ELISA 试剂盒定量检测中药材和中成药的黄曲霉毒素B1
作者：李延生 陈建民
单位：中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所 北京 100094
关键词：中药材；中成药；黄曲霉毒素B1；ELISA 试剂盒
中草药000814摘 要 为评价中药材和中成药的黄曲霉毒素 B1(AFB1) 污染程度，采用了 ELISA 试剂盒定量检测 AFB1，对一批中药材和中成药进行检测，发现 AFB1 检出率和含量很高。
Determination of Aflatoxin B1 in Traditional Chinese Medicine by ELISA
Li Yansheng
, 百拇医药
(Institute of Medical Plant, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Beijing 100094)
Chen Jianmin
(Institute of Medical Plant, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Beijing 100094)
Abstract It was said that the presence of aflatoxin B1 (AFB1) in traditional Chinese medicinal materials and preparations was of common occurrence. In order to clarify the truth of such saying, the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the occurrence of AFB1 in a number of Chinese medicinal samples was carried out. Result of the determination showed that the positive rate and contents of AFB1 were indeed rather high, necessary to alert our deep concern
, 百拇医药
Key words traditional Chinese medicinal materials Chinese medicinal preparation aflatoxin B1 ELISA
中药材采集后不及时干燥或贮存不当或在制备和加工过程中处理不善，可能污染各种霉菌并产生真菌毒素，其中黄曲霉毒素 B1(AFB1) 毒性最大，致癌力最强，文献报道用间接竞争酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测中药材和中成药的 AFB1，检出率极高，而且含量也很高[1，2]。为了更客观地评价中药材的 AFB1 污染程度，保证人民用药安全，我们采用了 ELISA 试剂盒定量检测 AFB1，对一批中药材和中成药进行检测。
1 仪器、试剂、药材
, 百拇医药 酶联免疫测定仪 (Bio Rad-550),AFB1 (ELISA) 检测试剂盒(北京市营养源研究所百林生物技术公司)，其组成：①AFB1 抗原包被 16 孔×6 条形带框酶标板，②单克隆抗体，③酶标二抗，④空白对照液，⑤底物 (1mg×4)，⑥底物液 A，⑦底物液 B，⑧终止液，⑨ PBS-T 洗液。
中药材样品来源于海淀医药经营公司，中成药为市售品。
2 原理
样品中的 AFB1 经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
3 样品测定
3.1 提取：样品粉碎过 20 目筛，取 20.0 g 加入 250 mL 具塞锥形瓶中，准确加入 50.0 mL 甲醇-水(80∶20)溶液和 15.0 mL 石油醚，盖塞后滴水封严。超声 30 min ，用快速定性滤纸过滤于 125 mL 分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇-水溶液于 50 mL 烧杯中，从中取出 10.0 mL (相当于 4.0 g 样品) 于 75 mL 蒸发皿中，65 ℃ 水浴通风挥干，用 2.0 mL 20% 甲醇-PBS 分 3 次 溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测，此液每 1 mL 相当于 2.0 g样品。
, 百拇医药
3.2 ELISA 测定
①将下列试剂稀释后备用：PBS-T洗液：390 mL 蒸馏水稀释 (1∶40)；底物液 A：9 mL 蒸馏水稀释 (1∶9)；抗体： 7 mL 蒸馏水稀释 (1∶140)；酶标二抗：10 mL 蒸馏水稀释 (1∶200)；阴性对照液： 200 μL 抗体+200 μL 空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。
