百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达
作者：于康震 Burnette W N Kaslow H R Mar V L Ahmad S Yilma T D
单位：于康震 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001)；Burnette W N Kaslow H R Mar V L Ahmad S Yilma T D(美国加利福尼亚大学兽医学院，Davis,CA 95616)
关键词：百日咳毒素；S1亚单位；重组杆状病毒；表达
中国免疫学杂志990202 中国图书分类号 R378.4 Q784
摘 要 目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是重要的保护性抗原，其S1亚单位具有ADP-核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的S1变异子，开展了本研究。方法：通过添加人流感病毒血凝素基因信号序列或嵌膜序列的方法，对天然和变异S1亚单位基因片段作了遗传学修饰。然后使用重组杆状病毒技术使这些S1亚单位在昆虫细胞和昆虫幼虫中实现了高水平表达。结果：这些重组S1的表达水平介于每万个昆虫卵细胞0.18～1.93 μg或每只昆虫幼虫0.46～4.98 mg之间。天然信号肽和HA信号肽均可完整表达，但后者的切割效率(61%～81%)比前者(16%～19%)更高。所有带信号肽的S1亚单位均呈异质性表达(双带)。结论：重组S1亚单位的表达是高效和正确的，表达的异质性是由于信号肽切割不完全的缘故。
, http://www.100md.com
Expression of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin in recombinant baculoviruses
YU Kang-Zhen.
Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001
Burnette W N,Kaslow H R,Mar V L et al.
International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents,School of Veterinary Medicine,University of California,Davis,CA 95616
, 百拇医药
Abstract Objective:Pertusis toxin(PT)is both a major virulence factor of bordetella pertussis and an important immunoprotective antigen against whooping cough.The S1 subunit of PT possesses ADP-ribosyltransferase activity as well as epitopes that induce protective immunity.The aim of the present research is to produce the S1 mutant abundantly which is in lack of the enzyme activity constructed previously.Methods:Have modified both native and mutant S1 subunit-encoding DNA fragments by the addition of the native S1 signal sequence or the signal sequence of human influenza virus hemagglutinin(HA) gene.The modified S1 subunits were abundantly expressed by recombinant autographa californica nuclear polyhedrosis viruses in insect cells and larva.Results:The expression levels ranged from 0.18～1.93 μg/104 spodoptera frugiperda ovarian cells,or 0.46～4.98 mg/larva of spodoptera exigua.The native and HA signal sequences were both expressed intact,although the HA signal was processed more efficiently(61%～81%) tnan the native one(16%～19%).All S1 with signals produced two bands.Conclusion:All recombinant S1 subunits were produced correctly to high levels.The heterologous expression of rS1 proteins is the result of incomplete signal cleavage.
, 百拇医药
Key words Pertussis toxin(PT) S1 subunit Recombinant baculovirus(rBV) Expression
