超氧化物歧化酶对变链菌生长和粘附影响的实验研究
作者：王成龙1 李振钢1 莫 简2 赵 皿1
单位：第四军医大学：1.口腔医学院，2.基础部化学教研室，陕西 西安 710032
关键词：超氧化物歧化酶；变形链球菌；生长；粘附
牙体牙髓牙周病学杂志990211 摘要 目的：了解超氧化物歧化酶(SOD)对变链菌Ingbritt、6715 生长和粘附的影响情况。方法：用麦氏比浊法分别比较不同浓度SOD对两种变链菌蔗糖琼脂培养基纯培养的细菌生长量；用液闪计数值比较SOD对两种变链菌体外在羟基磷灰石(HA)上的粘附量。结果：在SOD存在时，两种致龋菌的生长量大于没有SOD时的生长量；SOD作用于获得性膜和致龋菌的体外粘附过程时，两种致龋菌的粘附量显著降低，SOD作用于致龋菌生长过程，变链菌Ingbritt 的粘附量升高，变链菌6715的粘附量显著降低。结论：外源性SOD促进致龋菌的生长， 使致龋菌的粘附量发生改变。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0120-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2)：120]
Effect of superoxide dismutase on the growth and
adhesion of streptococcus mutans
Wang Chenglong, Li Zhengang, Mo Jian et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To investigate the effect of SOD on the growth and adhesion of S mutans Ingbritt and 6715. Methods: The concentrations and the numbers adhered to HA of 2 strains of oral bacteria incubated with different level SOD were determined by Mc Farland colorimeter method and cpm values respectively. Results: The concentrations of 2 strains incubated with SOD were significant higher than those of strains incubated without SOD. The numbers were significant low when SOD existed in acquired pellicle and during adhesive process. When 2 strains were incubated with SOD, the nubers of S mutans Ingbritt were high and 6715 were significant low. Conclusion: Exogenous SOD promotes the growth of S mutans and influenced the numbers adhered to HA.
, 百拇医药
Key Words Superoxide Dismutase； S mutans； growth；adhesion
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):120]
变形链球菌(streptococcus mutans,简称变链菌)是口腔中主要致龋菌，是兼性厌氧菌，它的能量代谢依赖于糖酵解[1]，由于缺乏细胞色素和过氧化氢酶系统，变链菌不能进行有氧氧化作用， 但是由于超氧化物歧化酶(SOD)的存在[2]，变链菌能够在有氧条件下生长，并进行氧的代谢活动，Nakayama(1992)[3]报道：缺乏SOD的变链菌能够在有氧条件下生长，但生长速度比有SOD的变链菌慢。本研究通过外源性SOD的加入，观察变链菌的生长及在体外与羟基磷灰石(HA)的粘附情况。
, 百拇医药 1 材料和方法
变形链球菌Ingbritt、6715标准株(第四军医大学口腔医学院检验科保存)复苏、生化鉴定后，加入蔗糖琼脂培养基(第四军医大学西京医院检验科制备)，厌氧(37℃，800ml/L N2，100ml/L H2，100ml/L CO2)培养18h，PBS(pH=7.0)缓冲液离心洗涤3 次(4℃，10?000r/min，15min)后，采用麦氏比浊法，分别用PBS缓冲液稀释至1×1012CFU/L，每种细菌分装于7支灭菌的小试管内，每管 1ml，离心，弃去上清，分别按浓度梯度(单位g/L)0.1、0.05、0.025、0.0125、0加入PBS配制的SOD(活性单位：3×106U/g液，再在每管中加蔗糖琼脂培养基，使每支小试管中的液体总量达4ml，另两支试管分别加入 0.1g/L SOD液和等体积PBS 液， 再加入蔗糖琼脂培养基， 使其体积为4ml，按3.7×107Bg/L加入3H-TdR(中国科学院北京原子能研究所)，振荡混匀后， 置厌氧孵箱(37℃，800ml/L N2，100ml/L H2，100ml/L CO2)18h，离心，采用麦氏比浊法测每管细菌量。