被促衰老P8型小鼠肝细胞色素P450 3A对学习与记忆的影响
作者：刘卉 陈俊抛 平井圭一
单位：刘卉 陈俊抛 (第一军医大学珠江医院神经内科，广州，510282)；平井圭一 (金泽医科大学解剖学第一讲座，金泽，日本)
关键词：细胞色素P450；3A(CYP3A)；被促衰老鼠；学习与记忆
第一军医大学学报990412 摘要：目的 探讨学习与记忆是否与细胞色素P450 3A(CYP3A)的活性变化有关。方法 本文用红霉素N-脱甲基酶活性测定法分别检测了SAM-R1和SAM-P8组被促衰老小鼠(SAM)在7、13、36及84周龄时其肝微粒体细胞色素P450 3A的活性变化。结果 以SAM-R1组为对照，随着年龄增长，SAM-P8组中的CYP3A活性明显降低。结论 CPY3A的活性随着年龄增长对学习与记忆有一定的影响。SAM-P8对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。
, 百拇医药
中图分类号：R741.02
Effect of the activity of hepatic cytochrome P450 3A on the learning and memory in the senescence-accelerated mouse-P8(SAM-P8)
Liu Hui，Chen Jun Pao
(Department of Neurology，Zhujiang Hospital，Guangzhou，510515)
Kei Ichi Hirai
(Department of Anatomy，Kanazawa Medical University，Kanazawa，Japan) Abstract：Objective To explore whether learning and memory are concerned with activity of hepatic cytochrome P450 3A(CYP3A).Methods The activitiy of the SAM hepatic cytochrome P450 3A (CYP3A) was assessed in vitro as erythromycin N-demethylation in microsomes from senescence-accelarated mouse (SAM)-R1 and SAM-P8，at 7,13,36 and 84 weeks of age in every animal group.Results CYP3A activity decreased significantly with advancing age in SAM-P8.Conclusion CYP3A plays a very important role in senescence，and also affect learning and memory.It is suggested that SAM-P8 may be useful as an experimental animal model for senile memory impairment in humans.
, 百拇医药
Key words：P450 3A (CYP3A); senescence-accelerated mouse (SAM);learning and memory
被促衰老小鼠 (Senescence-accelerated mouse，SAM)是一种被加速衰老的小鼠模型，是由日本Takeda等[1]制作。它包括促衰老倾向型(Senescence-accelerated prone mouse，SAM-P)和抗促衰老型(senescence-accelerated resistant mouse，SAM-R)，后者显示正常年龄组特点。SAM-P由SAM-P1、SAM-P2、SAM-P3、SAM-P6、SAM-P7、SAM-P8、SAM-P9、SAM-P10及SAM-P11组成；SAM-R则由SAM-R1、SAM-R4及SAM-R5组成。从幸存者、生长率及Gompertzian作用的结果来看，SAM-P被认为是加速衰老的年龄模型。有资料表明SAM-P的早老表现：活性降低、毛发变粗及脱落提前、眼周损害、脊柱前或后突、淀粉样变性和骨质疏松症的发病率提高以及免疫作用的降低等[1]。但这些病理表现在前9种SAM-P基质中各有不同。已证实SAM-P8具有与年龄相关的学习与记忆能力衰退的特征[2] 。CPY3A是肝脏混合功能氧化酶系(MFO)的主要成份，在内源性和外源性化合物的生物转化中起重要作用。作者主要目的是通过分别测定CPY3A在SAM-R1及SAM-P8肝微粒体中的活性变化，证实SAM肝CPY3A的活性是否随年龄的增长而降低，探讨其对学习与记忆的作用。
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1 材料和方法
1 材料 实验动物为被促衰老小鼠(SAM)，雄性，体质量100～150 g，实验分SAM-R1和SAM-P8二组，每组动物又分为存活期7、13、36和84周龄组。SAM-R1组中7周龄鼠5只，13周龄6只，36周龄8只，84周龄7只；SAM-P8组中各为4、7、6和5只。动物均由日本京都大学胸部疾病研究所老化生物学教研室提供。红霉素和NADPH为日本和光纯药业株式会社提供。
1.2 方法