百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，有时伴有神经症状。其病原菌——百日咳杆菌能产生十多种毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一种外毒素，由5种不同亚单位组成A-B结构。A结构即S1亚单位，分子量为26 kD，具有鸟嘌呤结合蛋白(G蛋白)特异性核糖转移酶活性，而G蛋白与腺苷酸环化酶抑制信号的传导有关。由于PT可与多种细胞结合，从而抑制G蛋白介导的多种信号传递系统，产生细胞毒性作用。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。近年研究均致力于S1亚单位的遗传学脱毒。Burnette等应用定点突变术构建了一种S1变异子(Arg 9→Lys，或R9→K)[1]，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持其保护性抗原决定簇，这为安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基础。重组杆状病毒(rBV)载体以其高效、真实地表达外源基因的特性而被广泛应用。本研究中，我们对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并用rBV载体系统高水平地表达了这些重组S1亚单位，为其免疫学特性评价奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株、病毒及细胞系 大肠杆菌DH5α株用于质粒扩增；野生型杆状病毒Autographa california核多角体病毒株(wtAcNPV)用于同源重组；昆虫(Spodoptera frugiperda)卵细胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白质表达。
1.2 主要试剂 工具酶及DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)；杆状病毒转移载体质粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亚单位(List Biological Laboratory公司)；兔抗PT高免血清的制备见文献[2]；抗S1亚单位单克隆抗体1B7由Sato博士惠赠[3]；碱性磷酸酶标记的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗体(Zymed Laboratory公司)；蛋白定量试剂盒(Sigma)。
1.3 S1亚单位编码基因的修饰 在编码天然S1亚单位DNA片段的克隆和定点突变的基础上[1，2]，使用pUC18及pUC19载体构建了遗传学修饰的S1 DNA克隆(图1)。流感病毒血凝素(HA)信号序列(77 bp)和嵌膜序列为人工合成[4，5]。应用双脱氧序列分析技术确证这些S1 DNA片段序列的正确性。
, 百拇医药
图1 S1亚单位编码基因的分子修饰
Fig.1 Modification of S1 DNA molecules
1.4 杆状病毒转移载体的构建 上述8种pUC重组质粒(pUCS1)分离相应的S1 DNA片段，分将其亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1392或pVL1393(视克隆方向而定)中。原位杂交和酶切分析筛选和鉴定重组pVL质粒(pVLS1)。
1.5 DNA转染及rBV纯化 采用线性AcNPV转染技术(Invitrogen公司)。3轮蚀斑筛选和纯化后将斑点杂交和免疫斑点试验双阳性的病毒蚀斑克隆在Sf9细胞中增殖。
1.6 原位及斑点杂交 采用随机引物标记技术将S1/2 DNA片段经32P标记后用作探针，检测重组菌落的rBVs中的S1 DNA。菌落的原位杂交按常规方法进行。斑点杂交时先将rBV感染的细胞用1 mol/L NaOH裂解后加到硝酸纤维素膜上，进行杂交。
, 百拇医药
1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(Western blot)和免疫斑点(Immunoblot)试验
1.7.1 SDS-PAGE 感染样品(Sf21细胞、昆虫幼虫或血淋巴)经SDS-PAGE分离，分离胶浓度为12%。以纯化的PT作阳性对照，wtAcNPV感染的昆虫幼虫或表达牛水疱性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21细胞用作阴性对照[6]。
1.7.2 免疫印迹 参照文献[7]进行。以兔抗PT高免血清、抗S1亚单位的单克隆抗体(1B7)和碱性磷酸酶标记的羊抗兔(或鼠)IgG用于免疫学检测。
1.7.3 免疫斑点 方法与免疫印迹相似，不同：1.待测样品经超声裂解后溶于Tris缓冲盐溶液(TBS，pH 7.4)中，然后直接点到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上；2.纯化的S1亚单位作rS1定量的标准。PVDF膜用轻矿物油透明后进行定量扫描分析。
, http://www.100md.com
1.8 rS1表达水平的测定
1.8.1 rS1表达动力学分析 用10个感染量(m.o.i.)的rBV感染Sf21细胞，在不同时间收集这些细胞，进行免疫斑点试验，分析rS1亚单位的表达动力学，以据此在最佳时间收集表达的S1蛋白。此外，用5×105个蚀斑形成单位(pfu)的rBV感染昆虫幼虫(Spodoptera exigua，体重0.65～0.71 g)，感染后第4天收集幼虫及其血淋巴。
1.8.2 rS1表达量的测定 rBV感染的昆虫细胞或昆虫幼虫悬液总蛋白用蛋白定量试剂盒(Lowry法)测定。对每个样品进行SDS-PAGE分析，根据rS1蛋白在总蛋白中的百分比和总蛋白浓度计算出每种rS1亚单位的表达量。除使用该物理定量法外，还同时应用免疫斑点试验(免疫定量法)测定了每种rS1亚单位的表达量。
