，也是法医学检案中亟待解决的问题之一[1]。转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)是启动和终止组织修复的重要细胞因子。心肌炎急性期是否存在心肌的组织修复性病变，心肌TGF-β1的表达能否灵敏地指示早期/轻度的心肌炎症性损伤？本文主要对实验性小鼠轻度coxsackie B3病毒性心肌炎心肌组织内胶原增生及TGF-β1的表达进行研究。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 病毒、动物及心肌炎模型的建立
嗜心性Coxsackie B3病毒Nancy株，由上海医科大学中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供。毒种经原代人胚肾细胞传代，取上清病毒液，测得TCID50为10-8.5；Balb/c小鼠，4～5周龄，雌雄不拘，由本校动物中心提供。82只鼠随机分为二组，实验组70只，每只腹腔内接种内含103.5 TCID50的病毒稀释液0.15ml,对照组12只，每只腹腔内注射等量的原代人胚肾细胞裂解、离心上清液。小鼠死亡或经处死后，取心脏进行常规固定、脱水、石蜡包埋后，沿心室中段横切面连续切片(厚5μm)。
1.2 人体尸检材料
16例人体心脏标本选自本教研室1999年1月至2000年5月的尸检案例，均为存档蜡块，常规切片(厚5微米)。依Dallars标准，9例为明确心肌炎，7例为非心肌炎。实验分3组：1组为明确心肌炎(从9例中挑选)，5例；2组为界限性心肌炎(从9例中心肌病变不明显的蜡块中选出)，9例；3组为非心肌炎，7例。
, 百拇医药
1.3 主要试剂与仪器
即用型兔抗人、小鼠TGF-β1多克隆抗体，免疫组化超敏LSAB试剂盒，由武汉博士德公司生产。IBAS图象分析仪。
1.4 病理学研究
1.4.1 HE染色
常规HE染色，光镜观察。仿Rezkalla方法[2]计算小鼠心肌病变积分：每张切片取5个高倍视野，计算每个视野中炎细胞浸润及坏死面积与整个视野的面积比，取平均值。无病变计0分，<1/8计1分，1/8～3/8计2分，3/8计3分。
1.4.2 免疫组化LSAB法染色
依HE染色结果，取感染后4～15天内经处死、心肌炎性病变程度不一的24例心肌切片作TGF-β1-LSAB免疫组化染色。染色方法按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗、二抗、抗生蛋白链菌素作对照。对照组12例及人体材料各实验组作同样处理。在图象分析仪上，每张切片随机取5个高倍视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，计算阳性指数(PI)PI=阳性信号面积×阳性信号平均灰度值/测定面积。
, 百拇医药
1.4.3 苦味酸-酸性品红染色
取上述24例小鼠心肌切片作染色，鲜红色为胶原纤维，橘黄色为心肌。按上述方法测算胶原纤维的阳性指数。
1.5 统计学处理
表格中两样本均数比较用t检验，对小鼠心肌胶原纤维阳性指数、TGF-β1阳性指数两变量作相关分析。
2 结果
2.1 HE染色
动物实验：感染后3天内心肌未见异常。第4天，心肌细胞出现肿胀、局灶性颗粒变性，心外膜见少量淋巴细胞浸润；第5天，可见单个心肌细胞溶解；第6天病变明显，可见心肌细胞小灶性坏死、崩解，周围见单核细胞、淋巴细胞浸润。病变于感染后7～9天达高峰，第13天后开始减轻。心肌组织内既可见炎细胞浸润伴心肌细胞明显坏死的炎症坏死区，亦见少量炎细胞浸润、心肌变质不明确的炎细胞浸润区。依Rezkalla方法计算心肌病变积分，本实验组全部心肌病变积分均在2分以下，属轻度心肌炎改变。本文采用仿Rezkalla方法计算心肌病变积分。对照组偶见心外膜下少数淋巴细胞浸润，余无异常。
, 百拇医药
尸检标本：1组见心肌细胞局灶性变性、坏死伴间质淋巴、单核和巨噬细胞浸润；2组见间质少量淋巴、单核细胞浸润，心肌细胞轻度变性或无明显变质；3组心肌组织未见明显异常。
2.2 TGF-β1-LSAB染色