1.2.1 肝微粒体制备 上述各组动物禁食24 h后断头处死，取出肝脏，放入试管内置于冰上。加4倍于肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液制备匀浆，经1000 g离心10 min，4 ℃。将上清液收集于另一试管内置于冰上，在上述沉淀物中再加入4倍肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液搅拌均匀，同样离心速度、时间及条件制得上清液，收集两次上清液于4 ℃ 12000 g离心15 min，再取上清液于400000g 4 ℃离心65 min。取沉淀物用0.15 mol/LKCl溶液制成匀浆，经400000g于4 ℃离心65 min，所得微粒体用新鲜配制的0.1 mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释，Lorry法[5]测定蛋白浓度。
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1.2.2 肝微粒体细胞色素P450 3A活性测定 用新鲜配制的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释肝微粒体，使蛋白终浓度为0.7～1.0 g/L，如此分别制备相同2份，取名为A、B两组。分别于A、B组中加入新鲜配制的0.1 mol/L红霉素及0.1 mol/L半尿素盐酸盐，使最终浓度分别为1mmol/L及1.25 mmol/L，再于A组中加入新鲜配制的0.1 mol/L NADPH，最终浓度为1 mmol/L；加10%三氯乙酸100 μl中止B组反应后再加0.1 mol/LNADPH，最终浓度亦为1 mmol/L，立即摇匀，同时配制作为标准曲线的C组，分别配制浓度为0.5、1.0及2.0 mmol/L甲醛溶液，取104倍稀释后的甲醛溶液各为3、6、12 μl,分别加入0.1 mmol/L半尿素盐酸盐10 μl，10%三氯乙酸333μl及0.1 mmol/L Tris-HCl缓冲液各为654、651及645 μl，使三个试管总量各为1 ml。A、B、C三组充分摇匀置室温30 min后，A组加10%三氯乙酸100 μl中止反应，立即摇匀，A、B、C组全部2500r/min 离心10 min以沉淀蛋白。取上清液200 μl,按Nash法测定代谢产物甲醛生成量。再根据标准曲线求出肝微粒体细胞色素P450 3A的活性(mmol.min-1.g-1)。
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2 结果
SAM-R1与SAM-P8组肝微粒体细胞色素P450 3A活性随年龄变化的比较见图1。
图1 SAM肝微粒体中CYP 3A活性年龄变化的比较
Fig.1 Comparison of changes of CYP3A activity with ages in hepatic microsome in SAM
从图1可见，在SAM-R1和SAM-P8组中，CYP3A活性均随年龄增长而降低。SAM-R1组的7至84各周龄组之间CYP3A活性变化不明显，经t检验，P>0.05。SAM-P8组中13周龄组CYP3A活性降低显著，下降约34%，t=3.04，P<0.01；比较13周和36周龄组则下降约35%，t=3.274，P<0.005；36至84周龄组降低约87%，t=2.27，P<0.02。可见，随着年龄增长，CYP3A活性在SAM-P8各周龄组中有不同程度的降低，而在SAM-R1组则变化不明显。
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在同龄组内比较发现，7周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组的CYP3A活性差异较显著，t=1.988，P<0.05；13周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组比较，t=2.415，P<0.02，有显著差异；而36和84周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组比较分别是：t=2.714，P<0.01和t=2.95，P<0.02，均为显著差异。
3 讨论
实验证实，在SAM-R1和SAM-P8中，CYP3A的活性均随着年龄增长而降低，这与前面提到的药物动力学研究结果是一致的[4]，其中在SAM-P8中降低最明显，于SAM-R1中变化不明显，这与SAM-P8具有被加速衰老的特征，而SAM-R1与具有正常年龄的特点相符合[1]。在同一年龄组中SAM-P8组CYP3A活性最低，以SAM-R1组为参照，提示CYP3A对学习与记忆有一定的影响作用，SAM-P8对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。
, 百拇医药
作者简介：刘卉,女1970年出生,医师,电话85142699
参考文献
1 Takeda T，Hosokawa M，Takeshita S et al.A new murine model of accelerated senescence.Mech Ageing Dev，1981,17(1):183
2 Masaomi M，Yoshihiro K，Naoki Y et al.Phys Beh ,1986，38(2): 399
3 Schmncker DL，Wang RK.Age-related changes in liver drug metabolizing enzymes.Exp Gerontol ,1980，15(2): 321
4 Christine MH，Watkins PB，Paul Saenger et al.Effect of age and gender on the activity of human hepatic CYP3A.Bioche Phar，1992,44(2): 275
5 Lorry OH.Protein measurement with Folin phenol regent.J Biol Chem,1951，193:265
(收稿日期：1999-02-02), 百拇医药