1.9 rS1亚单位信号肽处理的分析 将rS1蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，然后用考马斯亮蓝染色。将rS1条带逐一切下，加到ABI 477气相微量序列测定仪中作N端氨基酸序列分析(10个循环)。同时，rS1蛋白经免疫印迹分析并用轻矿物油对印迹膜透明处理后，对特异条带体积进行定量扫描。微量序列分析证实低分子量条带缺乏信号肽以及高分子量条带含有信号肽后，信号肽的切割效率按低分子量条带体积与两条带总体积之比计算。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 rBVs的构建 将修饰后的S1 DNA分子从相应pUCS1质粒中切下并分别亚克隆到杆状病毒转移载体中。然后通过重组pVLS1 DNA和wtAcNPV DNA在Sf9细胞中的同源重组获得rBV。蚀斑纯化后，利用免疫斑点或免疫印迹试验筛选出了可表达8种不同rS1蛋白的rBV。
2.2 rS1亚单位的表达 8种不同rBV在昆虫细胞中的表达动力学表明，病毒感染后72 h，rS1蛋白的表达水平最高。由于昆虫幼虫多在感染后5～6 d死亡，故收获rS1蛋白的最佳时间为接毒后第4天。应用SDS-PAGE和免疫印迹(图2、3)以及免疫斑点试验对rS1蛋白在昆虫细胞和幼虫中的表达情况作了分析，并测定了每种rS1亚单位的表现分子量(MW)，见表1。结果表明，缺少信号肽的rS1呈现单一条带，其表现MW与理论值一致，而带信号肽的rS1亚单位均呈双带，并其表现MW与理论MW有细微差别。带天然信号序列的rS1表达水平最高，带流感病毒信号序列的rS1次之，而无信号序列或带流感病毒信号和嵌膜序列的rS1表达量最低。免疫定量法与物理定量法测得的表达量有明显差异，这表明天然和重组S1亚单位的免疫反应性可能不同。
, 百拇医药
2.3 rS1亚单位信号序列的处理 每种rS1条带氨基端的微量序列分析表明有4种不同的N-末端存在(表2)，即：天然信号肽(Met-Arg-Cys-Thr-Arh-Ala-Ile-Arg-Gln-Thr)，天然S1亚单位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr)，变异S1亚单位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Lys-Tyr)，流感病毒信号肽(Met-Lys-Ala-Lys-Leu-Leu-Val-Leu-Leu-Tyr)。这表明细菌信号肽和流感病毒信号肽的处理是正确的，但不完全。在该真核表达系统中，流感病毒信号肽较天然细菌信号肽的切割更有效。
图2 rS1亚单位在Sf21昆虫细胞中表达的免疫印迹分析
Fig.2 Western blot analysis of insect cells infected with rBVs
, http://www.100md.com
图3 rS1亚单位在昆虫幼虫中表达的免疫印迹分析
Fig.3 Western blot analysis of insect infected with rBVs表1 rS1亚单位在昆虫细胞和幼虫中的表达情况
Tab.1 Expression of rS1 subunits in insect cells and larva rS1 subunit
Predicted
MW(kD)
Apparent
MW(kD)
% age1)
, 百拇医药
Expression level1)
Expression level2)
Sf21
Larva
μg/104 Sf21
mg/larva
ng/104 Sf21
μg/larva
1
29.7
28
, 百拇医药
14.7
0.97
48.7
26.0
25
1-4
29.7
28
26.0
25
25.3
20.8
1.93
, 百拇医药
4.98
57.3
66.9
2
26.0
26
4.1
1.9
0.24
0.46
32.9
56.9
2-4
, 百拇医药
26.0
26
5.9
4.4
0.36
1.14
32.1
147.6
3
27.8
27
26.0
25
, 百拇医药
15.5
1.03
9.1
3-4
27.8
27
26.0
25
12.6
13.1
0.83
3.00
61.2
, 百拇医药
214.1
3A
29.9
28
28.1
26
3.1
0.18
49.6
3A-4
29.9
28
28.1
, 百拇医药
26
3.0
1.9
0.18
0.40
75.3
100.1
Note:1)each sample was analyzed by SDS-PAGE and gel-scanning,then measured by Lowry method;2)each sample was analyzed by immunoblot and the result was read by UVmax kinetic microplate reader表2 rS1亚单位的信号肽处理与N-末端序列分析
, 百拇医药
Tab.2 N-terminus of rS1 subunits and signal processing rS1 subunit
N-terminus(band)
% cleavage1)
Sf21
Larva
1
Native signal sequence(upper)
Native S1 subunit(lower)
19
1-4
, http://www.100md.com
Native signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
17
16
2
Native S1 subunit(single)
2-4
Mutant S1 subunit(single)
3
Influenza virus signal sequence(upper)
, 百拇医药
Native S1 subunit(lower)
63
3-4
Influenza virus signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
69
61
3A
Influenza virus signal sequence(upper)
Native S1 subunit(lower)
, 百拇医药
65
3A-4
Influenza virus signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
73
81