动物实验：对照组12例，心肌组织未见TGF-β1表达。实验组24例，心肌组织见大量TGF-β1表达。TGF-β1阳性部位主要位于单核和巨噬细胞、心肌间质、炎症灶周边心肌细胞的胞膜或胞浆，非炎细胞浸润区亦见散在的小灶性心肌细胞TGF-β1阳性(图1)。
图1 鼠心肌炎部分心肌TGF-β1阳性LSAB×200
, 百拇医药
人体标本：1组伴有或不伴有炎细胞浸润区可见部分心肌细胞TGF-β1阳性；2组中有6例见散在心肌细胞内TGF-β1阳性；3组心肌细胞TGF-β1阴性。
2.3 苦味酸-酸性品红染色
对照组12例，心肌组织见少量胶原纤维；实验组24例，心肌组织内胶原纤维呈不同程度的增生(图2)。小鼠心肌TGF-β1及胶原纤维表达的阳性指数见表1。
表1 鼠心肌组织TGF-β1及胶原纤维的表达(
±S)
组别
n
, 百拇医药
病程(d)
TGF-β1(PI)▲
胶原纤维(PI)▲
对照组
12
饲养10-15
0.56±0.21
0.40±0.20
早期
5
感染后4-5
1.47±0.47*
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0.53±0.35
发展期
5
感染后6-7
2.11±0.50*
0.92±0.43*
高峰期
8
感染后8-12
3.31±0.55*
1.18±0.43*
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消退期
6
感染后13-15
2.32±1.20*
1.22±0.33*
*与对照组比较P<0.05, ▲两变量呈一睚相关(r＝0.78 P<0.001)
图2 鼠心肌炎炎症灶早期大量胶原纤维增生(红色↑)
苦味酸-酸性品红染色 ×200
3 讨论
, 百拇医药
TGF-β1是启动和终止组织修复的重要细胞因子，在炎症修复及纤维化中起着举足轻重的作用[3]。组织损伤后，血小板释放的TGF-β1进入损伤部位并被活化，后者对T细胞、单核细胞、成纤维细胞有强烈的趋化作用，并诱导浸润细胞及常居细胞产生更多的TGF-β1，这种自我诱生放大的TGF-β1便促使成纤维细胞分泌大量的细胞外基质，启动组织修复及纤维化。研究表明，成纤维细胞在TGF-β1的作用下，先合成大量的纤维连接蛋白，随后I、III型胶原表达增多[4]。TGF-β1适时地增高表达是组织损伤后修复的正常反应，若持续增高则导致组织纤维化。
实验发现，小鼠病毒性心肌炎急性期，HE染色虽未见到心肌纤维化，但苦味酸-酸性品红染色显示感染后6～7天心肌已经有明显的胶原增生；免疫组化染色证实，感染后4～5天，心肌炎性病变尚不明显时，心肌TGF-β1已经开始大量表达；进一步分析发现，胶原增生与TGF-β1的表达随病程发展大致呈上升趋势，且两变量呈正相关。这提示，病毒性心肌炎急性期即存在组织修复性病变，心肌TGF-β1的阳性表达与胶原增生为主的组织修复密切相关；心肌TGF-β1在心肌炎性病变不明显，胶原尚未大量增生时就已开始表达，因此，它是反映心肌早期/轻度炎症性损伤和修复启动的灵敏指标。
, 百拇医药
心肌胶原网对于维持心肌正常结构，协调心肌舒缩，修复坏死心肌具重要作用。病毒性心肌炎急性期，胶原增生的意义可能在于最大程度地限制心肌组织坏死的范围，维护心脏功能，修复坏死心肌。TGF-β1是启动这一保护性反应的主要细胞因子，TGF-β1的阳性表达是存在组织损伤及修复的可靠而灵敏的标记。本研究证实，早期/轻度的病毒性心肌炎因病变尚未充分发展，光镜下无心肌炎的典型组织学改变，但已发生心肌损伤，组织修复已经启动，TGF-β1-LSAB染色能灵敏地反映这一炎症过程，并在人体材料上得到初步验证。本文首次从炎症修复的角度研究早期/轻度病毒性心肌炎的组织学诊断方法，实验结果表明，TGF-β1-LSAB染色可望为轻度、不典型心肌炎的法医病理学诊断提供一项灵敏而实用的辅助诊断手段，值得进一步研究。
参 考 文 献 :
[1]成建定，陈玉川，胡丙杰.病毒性心肌炎纤维连接蛋白的免疫组化初步研究[J].法医学杂志，1999，15(1)：9.