加3H-TdR的4支试管，采用麦氏比浊法，分别用PBS缓冲液稀释至1×1012CFU/L，按以下过程进行粘附实验，5mg HA(sino-American Biotechnotgy公司产品，华美生物工程公司分装)+100μl全唾液(37℃，6r/mim 2h) → PBS 缓冲液洗两次→ 100μl,5g/L人血白蛋白PBS缓冲液(37℃，6r/min 30min)→PBS缓冲液洗两次， 阳性对照组加入未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl，阴性对照组加入0.1g/L 灭活的SOD液100μl和未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl，实验组又分成三组，第一组先加入0.1g/L SOD液100μl(37℃，6r/mim，2h)→PBS洗两次→100μl未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌，第二组加入0.1g/L SOD液100μl和未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl；第三组加入培养时加SOD液的3H-TdR标记的细菌100μl， 以上五组在37℃，6r/min旋转1h，PBS洗三次，烤干，加入1ml闪烁液，液体闪烁计数得每分钟计数值。
, http://www.100md.com
2 结果 (表1、2)
表1 不同浓度(g/L)SOD对致龋菌生长的影响(CFU/ml) 菌名
0.1
0.05
0.025
0.0125
0
Ingbritt
2.0×1010
2.0×1010
2.5×1010
, 百拇医药
2.0×109
5.0×109
6715
2.5×1010
2.0×1010
1.5×1010
1.0×1010
2.0×109
变链菌6715生长量在SOD存在时大于没有SOD时。变链菌Ingbritt的生长量在SOD浓度为0.0125g/L时低于没有SOD时的量，但Ingbritt在SOD 存在时生长量在总体趋势上是大于没有SOD时的，也就是说SOD对两种致龋菌的生长有不同程度的促进作用。表2 SOD对致龋菌粘附的影响 (min-1) 菌名
, 百拇医药
阴性对照
阳性对照
第一组
第二组
第三组
Ingbritt
910
1087
508
321
1543
985
1347
, 百拇医药
665
465
1552
6715
1114
1427
399
908
634
1467
1877
550
1036
, 百拇医药
710
变链菌6715在培养过程中加入SOD的细菌对HA 的粘附量明显小于培养过程中未加SOD的细菌，即第三组明显低于阳性对照组(P<0.05)，说明培养过程中加入SOD，6715的粘附受到抵制，而Ingbritt的情况与6715相反，加入SOD，Ingbritt 的粘附虽然在统计学上相差没有显著性(P>0.05)，但从每分钟计数值上看是被促进了， 这个结果说明SOD对变链菌Ingbritt、6715的粘附能力有影响，Ingbritt第一组、 第二组与阴性对照组比较每分钟计数值明显降低(P<0.05)，6715 第一组与阴性对照组比较相差显著(P<0.05)，第二组与阴性对照组比较其相差虽然在统计学上无显著性(P>0.05)，但从每分钟计数值上看是降低的。第一组是SOD作用于获得性膜的细菌粘附结果，第二组是SOD在细菌体外粘附过程中对粘附影响的结果，说明SOD对获得性膜和致龋菌的粘附过程均有抑制作用。3 讨论
需氧菌在有氧条件下氧化营养物时可产生大量超氧化物阴离子自由基(O-2) ，为强氧化剂杀伤细菌的能力非常强，但需氧菌具有超氧化物歧化酶(SOD)， 可迅速将其催化成为H2O2，同时过氧化氢酶可将H2O2分解成为无害的产物。而厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，无法消除在氧化代谢过程中产生的O-2和H2O2等有害产物，所以不能在有氧环境中生长[4]。变链菌是兼性厌氧菌，具有SOD，但没有过氧化氢酶[3]，SOD能消除O-2，使变链菌免受O-2的毒害；没有过氧化氢酶，不能消除H2O2，过多的H2O2是对变链菌正常生长的威胁，然而口腔及变链菌具有乳过氧化物酶系统，可以消除H2O2对细菌和上皮细胞的毒害[5]。 所以变链菌在有氧和无氧条件下都能良好生长。口腔是一个开放的系统，存在于龋病致病微环境──菌斑中的变链菌的代谢活动也不可能是完全厌氧的，是一种微需氧代谢，即使在厌氧培养条件下，变链菌也能产生并利用氧，Saito K[6]报道：在厌氧培养条件下变链菌可以有10.8%的氧产生。因此有氧代谢活动，是变链菌普遍存在的代谢活动，并且在变链菌的生长过程中有超氧化物阴离子自由基和H2O2的产生，这一点已经被国内外学者的实验所证实[2,7～9]，由于变链菌SOD的存在，清除了部分的O-2，使得O-2保持在相对低的水平，变链菌能够比较顺利地生长， 但是没有被清除的部分O-2对于变链菌的生长具有抑制作用，加入外源性SOD完全清除了O-2，使得O-2的抑制作用完全解除了，变链菌的生长更顺利。因此，我们在实验中加入外源性SOD，结果显示SOD对两种变链菌的生长有不同程度的促进作用。