Note:1)signal-cleaving efficiency was calculated based on the 3-dimension volume of each lower band and the total volume of each rS1 subunit(two bands),which were obtained by densitometerization of the Western blot pattern of each rS1 protein
, 百拇医药
3 讨论
PT是百日咳疫苗主要保护性免疫原。传统百日咳疫苗有较大毒副作用，这可能与PT的ADP-核糖转移酶活性有关。曾使用多种化学试剂对PT进行脱毒，但化学脱毒法要么不能去除全部酶活性，要么对分子的修饰作用太大，以致破坏了其免疫原性。Burnette等通过单一氨基酸替换(R9→K)技术构建了一种S1变异子[1]，该变异子的酶活性消失，但仍保持其保护性决定簇，这为百日咳疫苗的研制开辟了新途径。鉴于此我们对天然及变异S1亚单位进行了一系列分子修饰，并实现了这些亚单位在rBV系统中的高水平表达。所有的rS1蛋白均可被抗PT的抗血清和抗S1亚单位的单克隆抗体识别。
Matsuura等应用rBV载体表达了一种非成熟的S1亚单位(PT S1，相当于本研究中的rS1/1)[8]。在分子量、信号肽处理等方面，本研究与其相似，但表达水平是他们的20～130倍。本研究中所有带信号肽的rS1/1均为双带，表明MW与理论值相比有细微差别。微量蛋白序列分析证实2种信号序列的表达和切割都是正确的，但均不完全。计算机辅助分析(Wisconsin软件，结果未示)表明，rS1分子上没有潜在的糖基化位点。因此，rS1蛋白的异源性表达是信号肽不完全切割的结果，而表明MW偏移并不意味着信号肽处理不正确或rS1分子的糖基化。除凝胶扫描(即物理定量法)外，我们还使用免疫斑点试验(免疫定量法，表1)和ELISA(结果未示)对rS1的表达量进行了分析。后两种免疫方法测定结果很相似，但同凝胶扫描结果显著不同。免疫定量法测得的表达量明显低于物理定量法的结果，且rS1/1和rS1/1-4的相对含量明显偏低，而免疫印迹分析(图2、3)与物理定量法的结果更相符，因此认为rS1亚单位的免疫反应性可能受信号肽和样品处理方式(变性与否)的影响。成熟S1亚单位的N端(1～17或1～18氨基酸残基)有一个显性决定簇[1]，rS1/1和rS1/1-4上携带的天然信号序列(34个残基)可能遮盖此位点。在免疫斑点和ELISA试验中，样品未经变性处理，因此rS1蛋白的高级结构仍然存在。在免疫印迹分析中，样品经变性处理，故这种遮盖效应连同高级结构将不复存在。rS1亚单位的生物学特性及免疫学特性将通过进一步的研究进行评价。
, 百拇医药
百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达 本课题受国家自然科学基金资助(No.39580022)
作者单位：Burnette W N Mar V L 美国Amgen公司,Thousand Oaks,CA 91320；Kaslow H R 美国南加利福尼亚大学医学院,Los Angeles,CA 90033
作者简介：于康震，男，37岁，研究员，博士生导师；
Yilma T D,男，53岁，教授，博士生导师
4 参考文献
1 Burnette W N,Cieplak W,Mar V L.Pertussis toxin S1 mutant with reduced enzyme activity and a conserved protective epitope.Science,1988;242:72
, 百拇医药
2 Burnette W N,Mar V L,Ciplak W.Direct expression of Bordetella pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia coli.Bio/Technol,1988;6:699
3 Sato H,Ito A,Chiba J.Monoclonal antibody against pertussis toxin:effect on toxin activity and pertussis infections.Infec Immun,1984;46:422
4 Davis A R,Hiti A L,Nayak D P.Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain(HON1) of influenza virus.Gene,1980;10:205
, 百拇医药
5 Doyle C,Sambrook J,Gething M J.Analysis of progressive deletions of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza hemagglutinin.J Cell Biol,1986;103:1193
6 Ahmad S,Bassiri M,Banerjee A K et al.Immunological characterization of the VSV nucleocapsid(N) protein expressed by recombinant baculovirus in Spodoptera exigua larva:use in differential diagnosis between vaccinated and infected animals.Virol,1993;192:207
7 Burnette W N.“Western blotting”:electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.Analyt Biochem,1981;112:195
8 Matsuura Y,Sato H,Sato Y.Expression of the S1 sub-unit of pertussis toxin using a recombinant baculovirus.Develop Biol Standard,1991;73:79