, 百拇医药
[2] Rezkalla S, Kloner RA, Khatib G, et al. Beneficial effects of captopril in acute coxsackie virus murine myocarditis[J].Circulation,1990,81(3):1039.
[3] Border WA, Ruolanti E. Transforming growth factor- β in disease : the dark side of tissue repair[J].J Clin Invest,1992,90(1):1- 2.
[4] Zhang K,Garner W, Cohen L,et al.Increased type I and III collagen and transforming growth factor- β 1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar[J].J Invest Dermatol,1995,104(5):750.
(收 稿 日 期 ： 2000- 06- 14 修 回 日 期 ： 2000- 08- 28), http://www.100md.com
单位：中山医科大学法医病理教研室,广东广州510080
关键词：病毒性心肌炎；TGF-β1；病理学；免疫组织化学；胶原
法医学杂志000406
[摘要]目的：研究病毒性心肌炎急性期组织修复性病理改变，探索轻度病毒性心肌炎的法医病理学诊断方法。方法：以适量CoxsackieB3病毒感染Balb/c小鼠造成小鼠轻度病毒性心肌炎。利用苦味酸-酸性品红染色法观察病鼠心肌组织胶原纤维的增生情况，并对病鼠及9例人心肌炎心肌进行TGF-β1的LSAB免疫组化研究。结果：病鼠心肌组织内胶原纤维呈不同程度增生；心肌炎鼠及人心肌炎心肌组织可见大量TGF-β1表达；TGF-β1的表达与胶原纤维的增生呈正相关。结论：病毒性心肌炎急性期即存在组织修复性病理改变，TGF-β1的阳性表达是反映心肌炎症性损伤修复的灵敏指标。
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[中图分类号]DF795.1[文献标识码]A[文章编号]1004-5619(2000)04-0208-02
Expression of TGF- β1 and proliferation of collagen in myocardium in viral myocarditis
Cheng Jianding
(Department of Forensic Pathology, Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
To investigate the tissue repair of acute viral myocarditis,and to explore the diagnostic method of slight viral myocarditis in forensic pathology. Slight viral myocarditis model was induced in Balb/c murine by CVB3. Collagen proliferation in myocardium of mice with myocarditis was observed by special staining.The hearts of mice and human(9 cases) with myocarditis were studied LSAB- immunohistochemically with anti- TGF- β 1 antibody.In the study, the proliferation of collagen was seen in myocardium in acute viral myocarditis. Generous expression of TGF- β 1 was found in the myocardium of mice and human with myocarditis. The quantity of collagen proliferation and expression of TGF- β 1 was positive correlation. It is concluded that the tissue repair exists in acute viral myocarditis and that positive staining of myocardium for TGF- β 1 is a sensitive index of myocardial damage and tissue repair.