, http://www.100md.com
关于变链菌SOD的研究，目前已经深入到基因水平[3]，研究表明，变链菌 SOD可以有三种类型，CuZnSOD,FeSOD,MnSOD,但以MnSOD为主[10，11]，也有研究者从改变变链菌生长环境中微量元素，特别是与SOD 形成关系密切的锰等微量元素的量，从而干扰SOD形成，并进一步影响变链菌氧代谢的角度提出了预防龋病的新设想[12]，但是，目前我们还没有发现SOD对变链菌致龋作用影响的报道。本组结果表明 SOD 在获得性膜粘附过程和致龋菌粘附能力三个层次上，对变链菌Ingbritt、6715的粘附均有影响，但是SOD这种影响作用的机理和与致龋的关系目前还不清楚，需进一步深入研究。
参考文献
1 Cole JA.A biochemical approach to the control of dental Caries. Biochem Soc Trans, 1977，5(7):1232
, http://www.100md.com
2 Thomas EL,Pera KA.Oxygen Metabolism of streptococcus mutans: Uptake of oxygen and release of superoxide and hydrogen peroxide. J of Bacteriology, 1983，154(6):1236
3 Nakayama K. Nucleotide Sequence of streptococcus mutans superoxide dismutase Gene and isolation of insertion mutants. J of Bacteriology, 1992，174(5):4928
4 汪美先主编. 医学微生物学. 西安: 第四军医大学训练部, 1983.122
5 Tenovuo JD,Larjava H. The protective effect of peroxidase and thiocyanate against hydrogen peroxide toxicity assessed by the uptake of 3H-thymidine by human gingival fibroblasts culture in vitro. Arch Oral Biol,1984,29(6):445
, 百拇医药
6 Saito K. Ecosystem of microbial flora in periodontal pockets, in vitro. Ohu Daigakushi,1990,17(2):183
7 王成龙, 阎鹏, 黄力子等. 龋变牙面负电位形成机理的研究. 实用口腔医学杂志, 1998,14(3):195
8 侯本祥, 章锦才, 张蕴惠等. 外源性糖对口腔细菌产生过氧化氢能力的影响. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1998,8(1):32
9 Carlsson J, Kujala U. Pyruvate oxidase activity dependent on thiamine pyrophosphate, flavin adenine dinucleotid and orthophosphate in streptococcus sanguis. FEMS Lett, 1985,25(1):53
, http://www.100md.com
10 Martin ME, Byers BR, Olson MOJ et al. A streptococcus mutans superoxide dismutase that is active with either manganese or Iron as a cofactor. J of Biological chemistry, 1986,261(20):9361
11 Vance PG, Keele BB. Superoxide dismutase from streptococcus mutans. J of Biological Chemistry, 1972,247(15):4782
12 Martin ME, Strachan RC, Aranha H et al. Oxygen toxicity in streptococcus mutans: Manganese, Iron, and superoxide dismutase. J Bacteriol, 1984,159(2):745
收稿日期：1998-09-17, http://www.100md.com(王成龙1 李振钢1 莫 简2 赵 皿1)