〔收稿1997-08-29 二次修回1998-06-07〕, http://www.100md.com
单位：于康震 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001)；Burnette W N Kaslow H R Mar V L Ahmad S Yilma T D(美国加利福尼亚大学兽医学院，Davis,CA 95616)
关键词：百日咳毒素；S1亚单位；重组杆状病毒；表达
中国免疫学杂志990202 中国图书分类号 R378.4 Q784
摘 要 目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是重要的保护性抗原，其S1亚单位具有ADP-核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的S1变异子，开展了本研究。方法：通过添加人流感病毒血凝素基因信号序列或嵌膜序列的方法，对天然和变异S1亚单位基因片段作了遗传学修饰。然后使用重组杆状病毒技术使这些S1亚单位在昆虫细胞和昆虫幼虫中实现了高水平表达。结果：这些重组S1的表达水平介于每万个昆虫卵细胞0.18～1.93 μg或每只昆虫幼虫0.46～4.98 mg之间。天然信号肽和HA信号肽均可完整表达，但后者的切割效率(61%～81%)比前者(16%～19%)更高。所有带信号肽的S1亚单位均呈异质性表达(双带)。结论：重组S1亚单位的表达是高效和正确的，表达的异质性是由于信号肽切割不完全的缘故。
, http://www.100md.com
Expression of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin in recombinant baculoviruses
YU Kang-Zhen.
Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001
Burnette W N,Kaslow H R,Mar V L et al.
International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents,School of Veterinary Medicine,University of California,Davis,CA 95616
, 百拇医药
Abstract Objective:Pertusis toxin(PT)is both a major virulence factor of bordetella pertussis and an important immunoprotective antigen against whooping cough.The S1 subunit of PT possesses ADP-ribosyltransferase activity as well as epitopes that induce protective immunity.The aim of the present research is to produce the S1 mutant abundantly which is in lack of the enzyme activity constructed previously.Methods:Have modified both native and mutant S1 subunit-encoding DNA fragments by the addition of the native S1 signal sequence or the signal sequence of human influenza virus hemagglutinin(HA) gene.The modified S1 subunits were abundantly expressed by recombinant autographa californica nuclear polyhedrosis viruses in insect cells and larva.Results:The expression levels ranged from 0.18～1.93 μg/104 spodoptera frugiperda ovarian cells,or 0.46～4.98 mg/larva of spodoptera exigua.The native and HA signal sequences were both expressed intact,although the HA signal was processed more efficiently(61%～81%) tnan the native one(16%～19%).All S1 with signals produced two bands.Conclusion:All recombinant S1 subunits were produced correctly to high levels.The heterologous expression of rS1 proteins is the result of incomplete signal cleavage.
, 百拇医药
Key words Pertussis toxin(PT) S1 subunit Recombinant baculovirus(rBV) Expression