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Key words:viral myocarditis,TGF- β 1,pathology,immunohistochemistry, collagen
近年来，轻度病毒性心肌炎猝死的案例有增多趋势。而心肌变质不明显，间质炎细胞浸润较少的案例是否符合心肌炎的诊断、能否导致猝死存有争议，也是法医学检案中亟待解决的问题之一[1]。转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)是启动和终止组织修复的重要细胞因子。心肌炎急性期是否存在心肌的组织修复性病变，心肌TGF-β1的表达能否灵敏地指示早期/轻度的心肌炎症性损伤？本文主要对实验性小鼠轻度coxsackie B3病毒性心肌炎心肌组织内胶原增生及TGF-β1的表达进行研究。
1 材料与方法
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1.1 病毒、动物及心肌炎模型的建立
嗜心性Coxsackie B3病毒Nancy株，由上海医科大学中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供。毒种经原代人胚肾细胞传代，取上清病毒液，测得TCID50为10-8.5；Balb/c小鼠，4～5周龄，雌雄不拘，由本校动物中心提供。82只鼠随机分为二组，实验组70只，每只腹腔内接种内含103.5 TCID50的病毒稀释液0.15ml,对照组12只，每只腹腔内注射等量的原代人胚肾细胞裂解、离心上清液。小鼠死亡或经处死后，取心脏进行常规固定、脱水、石蜡包埋后，沿心室中段横切面连续切片(厚5μm)。
1.2 人体尸检材料
16例人体心脏标本选自本教研室1999年1月至2000年5月的尸检案例，均为存档蜡块，常规切片(厚5微米)。依Dallars标准，9例为明确心肌炎，7例为非心肌炎。实验分3组：1组为明确心肌炎(从9例中挑选)，5例；2组为界限性心肌炎(从9例中心肌病变不明显的蜡块中选出)，9例；3组为非心肌炎，7例。
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1.3 主要试剂与仪器
即用型兔抗人、小鼠TGF-β1多克隆抗体，免疫组化超敏LSAB试剂盒，由武汉博士德公司生产。IBAS图象分析仪。
1.4 病理学研究
1.4.1 HE染色
常规HE染色，光镜观察。仿Rezkalla方法[2]计算小鼠心肌病变积分：每张切片取5个高倍视野，计算每个视野中炎细胞浸润及坏死面积与整个视野的面积比，取平均值。无病变计0分，<1/8计1分，1/8～3/8计2分，3/8计3分。
1.4.2 免疫组化LSAB法染色
依HE染色结果，取感染后4～15天内经处死、心肌炎性病变程度不一的24例心肌切片作TGF-β1-LSAB免疫组化染色。染色方法按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗、二抗、抗生蛋白链菌素作对照。对照组12例及人体材料各实验组作同样处理。在图象分析仪上，每张切片随机取5个高倍视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，计算阳性指数(PI)PI=阳性信号面积×阳性信号平均灰度值/测定面积。
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1.4.3 苦味酸-酸性品红染色
取上述24例小鼠心肌切片作染色，鲜红色为胶原纤维，橘黄色为心肌。按上述方法测算胶原纤维的阳性指数。
1.5 统计学处理
表格中两样本均数比较用t检验，对小鼠心肌胶原纤维阳性指数、TGF-β1阳性指数两变量作相关分析。
2 结果
2.1 HE染色
动物实验：感染后3天内心肌未见异常。第4天，心肌细胞出现肿胀、局灶性颗粒变性，心外膜见少量淋巴细胞浸润；第5天，可见单个心肌细胞溶解；第6天病变明显，可见心肌细胞小灶性坏死、崩解，周围见单核细胞、淋巴细胞浸润。病变于感染后7～9天达高峰，第13天后开始减轻。心肌组织内既可见炎细胞浸润伴心肌细胞明显坏死的炎症坏死区，亦见少量炎细胞浸润、心肌变质不明确的炎细胞浸润区。依Rezkalla方法计算心肌病变积分，本实验组全部心肌病变积分均在2分以下，属轻度心肌炎改变。本文采用仿Rezkalla方法计算心肌病变积分。对照组偶见心外膜下少数淋巴细胞浸润，余无异常。
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尸检标本：1组见心肌细胞局灶性变性、坏死伴间质淋巴、单核和巨噬细胞浸润；2组见间质少量淋巴、单核细胞浸润，心肌细胞轻度变性或无明显变质；3组心肌组织未见明显异常。
2.2 TGF-β1-LSAB染色
动物实验：对照组12例，心肌组织未见TGF-β1表达。实验组24例，心肌组织见大量TGF-β1表达。TGF-β1阳性部位主要位于单核和巨噬细胞、心肌间质、炎症灶周边心肌细胞的胞膜或胞浆，非炎细胞浸润区亦见散在的小灶性心肌细胞TGF-β1阳性(图1)。
图1 鼠心肌炎部分心肌TGF-β1阳性LSAB×200