②抗体抗原反应：抗体与等量样品提取液混匀后静置 15 min 。洗涤酶标板 2 次(每次 3 min)，晾干。分别加入此抗体抗原反应液及空白对照液、阴性对照液，130 微升/孔，37 ℃ 湿盒中孵育，2 h 后倒掉反应液并晾干，洗 3×3 min，晾干。
③酶标记反应：加入酶标二抗，100 微升/孔，37 ℃ 孵育 1 h，洗 5×3 min ，晾干。
④显色反应：1 mg 底物+2.5 mL 底物液 A+42 μL 底物液 B，待底物充分溶解后加入酶标板，100 微升/孔，37 ℃ 15 min 后加入终止液，40 微升/孔。
, http://www.100md.com
⑤测定：酶标仪 490 nm 测定吸收值。
3.3 计算
①求出各孔的吸收校正值：吸收校正值=吸收实测值-空白对照孔吸收值(均值)。
②求出待测样的吸收值：吸收(%)=[吸收校正值÷阴性对照孔吸收校正值(均值)]×100%。
③求出待测样 AFB1 含量(ng/g)：将待测样的吸收(%)值带入标准竞争抑制曲线，算出 AFB1 含量。结果见表1。
表1 中药材和中成药的 AFB1 含量 药材名称
AFB1含量
(ng/g)
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药材名称
AFB1含量
(ng/g)
神曲
49.3
山楂
28
青皮
25.7
白术
15
白芍
2.3
, 百拇医药
黄芩
16.9
泻叶
100
麦冬
0
黄芪
200
胖大海
19
陈皮
106
枳实
23.5
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柴胡
10
续断
44.7
丹皮
2.5
姜黄
17
地丁
14.6
茯苓
0
金钱草
12
, 百拇医药
银翘解毒丸
29.5
板蓝根
100
清眩治瘫丸
23.7
4 讨论
ELISA 法检测限达 0.01 ng，操作比较简单，样品不用经过纯化是其优越性。本文所用试剂盒为单克隆抗体，与文献所用多克隆抗体方法的检测结果相比，所测中药材和中成药的 AFB1 含量低得多，但据了解该试剂盒的单克隆抗体未检验过中药成分，尚需证实含香豆素或黄酮类化合物的中药对检测 AFB1 有无干扰。
李延生 女，1996年毕业于山东医科大学，1992年考入北京协和医科大学，师 从中国医学科学院药用植物研究所陈建民研究员，1999年毕业获理学硕士学位。主要从事 中草药成分分析及中药质量标准的研究。
参考文献
1，杜平华，杨晓峰.药物分析杂志，1995，15：(2)：34
2，任凤兰，马宏伟.药物分析杂志，1997，17：(4)：280
(1999-07-08收稿), http://www.100md.com
单位：中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所 北京 100094
关键词：中药材；中成药；黄曲霉毒素B1；ELISA 试剂盒
中草药000814摘 要 为评价中药材和中成药的黄曲霉毒素 B1(AFB1) 污染程度，采用了 ELISA 试剂盒定量检测 AFB1，对一批中药材和中成药进行检测，发现 AFB1 检出率和含量很高。
Determination of Aflatoxin B1 in Traditional Chinese Medicine by ELISA
Li Yansheng
, 百拇医药
(Institute of Medical Plant, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Beijing 100094)
Chen Jianmin
(Institute of Medical Plant, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Beijing 100094)
Abstract It was said that the presence of aflatoxin B1 (AFB1) in traditional Chinese medicinal materials and preparations was of common occurrence. In order to clarify the truth of such saying, the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the occurrence of AFB1 in a number of Chinese medicinal samples was carried out. Result of the determination showed that the positive rate and contents of AFB1 were indeed rather high, necessary to alert our deep concern
, 百拇医药
Key words traditional Chinese medicinal materials Chinese medicinal preparation aflatoxin B1 ELISA