单位：第四军医大学：1.口腔医学院，2.基础部化学教研室，陕西 西安 710032
关键词：超氧化物歧化酶；变形链球菌；生长；粘附
牙体牙髓牙周病学杂志990211 摘要 目的：了解超氧化物歧化酶(SOD)对变链菌Ingbritt、6715 生长和粘附的影响情况。方法：用麦氏比浊法分别比较不同浓度SOD对两种变链菌蔗糖琼脂培养基纯培养的细菌生长量；用液闪计数值比较SOD对两种变链菌体外在羟基磷灰石(HA)上的粘附量。结果：在SOD存在时，两种致龋菌的生长量大于没有SOD时的生长量；SOD作用于获得性膜和致龋菌的体外粘附过程时，两种致龋菌的粘附量显著降低，SOD作用于致龋菌生长过程，变链菌Ingbritt 的粘附量升高，变链菌6715的粘附量显著降低。结论：外源性SOD促进致龋菌的生长， 使致龋菌的粘附量发生改变。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0120-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2)：120]
Effect of superoxide dismutase on the growth and
adhesion of streptococcus mutans
Wang Chenglong, Li Zhengang, Mo Jian et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To investigate the effect of SOD on the growth and adhesion of S mutans Ingbritt and 6715. Methods: The concentrations and the numbers adhered to HA of 2 strains of oral bacteria incubated with different level SOD were determined by Mc Farland colorimeter method and cpm values respectively. Results: The concentrations of 2 strains incubated with SOD were significant higher than those of strains incubated without SOD. The numbers were significant low when SOD existed in acquired pellicle and during adhesive process. When 2 strains were incubated with SOD, the nubers of S mutans Ingbritt were high and 6715 were significant low. Conclusion: Exogenous SOD promotes the growth of S mutans and influenced the numbers adhered to HA.
, 百拇医药
Key Words Superoxide Dismutase； S mutans； growth；adhesion
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):120]
变形链球菌(streptococcus mutans,简称变链菌)是口腔中主要致龋菌，是兼性厌氧菌，它的能量代谢依赖于糖酵解[1]，由于缺乏细胞色素和过氧化氢酶系统，变链菌不能进行有氧氧化作用， 但是由于超氧化物歧化酶(SOD)的存在[2]，变链菌能够在有氧条件下生长，并进行氧的代谢活动，Nakayama(1992)[3]报道：缺乏SOD的变链菌能够在有氧条件下生长，但生长速度比有SOD的变链菌慢。本研究通过外源性SOD的加入，观察变链菌的生长及在体外与羟基磷灰石(HA)的粘附情况。
, 百拇医药 1 材料和方法
变形链球菌Ingbritt、6715标准株(第四军医大学口腔医学院检验科保存)复苏、生化鉴定后，加入蔗糖琼脂培养基(第四军医大学西京医院检验科制备)，厌氧(37℃，800ml/L N2，100ml/L H2，100ml/L CO2)培养18h，PBS(pH=7.0)缓冲液离心洗涤3 次(4℃，10?000r/min，15min)后，采用麦氏比浊法，分别用PBS缓冲液稀释至1×1012CFU/L，每种细菌分装于7支灭菌的小试管内，每管 1ml，离心，弃去上清，分别按浓度梯度(单位g/L)0.1、0.05、0.025、0.0125、0加入PBS配制的SOD(活性单位：3×106U/g液，再在每管中加蔗糖琼脂培养基，使每支小试管中的液体总量达4ml，另两支试管分别加入 0.1g/L SOD液和等体积PBS 液， 再加入蔗糖琼脂培养基， 使其体积为4ml，按3.7×107Bg/L加入3H-TdR(中国科学院北京原子能研究所)，振荡混匀后， 置厌氧孵箱(37℃，800ml/L N2，100ml/L H2，100ml/L CO2)18h，离心，采用麦氏比浊法测每管细菌量。