百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，有时伴有神经症状。其病原菌——百日咳杆菌能产生十多种毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一种外毒素，由5种不同亚单位组成A-B结构。A结构即S1亚单位，分子量为26 kD，具有鸟嘌呤结合蛋白(G蛋白)特异性核糖转移酶活性，而G蛋白与腺苷酸环化酶抑制信号的传导有关。由于PT可与多种细胞结合，从而抑制G蛋白介导的多种信号传递系统，产生细胞毒性作用。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。近年研究均致力于S1亚单位的遗传学脱毒。Burnette等应用定点突变术构建了一种S1变异子(Arg 9→Lys，或R9→K)[1]，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持其保护性抗原决定簇，这为安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基础。重组杆状病毒(rBV)载体以其高效、真实地表达外源基因的特性而被广泛应用。本研究中，我们对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并用rBV载体系统高水平地表达了这些重组S1亚单位，为其免疫学特性评价奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株、病毒及细胞系 大肠杆菌DH5α株用于质粒扩增；野生型杆状病毒Autographa california核多角体病毒株(wtAcNPV)用于同源重组；昆虫(Spodoptera frugiperda)卵细胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白质表达。
1.2 主要试剂 工具酶及DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)；杆状病毒转移载体质粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亚单位(List Biological Laboratory公司)；兔抗PT高免血清的制备见文献[2]；抗S1亚单位单克隆抗体1B7由Sato博士惠赠[3]；碱性磷酸酶标记的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗体(Zymed Laboratory公司)；蛋白定量试剂盒(Sigma)。
1.3 S1亚单位编码基因的修饰 在编码天然S1亚单位DNA片段的克隆和定点突变的基础上[1，2]，使用pUC18及pUC19载体构建了遗传学修饰的S1 DNA克隆(图1)。流感病毒血凝素(HA)信号序列(77 bp)和嵌膜序列为人工合成[4，5]。应用双脱氧序列分析技术确证这些S1 DNA片段序列的正确性。
, 百拇医药
图1 S1亚单位编码基因的分子修饰
Fig.1 Modification of S1 DNA molecules
1.4 杆状病毒转移载体的构建 上述8种pUC重组质粒(pUCS1)分离相应的S1 DNA片段，分将其亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1392或pVL1393(视克隆方向而定)中。原位杂交和酶切分析筛选和鉴定重组pVL质粒(pVLS1)。
1.5 DNA转染及rBV纯化 采用线性AcNPV转染技术(Invitrogen公司)。3轮蚀斑筛选和纯化后将斑点杂交和免疫斑点试验双阳性的病毒蚀斑克隆在Sf9细胞中增殖。
1.6 原位及斑点杂交 采用随机引物标记技术将S1/2 DNA片段经32P标记后用作探针，检测重组菌落的rBVs中的S1 DNA。菌落的原位杂交按常规方法进行。斑点杂交时先将rBV感染的细胞用1 mol/L NaOH裂解后加到硝酸纤维素膜上，进行杂交。
, 百拇医药
1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(Western blot)和免疫斑点(Immunoblot)试验
1.7.1 SDS-PAGE 感染样品(Sf21细胞、昆虫幼虫或血淋巴)经SDS-PAGE分离，分离胶浓度为12%。以纯化的PT作阳性对照，wtAcNPV感染的昆虫幼虫或表达牛水疱性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21细胞用作阴性对照[6]。
1.7.2 免疫印迹 参照文献[7]进行。以兔抗PT高免血清、抗S1亚单位的单克隆抗体(1B7)和碱性磷酸酶标记的羊抗兔(或鼠)IgG用于免疫学检测。
1.7.3 免疫斑点 方法与免疫印迹相似，不同：1.待测样品经超声裂解后溶于Tris缓冲盐溶液(TBS，pH 7.4)中，然后直接点到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上；2.纯化的S1亚单位作rS1定量的标准。PVDF膜用轻矿物油透明后进行定量扫描分析。
, http://www.100md.com
1.8 rS1表达水平的测定
1.8.1 rS1表达动力学分析 用10个感染量(m.o.i.)的rBV感染Sf21细胞，在不同时间收集这些细胞，进行免疫斑点试验，分析rS1亚单位的表达动力学，以据此在最佳时间收集表达的S1蛋白。此外，用5×105个蚀斑形成单位(pfu)的rBV感染昆虫幼虫(Spodoptera exigua，体重0.65～0.71 g)，感染后第4天收集幼虫及其血淋巴。
1.8.2 rS1表达量的测定 rBV感染的昆虫细胞或昆虫幼虫悬液总蛋白用蛋白定量试剂盒(Lowry法)测定。对每个样品进行SDS-PAGE分析，根据rS1蛋白在总蛋白中的百分比和总蛋白浓度计算出每种rS1亚单位的表达量。除使用该物理定量法外，还同时应用免疫斑点试验(免疫定量法)测定了每种rS1亚单位的表达量。
1.9 rS1亚单位信号肽处理的分析 将rS1蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，然后用考马斯亮蓝染色。将rS1条带逐一切下，加到ABI 477气相微量序列测定仪中作N端氨基酸序列分析(10个循环)。同时，rS1蛋白经免疫印迹分析并用轻矿物油对印迹膜透明处理后，对特异条带体积进行定量扫描。微量序列分析证实低分子量条带缺乏信号肽以及高分子量条带含有信号肽后，信号肽的切割效率按低分子量条带体积与两条带总体积之比计算。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 rBVs的构建 将修饰后的S1 DNA分子从相应pUCS1质粒中切下并分别亚克隆到杆状病毒转移载体中。然后通过重组pVLS1 DNA和wtAcNPV DNA在Sf9细胞中的同源重组获得rBV。蚀斑纯化后，利用免疫斑点或免疫印迹试验筛选出了可表达8种不同rS1蛋白的rBV。
