PCR检测中国对虾暴发性流行病毒靶基因的克隆和序列分析
作者：夏春 刘津
单位：中国农业大学动物医学院传染病与微生物教研室，北京100094
关键词：中国对虾；皮下和造血组织坏死杆状病毒；对虾暴发性流行病
病毒学报990411 中图分类号：S945.4；Q343.1 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0364-04
SEQUENCE AND CHARACTERIZATION OF THE PCR-TARGETED DNA FRAGMENT OF THE HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC NECROSIS BACULOVIRUS
XIA Chun, LIU Jin
(Department of Microbiology and Infection, College of Veterinary Medicine, Agricultural University, Beijing 100094, China, E-mail: xiachun@ public. east. cn. net)
, 百拇医药
Abstract: An explosive epidemic disease of shrimp had occurred in China and the south Pacific coast. The causative agent is a new baculovirus called hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) in China, and the pathogen is very much similar to Japanese panaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) which caused mass mortality of shrimp. In order to distinguish both HHNBV and PRDV at molecular level, we have sequenced the PCR-targeted DNA fragment of HHNBV. One pair of PCR primers were prepared based on the PRDV DNA. The sequence of the PCR-targeted DNA of HHNBV is 975bp in length, and shares 99.7% homology with the PRDV. The sequence of PCR-targeted DNA of HHNBV-XIA differs from PRDV DNA in deleting three nucleotides (CAT) at 510～512 site. These characteristics of the sequence classified HHNBV and PRDV as strains of different genotypes.
, 百拇医药
Key words: Penaeid shrimp; Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus; Explosive epidemic disease
我国对虾暴发性流行病自1988年首次在台湾省沿海暴发后，从闽浙蔓延到黄海，逐年都导致了我国养殖对虾暴发性、毁灭性死亡。其疫情至今尚未得到完全控制。经研究，皮下和造血组织坏死杆状病毒(Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus，HHNBV)是引起我国沿海对虾暴发性死亡的病原，我国学者称由此引起的疾病为中国对虾暴发性流行病[1]。日本学者确认对虾暴发性死亡的病原是对虾杆状DNA病毒(PRDV)，台湾学者确认是白斑杆状病毒(WSBV)[2]。从不同地域分离的三种病毒在形态上十分相似，感染对虾后都呈现消化器官上皮细胞核和淋巴样细胞核肥大，大虾鳃盖可出现白斑等病理变化。并且，这三种病毒都不具备一般杆状病毒感染后所产生的包涵体，属杆状病毒属C杆状病毒亚群中的新成员。根据这些特点，推测近年来发生在我国、日本和泰国等沿海的对虾暴发性流行病都是由同类病毒引起[3]。我们曾报道过根据日本PRDV的靶DNA序列，建立了Nested-PCR法检测我国HHNBV[4]。为了比较HHNBV与PRDV毒株基因型的差异，有利于各国进行此类病毒的分子流行病学调查，本研究对用于PCR检测HHNBV(对虾暴发性流行病毒)的靶DNA进行了克隆和序列分析。
, 百拇医药
HHNBV基因组DNA从阳性中国对虾胃腺中提取[5]。根据PRDV病毒的基因组序列设计两引物。正引物序列为5＇-CATGGCTGCTTCACAGAC-3＇；反引物序列为5＇-GGCTGGAGAGGACAAGAC-3＇。采用PCR法扩增HHNBV靶DNA基因。其中正、反引物各添加100pmol，模板DNA添加量为1μg，PCR反应总体积为50μl。PCR程序是首先94℃热变性1分钟，然后55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。PCR反应均在HYBAID公司的PCR Sprint仪进行，每次32个循环。PCR产物经1.2%低溶点琼脂糖电泳后，回收约980bp处的DNA带，再与T-Easy载体连接，转化XL-F’感受态细胞，经筛选白斑、酶切鉴定，最后，用T7和SP6引物、ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit在ABI 377型DNA自动测序仪测定克隆全序列。采用GENETYX 7.3软件进行序列分析。
PCR扩增HHNBV靶DNA基因的结果如图1所示，在980bp处有一条清晰的带，这与预期目标相同。测序HHNBV靶DNA结果如图2所示，克隆片段全长975bp，暂命名为HHNBV-XIA片段，并登录入DDBJ/EMBL/GenBank基因库，序号为AB021155。该片段GC含量为38.5%。其中，在565位、637位、644和703位分别存在单一的Sau 3AⅠ、HaeⅢ、BstⅪ和Alw26Ⅰ酶切位点。这与日本PRDV靶DNA序列是一致的。HHNBV与PRDV靶DNA序列[5]比较，其核酸序列的同源性为99.7%，其中HHNBV在510～512位间少了3核苷酸，即CAT序列(图2)。
, 百拇医药
图1 PCR扩增HHNBV靶DNA基因
Figure 1 PCR amplification of targeted DNA fragment of HHNBV
M：DNA marker； 1：HHNBV-XIA.
