反相高效液相色谱法测定清经胶囊中芍药甙含量
作者：张琦 陈登志 李亚萍
单位：张琦 陈登志(四川恩威中医药研究所,四川 成都 610041)；李亚萍(成都中医药大学附属医院)
关键词：清经胶囊；芍药甙；高效液相色谱法；中成药
成都中医药大学学报000227摘 要：将清经胶囊用水超声处理，以C18为固定相，甲醇一水(34 : 66)为流动相，232nm为检测波长，用HPLC法测定其中芍药甙含量。在所拟条件下，芍药苷的线性范围为 35.8～716ng，平均加样回收率为100.82%。
中图分类号：R284.1；R944.5 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)02-0051-02
基金项目：四川省中医管理局科研基金资助课题
, 百拇医药
作者简介：张琦，女，1958年1月生；医学学士，高级工程师；研究方向：中药工艺和质量标准研究。
清经胶囊系成都中医药大学附属医院杨家林教授的经验方，由牡丹皮、黄柏、地黄、地骨皮、白芍等10味药组成，具有清热凉血、滋肾养阴、调经止血之功效，用于月经先期伴见量多、经色鲜红、心烦口渴、舌红脉数等血热证，经多年临床使用效果良好。在将该处方进行新药研制时，为控制工艺质量，对所含水溶性成分芍药甙进行了含量测定。现将测定结果报告于下。
1 材料与方法
1.1 材料
惠普1100型高效液相色谱仪，附二级管阵列检测器(DAD)、柱温箱(Col Comp)、四元泵(QuatPump)、在线脱气机(Degasser)，电脑及HP色谱工作站(HP chemstation )；波达1004型超声波清洗器，TGL-16G台式高速离心机。赛多利斯BP210D型电子分析天平(1/10万)；过滤装置及微孔滤膜(0.45μm)。
, 百拇医药
芍药甙对照品(含量测定用)购于中国药品生物制品检定所，在本实验条件下根据归一化法计算其含量大于98%，符合含量测定用对照品的要求，流动相和对照品溶液用水为高纯水(西南物理研究所提供)，其余试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件
分析柱：ODS Hypersil(200mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇—水(34∶66)；流速0.8 mL/min；检测波长232 nm；柱温35℃；进样体积10μL。在此色谱条件下，供试品色谱图中芍药甙能与其它成分很好分离，其阴性对照( 按处方制备缺丹皮、白芍的阴性供试品)在芍药甙峰处无任何干扰(见图1)。
a.芍药苷对照品 b.清径胶囊 c.缺牡丹皮、白芍的清经胶囊
图1 清经胶囊中芍药苷色谱图
, http://www.100md.com
1.3 供试品溶液制备
取样品胶囊10粒，于乳钵中研磨均匀，取约0.15 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超声处理30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀、离心(12000r/min)10 min，上清液作为供试品溶液。
1.4 方法可行性研究
1.4.1 标准曲线及线性范围
精密称取芍药甙对照品适量，用50%甲醇配制成浓度为3.58、7.16、11.68、23.36、35.80、71.60μg/mL的标准溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪。以峰面积积分值对进样浓度(μg/mL)进行回归，得回归方程 Y＝17.148X+1.3333 。结果表明:进样量在35.8～716ng范围内呈良好的线性关系(r＝0.9999 ) 。
, 百拇医药 1.4.2 提取溶剂及提取时间考察
用同一批号供试品，以不同溶剂在相同条件下提取测定，结果见表1 。根据实验结果，以水为提取溶剂，进行不同时间超声提取比较 ，结果见表2。
表 1 不同溶剂提取结果 (n＝3) 提取溶剂
水
流动相
50%甲醇
50%乙醇
甲 醇
平均含量(mg/g)
3.49
3.45
, 百拇医药
3.48
3.48
2.92
表 2 不同提取时间测定结果 (n＝3) 提取时间
15min
30min
45min
60min
平均含量(mg/g)
3.40
3.41
3.42
, http://www.100md.com
3.42
1.4.3 进样精密度与方法精密度试验
取对照品溶液(0.0358mg/mL)10μL连续5次进样，峰面积积分值分别为 599.9、594.9、602.2、604.6和600.8，RSD＝0.598% 。取同一批清经胶囊测定5次，其含量分别为 3.43、3.44、3.50、3.43、3.40(mg/g)，RSD＝1.07%。
1.4.4 对照品溶液与供试品溶液稳定性考察
将不同日期配制的对照品溶液(冰箱密闭放置)，以新配制对照品溶液为标准，在同一天内测定含量，结果见表 3 。按样品测定方法在9h内测定同一供试品溶液，结果芍药甙浓度无明显变化，RSD＝1.74%(见表 4 )。表3 对照品溶液稳定性考察结果 配制后天数
0
, http://www.100md.com
1
7
35
配制浓度(mg/mL)
0.064
0.0388
0.0390
0.0412
沉淀浓度(mg/mL)
0.0468
0.0385
0.0392
0.0412
, http://www.100md.com
相对浓度(%)
0.862
-0.773
0.513