加3H-TdR的4支试管，采用麦氏比浊法，分别用PBS缓冲液稀释至1×1012CFU/L，按以下过程进行粘附实验，5mg HA(sino-American Biotechnotgy公司产品，华美生物工程公司分装)+100μl全唾液(37℃，6r/mim 2h) → PBS 缓冲液洗两次→ 100μl,5g/L人血白蛋白PBS缓冲液(37℃，6r/min 30min)→PBS缓冲液洗两次， 阳性对照组加入未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl，阴性对照组加入0.1g/L 灭活的SOD液100μl和未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl，实验组又分成三组，第一组先加入0.1g/L SOD液100μl(37℃，6r/mim，2h)→PBS洗两次→100μl未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌，第二组加入0.1g/L SOD液100μl和未加SOD培养的3H-TdR标记的细菌100μl；第三组加入培养时加SOD液的3H-TdR标记的细菌100μl， 以上五组在37℃，6r/min旋转1h，PBS洗三次，烤干，加入1ml闪烁液，液体闪烁计数得每分钟计数值。
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2 结果 (表1、2)
表1 不同浓度(g/L)SOD对致龋菌生长的影响(CFU/ml) 菌名
0.1
0.05
0.025
0.0125
0
Ingbritt
2.0×1010
2.0×1010
2.5×1010
, 百拇医药
2.0×109
5.0×109
6715
2.5×1010
2.0×1010
1.5×1010
1.0×1010
2.0×109
变链菌6715生长量在SOD存在时大于没有SOD时。变链菌Ingbritt的生长量在SOD浓度为0.0125g/L时低于没有SOD时的量，但Ingbritt在SOD 存在时生长量在总体趋势上是大于没有SOD时的，也就是说SOD对两种致龋菌的生长有不同程度的促进作用。表2 SOD对致龋菌粘附的影响 (min-1) 菌名
, 百拇医药
阴性对照
阳性对照
第一组
第二组
第三组
Ingbritt
910
1087
508
321
1543
985
1347
, 百拇医药
665
465
1552
6715
1114
1427
399
908
634
1467
1877
550
1036
, 百拇医药
710
变链菌6715在培养过程中加入SOD的细菌对HA 的粘附量明显小于培养过程中未加SOD的细菌，即第三组明显低于阳性对照组(P<0.05)，说明培养过程中加入SOD，6715的粘附受到抵制，而Ingbritt的情况与6715相反，加入SOD，Ingbritt 的粘附虽然在统计学上相差没有显著性(P>0.05)，但从每分钟计数值上看是被促进了， 这个结果说明SOD对变链菌Ingbritt、6715的粘附能力有影响，Ingbritt第一组、 第二组与阴性对照组比较每分钟计数值明显降低(P<0.05)，6715 第一组与阴性对照组比较相差显著(P<0.05)，第二组与阴性对照组比较其相差虽然在统计学上无显著性(P>0.05)，但从每分钟计数值上看是降低的。第一组是SOD作用于获得性膜的细菌粘附结果，第二组是SOD在细菌体外粘附过程中对粘附影响的结果，说明SOD对获得性膜和致龋菌的粘附过程均有抑制作用。3 讨论
需氧菌在有氧条件下氧化营养物时可产生大量超氧化物阴离子自由基(O-2) ，为强氧化剂杀伤细菌的能力非常强，但需氧菌具有超氧化物歧化酶(SOD)， 可迅速将其催化成为H2O2，同时过氧化氢酶可将H2O2分解成为无害的产物。而厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，无法消除在氧化代谢过程中产生的O-2和H2O2等有害产物，所以不能在有氧环境中生长[4]。变链菌是兼性厌氧菌，具有SOD，但没有过氧化氢酶[3]，SOD能消除O-2，使变链菌免受O-2的毒害；没有过氧化氢酶，不能消除H2O2，过多的H2O2是对变链菌正常生长的威胁，然而口腔及变链菌具有乳过氧化物酶系统，可以消除H2O2对细菌和上皮细胞的毒害[5]。 所以变链菌在有氧和无氧条件下都能良好生长。口腔是一个开放的系统，存在于龋病致病微环境──菌斑中的变链菌的代谢活动也不可能是完全厌氧的，是一种微需氧代谢，即使在厌氧培养条件下，变链菌也能产生并利用氧，Saito K[6]报道：在厌氧培养条件下变链菌可以有10.8%的氧产生。因此有氧代谢活动，是变链菌普遍存在的代谢活动，并且在变链菌的生长过程中有超氧化物阴离子自由基和H2O2的产生，这一点已经被国内外学者的实验所证实[2,7～9]，由于变链菌SOD的存在，清除了部分的O-2，使得O-2保持在相对低的水平，变链菌能够比较顺利地生长， 但是没有被清除的部分O-2对于变链菌的生长具有抑制作用，加入外源性SOD完全清除了O-2，使得O-2的抑制作用完全解除了，变链菌的生长更顺利。因此，我们在实验中加入外源性SOD，结果显示SOD对两种变链菌的生长有不同程度的促进作用。