中药材采集后不及时干燥或贮存不当或在制备和加工过程中处理不善，可能污染各种霉菌并产生真菌毒素，其中黄曲霉毒素 B1(AFB1) 毒性最大，致癌力最强，文献报道用间接竞争酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测中药材和中成药的 AFB1，检出率极高，而且含量也很高[1，2]。为了更客观地评价中药材的 AFB1 污染程度，保证人民用药安全，我们采用了 ELISA 试剂盒定量检测 AFB1，对一批中药材和中成药进行检测。
1 仪器、试剂、药材
, 百拇医药 酶联免疫测定仪 (Bio Rad-550),AFB1 (ELISA) 检测试剂盒(北京市营养源研究所百林生物技术公司)，其组成：①AFB1 抗原包被 16 孔×6 条形带框酶标板，②单克隆抗体，③酶标二抗，④空白对照液，⑤底物 (1mg×4)，⑥底物液 A，⑦底物液 B，⑧终止液，⑨ PBS-T 洗液。
中药材样品来源于海淀医药经营公司，中成药为市售品。
2 原理
样品中的 AFB1 经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
3 样品测定
3.1 提取：样品粉碎过 20 目筛，取 20.0 g 加入 250 mL 具塞锥形瓶中，准确加入 50.0 mL 甲醇-水(80∶20)溶液和 15.0 mL 石油醚，盖塞后滴水封严。超声 30 min ，用快速定性滤纸过滤于 125 mL 分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇-水溶液于 50 mL 烧杯中，从中取出 10.0 mL (相当于 4.0 g 样品) 于 75 mL 蒸发皿中，65 ℃ 水浴通风挥干，用 2.0 mL 20% 甲醇-PBS 分 3 次 溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测，此液每 1 mL 相当于 2.0 g样品。
, 百拇医药
3.2 ELISA 测定
①将下列试剂稀释后备用：PBS-T洗液：390 mL 蒸馏水稀释 (1∶40)；底物液 A：9 mL 蒸馏水稀释 (1∶9)；抗体： 7 mL 蒸馏水稀释 (1∶140)；酶标二抗：10 mL 蒸馏水稀释 (1∶200)；阴性对照液： 200 μL 抗体+200 μL 空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。
②抗体抗原反应：抗体与等量样品提取液混匀后静置 15 min 。洗涤酶标板 2 次(每次 3 min)，晾干。分别加入此抗体抗原反应液及空白对照液、阴性对照液，130 微升/孔，37 ℃ 湿盒中孵育，2 h 后倒掉反应液并晾干，洗 3×3 min，晾干。
③酶标记反应：加入酶标二抗，100 微升/孔，37 ℃ 孵育 1 h，洗 5×3 min ，晾干。
④显色反应：1 mg 底物+2.5 mL 底物液 A+42 μL 底物液 B，待底物充分溶解后加入酶标板，100 微升/孔，37 ℃ 15 min 后加入终止液，40 微升/孔。
, http://www.100md.com
⑤测定：酶标仪 490 nm 测定吸收值。
3.3 计算
①求出各孔的吸收校正值：吸收校正值=吸收实测值-空白对照孔吸收值(均值)。
②求出待测样的吸收值：吸收(%)=[吸收校正值÷阴性对照孔吸收校正值(均值)]×100%。
③求出待测样 AFB1 含量(ng/g)：将待测样的吸收(%)值带入标准竞争抑制曲线，算出 AFB1 含量。结果见表1。
表1 中药材和中成药的 AFB1 含量 药材名称
AFB1含量
(ng/g)
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药材名称
AFB1含量
(ng/g)
神曲
49.3
山楂
28
青皮
25.7
白术
15
白芍
2.3
, 百拇医药
黄芩
16.9
泻叶
100
麦冬
0
黄芪
200
胖大海
19
陈皮
106
枳实
23.5
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柴胡
10
续断
44.7
丹皮
2.5
姜黄
17
地丁
14.6
茯苓
0
金钱草
12
, 百拇医药
银翘解毒丸
29.5
板蓝根
100
清眩治瘫丸
23.7
4 讨论
ELISA 法检测限达 0.01 ng，操作比较简单，样品不用经过纯化是其优越性。本文所用试剂盒为单克隆抗体，与文献所用多克隆抗体方法的检测结果相比，所测中药材和中成药的 AFB1 含量低得多，但据了解该试剂盒的单克隆抗体未检验过中药成分，尚需证实含香豆素或黄酮类化合物的中药对检测 AFB1 有无干扰。
李延生 女，1996年毕业于山东医科大学，1992年考入北京协和医科大学，师 从中国医学科学院药用植物研究所陈建民研究员，1999年毕业获理学硕士学位。主要从事 中草药成分分析及中药质量标准的研究。
参考文献
1，杜平华，杨晓峰.药物分析杂志，1995，15：(2)：34
2，任凤兰，马宏伟.药物分析杂志，1997，17：(4)：280
(1999-07-08收稿), http://www.100md.com