2.2 rS1亚单位的表达 8种不同rBV在昆虫细胞中的表达动力学表明，病毒感染后72 h，rS1蛋白的表达水平最高。由于昆虫幼虫多在感染后5～6 d死亡，故收获rS1蛋白的最佳时间为接毒后第4天。应用SDS-PAGE和免疫印迹(图2、3)以及免疫斑点试验对rS1蛋白在昆虫细胞和幼虫中的表达情况作了分析，并测定了每种rS1亚单位的表现分子量(MW)，见表1。结果表明，缺少信号肽的rS1呈现单一条带，其表现MW与理论值一致，而带信号肽的rS1亚单位均呈双带，并其表现MW与理论MW有细微差别。带天然信号序列的rS1表达水平最高，带流感病毒信号序列的rS1次之，而无信号序列或带流感病毒信号和嵌膜序列的rS1表达量最低。免疫定量法与物理定量法测得的表达量有明显差异，这表明天然和重组S1亚单位的免疫反应性可能不同。
, 百拇医药
2.3 rS1亚单位信号序列的处理 每种rS1条带氨基端的微量序列分析表明有4种不同的N-末端存在(表2)，即：天然信号肽(Met-Arg-Cys-Thr-Arh-Ala-Ile-Arg-Gln-Thr)，天然S1亚单位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr)，变异S1亚单位(Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Lys-Tyr)，流感病毒信号肽(Met-Lys-Ala-Lys-Leu-Leu-Val-Leu-Leu-Tyr)。这表明细菌信号肽和流感病毒信号肽的处理是正确的，但不完全。在该真核表达系统中，流感病毒信号肽较天然细菌信号肽的切割更有效。
图2 rS1亚单位在Sf21昆虫细胞中表达的免疫印迹分析
Fig.2 Western blot analysis of insect cells infected with rBVs
, http://www.100md.com
图3 rS1亚单位在昆虫幼虫中表达的免疫印迹分析
Fig.3 Western blot analysis of insect infected with rBVs表1 rS1亚单位在昆虫细胞和幼虫中的表达情况
Tab.1 Expression of rS1 subunits in insect cells and larva rS1 subunit
Predicted
MW(kD)
Apparent
MW(kD)
% age1)
, 百拇医药
Expression level1)
Expression level2)
Sf21
Larva
μg/104 Sf21
mg/larva
ng/104 Sf21
μg/larva
1
29.7
28
, 百拇医药
14.7
0.97
48.7
26.0
25
1-4
29.7
28
26.0
25
25.3
20.8
1.93
, 百拇医药
4.98
57.3
66.9
2
26.0
26
4.1
1.9
0.24
0.46
32.9
56.9
2-4
, 百拇医药
26.0
26
5.9
4.4
0.36
1.14
32.1
147.6
3
27.8
27
26.0
25
, 百拇医药
15.5
1.03
9.1
3-4
27.8
27
26.0
25
12.6
13.1
0.83
3.00
61.2
, 百拇医药
214.1
3A
29.9
28
28.1
26
3.1
0.18
49.6
3A-4
29.9
28
28.1
, 百拇医药
26
3.0
1.9
0.18
0.40
75.3
100.1
Note:1)each sample was analyzed by SDS-PAGE and gel-scanning,then measured by Lowry method;2)each sample was analyzed by immunoblot and the result was read by UVmax kinetic microplate reader表2 rS1亚单位的信号肽处理与N-末端序列分析
, 百拇医药
Tab.2 N-terminus of rS1 subunits and signal processing rS1 subunit
N-terminus(band)
% cleavage1)
Sf21
Larva
1
Native signal sequence(upper)
Native S1 subunit(lower)
19
1-4
, http://www.100md.com
Native signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
17
16
2
Native S1 subunit(single)
2-4
Mutant S1 subunit(single)
3
Influenza virus signal sequence(upper)
, 百拇医药
Native S1 subunit(lower)
63
3-4
Influenza virus signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
69
61
3A
Influenza virus signal sequence(upper)
Native S1 subunit(lower)
, 百拇医药
65
3A-4
Influenza virus signal sequence(upper)
Mutant S1 subunit(lower)
73
81