单位：刘卉 陈俊抛 (第一军医大学珠江医院神经内科，广州，510282)；平井圭一 (金泽医科大学解剖学第一讲座，金泽，日本)
关键词：细胞色素P450；3A(CYP3A)；被促衰老鼠；学习与记忆
第一军医大学学报990412 摘要：目的 探讨学习与记忆是否与细胞色素P450 3A(CYP3A)的活性变化有关。方法 本文用红霉素N-脱甲基酶活性测定法分别检测了SAM-R1和SAM-P8组被促衰老小鼠(SAM)在7、13、36及84周龄时其肝微粒体细胞色素P450 3A的活性变化。结果 以SAM-R1组为对照，随着年龄增长，SAM-P8组中的CYP3A活性明显降低。结论 CPY3A的活性随着年龄增长对学习与记忆有一定的影响。SAM-P8对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。
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中图分类号：R741.02
Effect of the activity of hepatic cytochrome P450 3A on the learning and memory in the senescence-accelerated mouse-P8(SAM-P8)
Liu Hui，Chen Jun Pao
(Department of Neurology，Zhujiang Hospital，Guangzhou，510515)
Kei Ichi Hirai
(Department of Anatomy，Kanazawa Medical University，Kanazawa，Japan) Abstract：Objective To explore whether learning and memory are concerned with activity of hepatic cytochrome P450 3A(CYP3A).Methods The activitiy of the SAM hepatic cytochrome P450 3A (CYP3A) was assessed in vitro as erythromycin N-demethylation in microsomes from senescence-accelarated mouse (SAM)-R1 and SAM-P8，at 7,13,36 and 84 weeks of age in every animal group.Results CYP3A activity decreased significantly with advancing age in SAM-P8.Conclusion CYP3A plays a very important role in senescence，and also affect learning and memory.It is suggested that SAM-P8 may be useful as an experimental animal model for senile memory impairment in humans.
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Key words：P450 3A (CYP3A); senescence-accelerated mouse (SAM);learning and memory
被促衰老小鼠 (Senescence-accelerated mouse，SAM)是一种被加速衰老的小鼠模型，是由日本Takeda等[1]制作。它包括促衰老倾向型(Senescence-accelerated prone mouse，SAM-P)和抗促衰老型(senescence-accelerated resistant mouse，SAM-R)，后者显示正常年龄组特点。SAM-P由SAM-P1、SAM-P2、SAM-P3、SAM-P6、SAM-P7、SAM-P8、SAM-P9、SAM-P10及SAM-P11组成；SAM-R则由SAM-R1、SAM-R4及SAM-R5组成。从幸存者、生长率及Gompertzian作用的结果来看，SAM-P被认为是加速衰老的年龄模型。有资料表明SAM-P的早老表现：活性降低、毛发变粗及脱落提前、眼周损害、脊柱前或后突、淀粉样变性和骨质疏松症的发病率提高以及免疫作用的降低等[1]。但这些病理表现在前9种SAM-P基质中各有不同。已证实SAM-P8具有与年龄相关的学习与记忆能力衰退的特征[2] 。CPY3A是肝脏混合功能氧化酶系(MFO)的主要成份，在内源性和外源性化合物的生物转化中起重要作用。作者主要目的是通过分别测定CPY3A在SAM-R1及SAM-P8肝微粒体中的活性变化，证实SAM肝CPY3A的活性是否随年龄的增长而降低，探讨其对学习与记忆的作用。
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1 材料和方法
1 材料 实验动物为被促衰老小鼠(SAM)，雄性，体质量100～150 g，实验分SAM-R1和SAM-P8二组，每组动物又分为存活期7、13、36和84周龄组。SAM-R1组中7周龄鼠5只，13周龄6只，36周龄8只，84周龄7只；SAM-P8组中各为4、7、6和5只。动物均由日本京都大学胸部疾病研究所老化生物学教研室提供。红霉素和NADPH为日本和光纯药业株式会社提供。
1.2 方法