对照组溶液在冰箱中保存表4 供试品溶液稳定性考察 测定时间
11∶07
15∶12
18∶47
19∶08
19∶57
峰 面 积
325.15
, 百拇医药
321.44
313.66
313.27
313.65
1.4.5 加样回收率试验
取一定量供试品(平均含量3.433 mg/g) 精密称定，加入对照品适量，测定含量并计算回收率，结果见表 5 。表5 供试品加样回收试验结果 样品量
(g)
样品含芍药甙
(mg)
加入芍药甙
(mg)
, http://www.100md.com
测定结果
(%)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
0.1709
0.5867
0.4905
1.0821
101.00
, 百拇医药
0.1559
0.5352
0.4905
1.0435
103.63
0.1631
0.5599
0.4905
1.0530
100.53
100.82
1.72
, 百拇医药 0.0895
0.3073
0.2336
0.5389
99.16
0.1020
0.3502
0.2336
0.45877
101.67
0.0814
0.2794
0.2336
, http://www.100md.com
0.5106
98.95
2 结 果
结果见表6。
表6 三批样品中芍药甙含量测定结果 批 号
测 定 次 数
平均含量(mg/粒)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
960807
1.200
, 百拇医药
1.204
1.201
1.202
960812
1.221
1.201
1.198
1.207
960816
1.218
1.214
1.220
1.217
, 百拇医药
3 讨 论
3.1 本处方君药牡丹皮与臣药白芍均含水溶性成分芍药甙。据文献报道，前者含量为 0.479%～1.091% ，后者含量为 0.264%～3.24%[1]，故我们摸索了芍药甙的高效液相色谱分离条件与方法。将芍药甙作为水溶性成分定量指标考察本制剂水提取工艺具有指导意义。同时，为有效鉴别本复方制剂中的牡丹皮和白芍的存在，在正式质量标准中制定了相应的薄层层析定性鉴别方法。
3.2 本试验曾就甲醇—水(34∶66)、乙腈—水(20∶80)和甲醇—36%醋酸—异丙醇—水(25∶2∶2∶71)3种流动相进行比较，结果以前者为好。本法快速准确，重现性好，稳定可靠，可作为该制剂质量控制方法之一。
参考文献
1 王宝木王 王.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994.608，614
(收稿日期：1999-11-21), 百拇医药
单位：张琦 陈登志(四川恩威中医药研究所,四川 成都 610041)；李亚萍(成都中医药大学附属医院)
关键词：清经胶囊；芍药甙；高效液相色谱法；中成药
成都中医药大学学报000227摘 要：将清经胶囊用水超声处理，以C18为固定相，甲醇一水(34 : 66)为流动相，232nm为检测波长，用HPLC法测定其中芍药甙含量。在所拟条件下，芍药苷的线性范围为 35.8～716ng，平均加样回收率为100.82%。
中图分类号：R284.1；R944.5 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)02-0051-02
基金项目：四川省中医管理局科研基金资助课题
, 百拇医药
作者简介：张琦，女，1958年1月生；医学学士，高级工程师；研究方向：中药工艺和质量标准研究。
清经胶囊系成都中医药大学附属医院杨家林教授的经验方，由牡丹皮、黄柏、地黄、地骨皮、白芍等10味药组成，具有清热凉血、滋肾养阴、调经止血之功效，用于月经先期伴见量多、经色鲜红、心烦口渴、舌红脉数等血热证，经多年临床使用效果良好。在将该处方进行新药研制时，为控制工艺质量，对所含水溶性成分芍药甙进行了含量测定。现将测定结果报告于下。
1 材料与方法
1.1 材料
惠普1100型高效液相色谱仪，附二级管阵列检测器(DAD)、柱温箱(Col Comp)、四元泵(QuatPump)、在线脱气机(Degasser)，电脑及HP色谱工作站(HP chemstation )；波达1004型超声波清洗器，TGL-16G台式高速离心机。赛多利斯BP210D型电子分析天平(1/10万)；过滤装置及微孔滤膜(0.45μm)。
, 百拇医药
芍药甙对照品(含量测定用)购于中国药品生物制品检定所，在本实验条件下根据归一化法计算其含量大于98%，符合含量测定用对照品的要求，流动相和对照品溶液用水为高纯水(西南物理研究所提供)，其余试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件
分析柱：ODS Hypersil(200mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇—水(34∶66)；流速0.8 mL/min；检测波长232 nm；柱温35℃；进样体积10μL。在此色谱条件下，供试品色谱图中芍药甙能与其它成分很好分离，其阴性对照( 按处方制备缺丹皮、白芍的阴性供试品)在芍药甙峰处无任何干扰(见图1)。
a.芍药苷对照品 b.清径胶囊 c.缺牡丹皮、白芍的清经胶囊
图1 清经胶囊中芍药苷色谱图
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1.3 供试品溶液制备