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关于变链菌SOD的研究，目前已经深入到基因水平[3]，研究表明，变链菌 SOD可以有三种类型，CuZnSOD,FeSOD,MnSOD,但以MnSOD为主[10，11]，也有研究者从改变变链菌生长环境中微量元素，特别是与SOD 形成关系密切的锰等微量元素的量，从而干扰SOD形成，并进一步影响变链菌氧代谢的角度提出了预防龋病的新设想[12]，但是，目前我们还没有发现SOD对变链菌致龋作用影响的报道。本组结果表明 SOD 在获得性膜粘附过程和致龋菌粘附能力三个层次上，对变链菌Ingbritt、6715的粘附均有影响，但是SOD这种影响作用的机理和与致龋的关系目前还不清楚，需进一步深入研究。
参考文献
1 Cole JA.A biochemical approach to the control of dental Caries. Biochem Soc Trans, 1977，5(7):1232
, http://www.100md.com
2 Thomas EL,Pera KA.Oxygen Metabolism of streptococcus mutans: Uptake of oxygen and release of superoxide and hydrogen peroxide. J of Bacteriology, 1983，154(6):1236
3 Nakayama K. Nucleotide Sequence of streptococcus mutans superoxide dismutase Gene and isolation of insertion mutants. J of Bacteriology, 1992，174(5):4928
4 汪美先主编. 医学微生物学. 西安: 第四军医大学训练部, 1983.122
5 Tenovuo JD,Larjava H. The protective effect of peroxidase and thiocyanate against hydrogen peroxide toxicity assessed by the uptake of 3H-thymidine by human gingival fibroblasts culture in vitro. Arch Oral Biol,1984,29(6):445
, 百拇医药
6 Saito K. Ecosystem of microbial flora in periodontal pockets, in vitro. Ohu Daigakushi,1990,17(2):183
7 王成龙, 阎鹏, 黄力子等. 龋变牙面负电位形成机理的研究. 实用口腔医学杂志, 1998,14(3):195
8 侯本祥, 章锦才, 张蕴惠等. 外源性糖对口腔细菌产生过氧化氢能力的影响. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1998,8(1):32
9 Carlsson J, Kujala U. Pyruvate oxidase activity dependent on thiamine pyrophosphate, flavin adenine dinucleotid and orthophosphate in streptococcus sanguis. FEMS Lett, 1985,25(1):53
, http://www.100md.com
10 Martin ME, Byers BR, Olson MOJ et al. A streptococcus mutans superoxide dismutase that is active with either manganese or Iron as a cofactor. J of Biological chemistry, 1986,261(20):9361
11 Vance PG, Keele BB. Superoxide dismutase from streptococcus mutans. J of Biological Chemistry, 1972,247(15):4782
12 Martin ME, Strachan RC, Aranha H et al. Oxygen toxicity in streptococcus mutans: Manganese, Iron, and superoxide dismutase. J Bacteriol, 1984,159(2):745
收稿日期：1998-09-17, http://www.100md.com(王成龙1 李振钢1 莫 简2 赵 皿1)