1.2.1 肝微粒体制备 上述各组动物禁食24 h后断头处死，取出肝脏，放入试管内置于冰上。加4倍于肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液制备匀浆，经1000 g离心10 min，4 ℃。将上清液收集于另一试管内置于冰上，在上述沉淀物中再加入4倍肝重的0.25 mol/L蔗糖溶液搅拌均匀，同样离心速度、时间及条件制得上清液，收集两次上清液于4 ℃ 12000 g离心15 min，再取上清液于400000g 4 ℃离心65 min。取沉淀物用0.15 mol/LKCl溶液制成匀浆，经400000g于4 ℃离心65 min，所得微粒体用新鲜配制的0.1 mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释，Lorry法[5]测定蛋白浓度。
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1.2.2 肝微粒体细胞色素P450 3A活性测定 用新鲜配制的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)稀释肝微粒体，使蛋白终浓度为0.7～1.0 g/L，如此分别制备相同2份，取名为A、B两组。分别于A、B组中加入新鲜配制的0.1 mol/L红霉素及0.1 mol/L半尿素盐酸盐，使最终浓度分别为1mmol/L及1.25 mmol/L，再于A组中加入新鲜配制的0.1 mol/L NADPH，最终浓度为1 mmol/L；加10%三氯乙酸100 μl中止B组反应后再加0.1 mol/LNADPH，最终浓度亦为1 mmol/L，立即摇匀，同时配制作为标准曲线的C组，分别配制浓度为0.5、1.0及2.0 mmol/L甲醛溶液，取104倍稀释后的甲醛溶液各为3、6、12 μl,分别加入0.1 mmol/L半尿素盐酸盐10 μl，10%三氯乙酸333μl及0.1 mmol/L Tris-HCl缓冲液各为654、651及645 μl，使三个试管总量各为1 ml。A、B、C三组充分摇匀置室温30 min后，A组加10%三氯乙酸100 μl中止反应，立即摇匀，A、B、C组全部2500r/min 离心10 min以沉淀蛋白。取上清液200 μl,按Nash法测定代谢产物甲醛生成量。再根据标准曲线求出肝微粒体细胞色素P450 3A的活性(mmol.min-1.g-1)。
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2 结果
SAM-R1与SAM-P8组肝微粒体细胞色素P450 3A活性随年龄变化的比较见图1。
图1 SAM肝微粒体中CYP 3A活性年龄变化的比较
Fig.1 Comparison of changes of CYP3A activity with ages in hepatic microsome in SAM
从图1可见，在SAM-R1和SAM-P8组中，CYP3A活性均随年龄增长而降低。SAM-R1组的7至84各周龄组之间CYP3A活性变化不明显，经t检验，P>0.05。SAM-P8组中13周龄组CYP3A活性降低显著，下降约34%，t=3.04，P<0.01；比较13周和36周龄组则下降约35%，t=3.274，P<0.005；36至84周龄组降低约87%，t=2.27，P<0.02。可见，随着年龄增长，CYP3A活性在SAM-P8各周龄组中有不同程度的降低，而在SAM-R1组则变化不明显。
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在同龄组内比较发现，7周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组的CYP3A活性差异较显著，t=1.988，P<0.05；13周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组比较，t=2.415，P<0.02，有显著差异；而36和84周龄鼠SAM-P8与SAM-R1两组比较分别是：t=2.714，P<0.01和t=2.95，P<0.02，均为显著差异。
3 讨论
实验证实，在SAM-R1和SAM-P8中，CYP3A的活性均随着年龄增长而降低，这与前面提到的药物动力学研究结果是一致的[4]，其中在SAM-P8中降低最明显，于SAM-R1中变化不明显，这与SAM-P8具有被加速衰老的特征，而SAM-R1与具有正常年龄的特点相符合[1]。在同一年龄组中SAM-P8组CYP3A活性最低，以SAM-R1组为参照，提示CYP3A对学习与记忆有一定的影响作用，SAM-P8对研究有关人类衰老时记忆减退提供确实有效的动物模型。
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作者简介：刘卉,女1970年出生,医师,电话85142699
参考文献
1 Takeda T，Hosokawa M，Takeshita S et al.A new murine model of accelerated senescence.Mech Ageing Dev，1981,17(1):183
2 Masaomi M，Yoshihiro K，Naoki Y et al.Phys Beh ,1986，38(2): 399
3 Schmncker DL，Wang RK.Age-related changes in liver drug metabolizing enzymes.Exp Gerontol ,1980，15(2): 321
4 Christine MH，Watkins PB，Paul Saenger et al.Effect of age and gender on the activity of human hepatic CYP3A.Bioche Phar，1992,44(2): 275
5 Lorry OH.Protein measurement with Folin phenol regent.J Biol Chem,1951，193:265
(收稿日期：1999-02-02), 百拇医药