图2 HHNBV的PCR靶DNA(HHNBV-XIA)序列
注：HHNBV-XIA序列已登录入DDBJ/EMBL/GenBank基因库，序号(Accession number)为AB021155.
Figure 2 Sequence of the PCR-targeted DNA fragment (HHNBV-XIA)
, http://www.100md.com
Note：HHNBV-XIA sequence has been recorded into the DDBJ/EMBL/GenBank， the Accession number is AB021155.
日本学者在研究PCR检测PRDV病毒时，首先采用了EcoRⅠ酶切PRDV基因组，然后从中选择了一条1.4kb大小的带进行了克隆、测序，输入基因库比较，在不存在相关序列的前提下，将该序列作为PCR检测PRDV的靶DNA。同样，我们也证明了用于检测PRDV的PCR条件适用于检测HHNBV[4]。然而，本研究对PCR检测HHNBV的靶DNA序列(HHNBV-XIA)进行了测序，结果表明了HHNBV与PRDV靶DNA序列间存在差异。根据这一差异推测，暴发于我国的HHNBV和日本的PRDV可能为不同基因型的毒株，但是这两种毒株是否由台湾传播到大陆和日本，尚待证明。然而，本研究结果为进行南太平洋沿岸对虾病毒病的分子流行病学调查提供了依据。
, http://www.100md.com 基金项目：国家教委留学回国人员科研启动基金
作者简介：夏春(1962-),男，湖北，副教授，Ph.D. 1990～1993年获日本爱媛大学博士学位，1993～1995年完成中国农业大学博士后，研究方向为微生物学与免疫学。E-mail:xiachun@public.east.cn.net
参考文献
1 黄捷，宋晓铃，于佳，等.对虾暴发性流行病的病原和病理学[J].海洋水产研究，1995，1：1-7.
2 夏春.对虾病毒病的研究进展[J].世界农业，1997，97(10)：40-41.
3 NRIA, National Research Institute of Aquaculture, New Approaches to Viral Diseases of Aquatic Animals[J], NRIA International Workshop, January 21-24, 1997, Kyoto, Japan.
4 夏春，黄捷.PCR法检测对虾皮下和造血组织坏死杆状病毒[J].微生物学报，1999年，39(2)：60-71.
5 Kimura T, Yamano K, Nakano H, et al. Detection of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) by PCR[J]. Fish Pathology, 1996, 31(2):93-98.
来稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-01-26, http://www.100md.com
单位：中国农业大学动物医学院传染病与微生物教研室，北京100094
关键词：中国对虾；皮下和造血组织坏死杆状病毒；对虾暴发性流行病
病毒学报990411 中图分类号：S945.4；Q343.1 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0364-04
SEQUENCE AND CHARACTERIZATION OF THE PCR-TARGETED DNA FRAGMENT OF THE HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC NECROSIS BACULOVIRUS
XIA Chun, LIU Jin
(Department of Microbiology and Infection, College of Veterinary Medicine, Agricultural University, Beijing 100094, China, E-mail: xiachun@ public. east. cn. net)
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Abstract: An explosive epidemic disease of shrimp had occurred in China and the south Pacific coast. The causative agent is a new baculovirus called hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) in China, and the pathogen is very much similar to Japanese panaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) which caused mass mortality of shrimp. In order to distinguish both HHNBV and PRDV at molecular level, we have sequenced the PCR-targeted DNA fragment of HHNBV. One pair of PCR primers were prepared based on the PRDV DNA. The sequence of the PCR-targeted DNA of HHNBV is 975bp in length, and shares 99.7% homology with the PRDV. The sequence of PCR-targeted DNA of HHNBV-XIA differs from PRDV DNA in deleting three nucleotides (CAT) at 510～512 site. These characteristics of the sequence classified HHNBV and PRDV as strains of different genotypes.