取样品胶囊10粒，于乳钵中研磨均匀，取约0.15 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超声处理30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀、离心(12000r/min)10 min，上清液作为供试品溶液。
1.4 方法可行性研究
1.4.1 标准曲线及线性范围
精密称取芍药甙对照品适量，用50%甲醇配制成浓度为3.58、7.16、11.68、23.36、35.80、71.60μg/mL的标准溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪。以峰面积积分值对进样浓度(μg/mL)进行回归，得回归方程 Y＝17.148X+1.3333 。结果表明:进样量在35.8～716ng范围内呈良好的线性关系(r＝0.9999 ) 。
, 百拇医药 1.4.2 提取溶剂及提取时间考察
用同一批号供试品，以不同溶剂在相同条件下提取测定，结果见表1 。根据实验结果，以水为提取溶剂，进行不同时间超声提取比较 ，结果见表2。
表 1 不同溶剂提取结果 (n＝3) 提取溶剂
水
流动相
50%甲醇
50%乙醇
甲 醇
平均含量(mg/g)
3.49
3.45
, 百拇医药
3.48
3.48
2.92
表 2 不同提取时间测定结果 (n＝3) 提取时间
15min
30min
45min
60min
平均含量(mg/g)
3.40
3.41
3.42
, http://www.100md.com
3.42
1.4.3 进样精密度与方法精密度试验
取对照品溶液(0.0358mg/mL)10μL连续5次进样，峰面积积分值分别为 599.9、594.9、602.2、604.6和600.8，RSD＝0.598% 。取同一批清经胶囊测定5次，其含量分别为 3.43、3.44、3.50、3.43、3.40(mg/g)，RSD＝1.07%。
1.4.4 对照品溶液与供试品溶液稳定性考察
将不同日期配制的对照品溶液(冰箱密闭放置)，以新配制对照品溶液为标准，在同一天内测定含量，结果见表 3 。按样品测定方法在9h内测定同一供试品溶液，结果芍药甙浓度无明显变化，RSD＝1.74%(见表 4 )。表3 对照品溶液稳定性考察结果 配制后天数
0
, http://www.100md.com
1
7
35
配制浓度(mg/mL)
0.064
0.0388
0.0390
0.0412
沉淀浓度(mg/mL)
0.0468
0.0385
0.0392
0.0412
, http://www.100md.com
相对浓度(%)
0.862
-0.773
0.513
对照组溶液在冰箱中保存表4 供试品溶液稳定性考察 测定时间
11∶07
15∶12
18∶47
19∶08
19∶57
峰 面 积
325.15
, 百拇医药
321.44
313.66
313.27
313.65
1.4.5 加样回收率试验
取一定量供试品(平均含量3.433 mg/g) 精密称定，加入对照品适量，测定含量并计算回收率，结果见表 5 。表5 供试品加样回收试验结果 样品量
(g)
样品含芍药甙
(mg)
加入芍药甙
(mg)
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测定结果
(%)
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
0.1709
0.5867
0.4905
1.0821
101.00
, 百拇医药
0.1559
0.5352
0.4905
1.0435
103.63
0.1631
0.5599
0.4905
1.0530
100.53
100.82
1.72
, 百拇医药 0.0895
0.3073
0.2336
0.5389
99.16
0.1020
0.3502
0.2336
0.45877
101.67
0.0814
0.2794
0.2336
, http://www.100md.com
0.5106
98.95
2 结 果
结果见表6。
表6 三批样品中芍药甙含量测定结果 批 号
测 定 次 数
平均含量(mg/粒)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
960807
1.200
, 百拇医药
1.204
1.201
1.202
960812
1.221
1.201
1.198
1.207
960816
1.218
1.214
1.220
1.217
, 百拇医药
3 讨 论
3.1 本处方君药牡丹皮与臣药白芍均含水溶性成分芍药甙。据文献报道，前者含量为 0.479%～1.091% ，后者含量为 0.264%～3.24%[1]，故我们摸索了芍药甙的高效液相色谱分离条件与方法。将芍药甙作为水溶性成分定量指标考察本制剂水提取工艺具有指导意义。同时，为有效鉴别本复方制剂中的牡丹皮和白芍的存在，在正式质量标准中制定了相应的薄层层析定性鉴别方法。
3.2 本试验曾就甲醇—水(34∶66)、乙腈—水(20∶80)和甲醇—36%醋酸—异丙醇—水(25∶2∶2∶71)3种流动相进行比较，结果以前者为好。本法快速准确，重现性好，稳定可靠，可作为该制剂质量控制方法之一。
参考文献
1 王宝木王 王.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994.608，614
(收稿日期：1999-11-21), 百拇医药