Note:1)signal-cleaving efficiency was calculated based on the 3-dimension volume of each lower band and the total volume of each rS1 subunit(two bands),which were obtained by densitometerization of the Western blot pattern of each rS1 protein
, 百拇医药
3 讨论
PT是百日咳疫苗主要保护性免疫原。传统百日咳疫苗有较大毒副作用，这可能与PT的ADP-核糖转移酶活性有关。曾使用多种化学试剂对PT进行脱毒，但化学脱毒法要么不能去除全部酶活性，要么对分子的修饰作用太大，以致破坏了其免疫原性。Burnette等通过单一氨基酸替换(R9→K)技术构建了一种S1变异子[1]，该变异子的酶活性消失，但仍保持其保护性决定簇，这为百日咳疫苗的研制开辟了新途径。鉴于此我们对天然及变异S1亚单位进行了一系列分子修饰，并实现了这些亚单位在rBV系统中的高水平表达。所有的rS1蛋白均可被抗PT的抗血清和抗S1亚单位的单克隆抗体识别。
Matsuura等应用rBV载体表达了一种非成熟的S1亚单位(PT S1，相当于本研究中的rS1/1)[8]。在分子量、信号肽处理等方面，本研究与其相似，但表达水平是他们的20～130倍。本研究中所有带信号肽的rS1/1均为双带，表明MW与理论值相比有细微差别。微量蛋白序列分析证实2种信号序列的表达和切割都是正确的，但均不完全。计算机辅助分析(Wisconsin软件，结果未示)表明，rS1分子上没有潜在的糖基化位点。因此，rS1蛋白的异源性表达是信号肽不完全切割的结果，而表明MW偏移并不意味着信号肽处理不正确或rS1分子的糖基化。除凝胶扫描(即物理定量法)外，我们还使用免疫斑点试验(免疫定量法，表1)和ELISA(结果未示)对rS1的表达量进行了分析。后两种免疫方法测定结果很相似，但同凝胶扫描结果显著不同。免疫定量法测得的表达量明显低于物理定量法的结果，且rS1/1和rS1/1-4的相对含量明显偏低，而免疫印迹分析(图2、3)与物理定量法的结果更相符，因此认为rS1亚单位的免疫反应性可能受信号肽和样品处理方式(变性与否)的影响。成熟S1亚单位的N端(1～17或1～18氨基酸残基)有一个显性决定簇[1]，rS1/1和rS1/1-4上携带的天然信号序列(34个残基)可能遮盖此位点。在免疫斑点和ELISA试验中，样品未经变性处理，因此rS1蛋白的高级结构仍然存在。在免疫印迹分析中，样品经变性处理，故这种遮盖效应连同高级结构将不复存在。rS1亚单位的生物学特性及免疫学特性将通过进一步的研究进行评价。
, 百拇医药
百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达 本课题受国家自然科学基金资助(No.39580022)
作者单位：Burnette W N Mar V L 美国Amgen公司,Thousand Oaks,CA 91320；Kaslow H R 美国南加利福尼亚大学医学院,Los Angeles,CA 90033
作者简介：于康震，男，37岁，研究员，博士生导师；
Yilma T D,男，53岁，教授，博士生导师
4 参考文献
1 Burnette W N,Cieplak W,Mar V L.Pertussis toxin S1 mutant with reduced enzyme activity and a conserved protective epitope.Science,1988;242:72
, 百拇医药
2 Burnette W N,Mar V L,Ciplak W.Direct expression of Bordetella pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia coli.Bio/Technol,1988;6:699
3 Sato H,Ito A,Chiba J.Monoclonal antibody against pertussis toxin:effect on toxin activity and pertussis infections.Infec Immun,1984;46:422
4 Davis A R,Hiti A L,Nayak D P.Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain(HON1) of influenza virus.Gene,1980;10:205
, 百拇医药
5 Doyle C,Sambrook J,Gething M J.Analysis of progressive deletions of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza hemagglutinin.J Cell Biol,1986;103:1193
6 Ahmad S,Bassiri M,Banerjee A K et al.Immunological characterization of the VSV nucleocapsid(N) protein expressed by recombinant baculovirus in Spodoptera exigua larva:use in differential diagnosis between vaccinated and infected animals.Virol,1993;192:207
7 Burnette W N.“Western blotting”:electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.Analyt Biochem,1981;112:195
8 Matsuura Y,Sato H,Sato Y.Expression of the S1 sub-unit of pertussis toxin using a recombinant baculovirus.Develop Biol Standard,1991;73:79
〔收稿1997-08-29 二次修回1998-06-07〕, http://www.100md.com