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Key words: Penaeid shrimp; Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus; Explosive epidemic disease
我国对虾暴发性流行病自1988年首次在台湾省沿海暴发后，从闽浙蔓延到黄海，逐年都导致了我国养殖对虾暴发性、毁灭性死亡。其疫情至今尚未得到完全控制。经研究，皮下和造血组织坏死杆状病毒(Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus，HHNBV)是引起我国沿海对虾暴发性死亡的病原，我国学者称由此引起的疾病为中国对虾暴发性流行病[1]。日本学者确认对虾暴发性死亡的病原是对虾杆状DNA病毒(PRDV)，台湾学者确认是白斑杆状病毒(WSBV)[2]。从不同地域分离的三种病毒在形态上十分相似，感染对虾后都呈现消化器官上皮细胞核和淋巴样细胞核肥大，大虾鳃盖可出现白斑等病理变化。并且，这三种病毒都不具备一般杆状病毒感染后所产生的包涵体，属杆状病毒属C杆状病毒亚群中的新成员。根据这些特点，推测近年来发生在我国、日本和泰国等沿海的对虾暴发性流行病都是由同类病毒引起[3]。我们曾报道过根据日本PRDV的靶DNA序列，建立了Nested-PCR法检测我国HHNBV[4]。为了比较HHNBV与PRDV毒株基因型的差异，有利于各国进行此类病毒的分子流行病学调查，本研究对用于PCR检测HHNBV(对虾暴发性流行病毒)的靶DNA进行了克隆和序列分析。
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HHNBV基因组DNA从阳性中国对虾胃腺中提取[5]。根据PRDV病毒的基因组序列设计两引物。正引物序列为5＇-CATGGCTGCTTCACAGAC-3＇；反引物序列为5＇-GGCTGGAGAGGACAAGAC-3＇。采用PCR法扩增HHNBV靶DNA基因。其中正、反引物各添加100pmol，模板DNA添加量为1μg，PCR反应总体积为50μl。PCR程序是首先94℃热变性1分钟，然后55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。PCR反应均在HYBAID公司的PCR Sprint仪进行，每次32个循环。PCR产物经1.2%低溶点琼脂糖电泳后，回收约980bp处的DNA带，再与T-Easy载体连接，转化XL-F’感受态细胞，经筛选白斑、酶切鉴定，最后，用T7和SP6引物、ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit在ABI 377型DNA自动测序仪测定克隆全序列。采用GENETYX 7.3软件进行序列分析。
PCR扩增HHNBV靶DNA基因的结果如图1所示，在980bp处有一条清晰的带，这与预期目标相同。测序HHNBV靶DNA结果如图2所示，克隆片段全长975bp，暂命名为HHNBV-XIA片段，并登录入DDBJ/EMBL/GenBank基因库，序号为AB021155。该片段GC含量为38.5%。其中，在565位、637位、644和703位分别存在单一的Sau 3AⅠ、HaeⅢ、BstⅪ和Alw26Ⅰ酶切位点。这与日本PRDV靶DNA序列是一致的。HHNBV与PRDV靶DNA序列[5]比较，其核酸序列的同源性为99.7%，其中HHNBV在510～512位间少了3核苷酸，即CAT序列(图2)。
, 百拇医药
图1 PCR扩增HHNBV靶DNA基因
Figure 1 PCR amplification of targeted DNA fragment of HHNBV
M：DNA marker； 1：HHNBV-XIA.
图2 HHNBV的PCR靶DNA(HHNBV-XIA)序列
注：HHNBV-XIA序列已登录入DDBJ/EMBL/GenBank基因库，序号(Accession number)为AB021155.
Figure 2 Sequence of the PCR-targeted DNA fragment (HHNBV-XIA)
, http://www.100md.com
Note：HHNBV-XIA sequence has been recorded into the DDBJ/EMBL/GenBank， the Accession number is AB021155.
日本学者在研究PCR检测PRDV病毒时，首先采用了EcoRⅠ酶切PRDV基因组，然后从中选择了一条1.4kb大小的带进行了克隆、测序，输入基因库比较，在不存在相关序列的前提下，将该序列作为PCR检测PRDV的靶DNA。同样，我们也证明了用于检测PRDV的PCR条件适用于检测HHNBV[4]。然而，本研究对PCR检测HHNBV的靶DNA序列(HHNBV-XIA)进行了测序，结果表明了HHNBV与PRDV靶DNA序列间存在差异。根据这一差异推测，暴发于我国的HHNBV和日本的PRDV可能为不同基因型的毒株，但是这两种毒株是否由台湾传播到大陆和日本，尚待证明。然而，本研究结果为进行南太平洋沿岸对虾病毒病的分子流行病学调查提供了依据。
, http://www.100md.com 基金项目：国家教委留学回国人员科研启动基金
作者简介：夏春(1962-),男，湖北，副教授，Ph.D. 1990～1993年获日本爱媛大学博士学位，1993～1995年完成中国农业大学博士后，研究方向为微生物学与免疫学。E-mail:xiachun@public.east.cn.net
参考文献
1 黄捷，宋晓铃，于佳，等.对虾暴发性流行病的病原和病理学[J].海洋水产研究，1995，1：1-7.
2 夏春.对虾病毒病的研究进展[J].世界农业，1997，97(10)：40-41.
3 NRIA, National Research Institute of Aquaculture, New Approaches to Viral Diseases of Aquatic Animals[J], NRIA International Workshop, January 21-24, 1997, Kyoto, Japan.
4 夏春，黄捷.PCR法检测对虾皮下和造血组织坏死杆状病毒[J].微生物学报，1999年，39(2)：60-71.
5 Kimura T, Yamano K, Nakano H, et al. Detection of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) by PCR[J]. Fish Pathology, 1996, 31(2):93-98.
来稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-01-26, http://www.100md.com