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人体标本：1组伴有或不伴有炎细胞浸润区可见部分心肌细胞TGF-β1阳性；2组中有6例见散在心肌细胞内TGF-β1阳性；3组心肌细胞TGF-β1阴性。
2.3 苦味酸-酸性品红染色
对照组12例，心肌组织见少量胶原纤维；实验组24例，心肌组织内胶原纤维呈不同程度的增生(图2)。小鼠心肌TGF-β1及胶原纤维表达的阳性指数见表1。
表1 鼠心肌组织TGF-β1及胶原纤维的表达(
±S)组别
n
, 百拇医药
病程(d)
TGF-β1(PI)▲
胶原纤维(PI)▲
对照组
12
饲养10-15
0.56±0.21
0.40±0.20
早期
5
感染后4-5
1.47±0.47*
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0.53±0.35
发展期
5
感染后6-7
2.11±0.50*
0.92±0.43*
高峰期
8
感染后8-12
3.31±0.55*
1.18±0.43*
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消退期
6
感染后13-15
2.32±1.20*
1.22±0.33*
*与对照组比较P<0.05, ▲两变量呈一睚相关(r＝0.78 P<0.001)
图2 鼠心肌炎炎症灶早期大量胶原纤维增生(红色↑)
苦味酸-酸性品红染色 ×200
3 讨论
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TGF-β1是启动和终止组织修复的重要细胞因子，在炎症修复及纤维化中起着举足轻重的作用[3]。组织损伤后，血小板释放的TGF-β1进入损伤部位并被活化，后者对T细胞、单核细胞、成纤维细胞有强烈的趋化作用，并诱导浸润细胞及常居细胞产生更多的TGF-β1，这种自我诱生放大的TGF-β1便促使成纤维细胞分泌大量的细胞外基质，启动组织修复及纤维化。研究表明，成纤维细胞在TGF-β1的作用下，先合成大量的纤维连接蛋白，随后I、III型胶原表达增多[4]。TGF-β1适时地增高表达是组织损伤后修复的正常反应，若持续增高则导致组织纤维化。
实验发现，小鼠病毒性心肌炎急性期，HE染色虽未见到心肌纤维化，但苦味酸-酸性品红染色显示感染后6～7天心肌已经有明显的胶原增生；免疫组化染色证实，感染后4～5天，心肌炎性病变尚不明显时，心肌TGF-β1已经开始大量表达；进一步分析发现，胶原增生与TGF-β1的表达随病程发展大致呈上升趋势，且两变量呈正相关。这提示，病毒性心肌炎急性期即存在组织修复性病变，心肌TGF-β1的阳性表达与胶原增生为主的组织修复密切相关；心肌TGF-β1在心肌炎性病变不明显，胶原尚未大量增生时就已开始表达，因此，它是反映心肌早期/轻度炎症性损伤和修复启动的灵敏指标。
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心肌胶原网对于维持心肌正常结构，协调心肌舒缩，修复坏死心肌具重要作用。病毒性心肌炎急性期，胶原增生的意义可能在于最大程度地限制心肌组织坏死的范围，维护心脏功能，修复坏死心肌。TGF-β1是启动这一保护性反应的主要细胞因子，TGF-β1的阳性表达是存在组织损伤及修复的可靠而灵敏的标记。本研究证实，早期/轻度的病毒性心肌炎因病变尚未充分发展，光镜下无心肌炎的典型组织学改变，但已发生心肌损伤，组织修复已经启动，TGF-β1-LSAB染色能灵敏地反映这一炎症过程，并在人体材料上得到初步验证。本文首次从炎症修复的角度研究早期/轻度病毒性心肌炎的组织学诊断方法，实验结果表明，TGF-β1-LSAB染色可望为轻度、不典型心肌炎的法医病理学诊断提供一项灵敏而实用的辅助诊断手段，值得进一步研究。
参 考 文 献 :
[1]成建定，陈玉川，胡丙杰.病毒性心肌炎纤维连接蛋白的免疫组化初步研究[J].法医学杂志，1999，15(1)：9.
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[2] Rezkalla S, Kloner RA, Khatib G, et al. Beneficial effects of captopril in acute coxsackie virus murine myocarditis[J].Circulation,1990,81(3):1039.
[3] Border WA, Ruolanti E. Transforming growth factor- β in disease : the dark side of tissue repair[J].J Clin Invest,1992,90(1):1- 2.
[4] Zhang K,Garner W, Cohen L,et al.Increased type I and III collagen and transforming growth factor- β 1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar[J].J Invest Dermatol,1995,104(5):750.
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