125I-白蛋白-黄芪多糖毫微粒在小鼠体内分布的研究*
作者：易以木 杨唐玉 潘卫民
单位：同济医科大学药学院药剂学教研室，武汉 430030 易以木；同济医科大学药学院药物学研究室，武汉 430030 杨唐玉；同济医科大学实验医学研究中心核医学实验室，武汉 430030 潘卫民
关键词：125I-标记；牛血清白蛋白-黄芪多糖毫微粒；药物载体；药代动力学
同济医科大学学报990322 摘要 用乳液固化方法制备了125I-牛血清白蛋白-黄芪多糖毫微粒，透射电子显微镜测得粒径为(168±62) nm，小鼠口服毫微粒(148×108 Bq/只)后，主要分布在肝、脾、肺中，而心、脑组织中有少量分布。微观放射自显影实验结果表明，毫微粒分布在肝脏的Kuffers细胞和肝实质细胞中，以及在肺和脾脏的吞噬细胞中。实验数据用3P87程序处理，按血管外给药开放二室模型计算得代谢动力参数，Tmax为2.11 h，Cmax为2.43×107 Bq，t1/2为9.33 h，曲线下面积为3.7×109 Bq。
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Studies on Distribution of 125 I- Bovine Serum Albumin Astragalus
Polysaccharide Nanoparticle in vivo
Yi Yimu1, Yang Tangyu2, Pan Weimin3
1 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Drug Research Department, School of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
3 Nuclear Medical Laboratory, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract 125I-labled bovine serum albumin astragalus polysaccharide nanoparticle was prepared by using emulsion solidification method with the size being (168±62)nm unde the transmission electron microscopy . After oral administration of nanoparticles (148×108 Bq) to mice, nanoparticles mainly distributed in liver, spleen and lung, little was found in the heart and brain, and no nanoparticle in the muscle. The microhistological radioautographic test showed that nanoparticles existed in Kuppffers cells of liver, and phagocytes of spleen and lung. Metabolic dynamic parameters were calculated in two-compartment model: Tmax=2.11 h, Cmax=2.43×107 Bq, t1/2=9.33 h, AUC=3.7×109 Bq.
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Key words 125 I-labeled; bovine serum albumin astragalus polysaccharide nanoparticle; drug carriers; pharmacokinetics
毫微粒(Nanoparticle，简称NP)是一种粒径在1～1000 nm的超微粒给药系统，自70年代末问世以来，国内外学者对它的制备方法、稳定性及体内分布等进行过大量的研究[1～3]。早期的文献主要报道了NP的制备方法，影响载药量的因素，以及静脉给药后的体内分布情况。80年代后科学家们开始探讨NP作为口服给药的可能性，并对吸收途径和体内分布情况进行了深入的研究。
我们使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)以及黄芪多糖作为口服毫微粒的载体，探讨其动物口服后体内分布及代谢情况。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 材料
黄芪多糖(成都地奥制药厂生产)，BSA(生化试剂，德国生产，上海分装)，戊二醛(生化试剂Merck生产)；透射电子显微镜(日立Hu-11A)，GAMA计数器(西安262厂生产)，Na 125 I(中国原子能科学研究院，放射性浓度为7.87 TBq/L)，核-4型液体核乳胶(中国原子能科学研究院物理所)；实验动物：昆明种小白鼠，体重(20±2) g，同济医科大学实验动物学部提供。
1.2 方法
1.2.1 125I- BSA的制备：取BSA 10 mg溶于10 ml蒸馏水中，以氯胺-T法，用125I-标记，终止反应后，用Sephadex G-50(10 mm×340 mm)凝胶柱层分离，用Na2S2O3洗脱，再用三氯醋酸法测定放化纯度。
, 百拇医药
1.2.2 125I-BSA-黄芪多糖NP制备：取上述制得的125I-BSA(1 mg/ml，放射活度107 Bq)溶液1 ml，掺入到BSA溶液中，按文献[4]方法制备BSA黄芪多糖NP。
1.2.3 毫微粒的粒径测定：取125I标记的BSA-黄芪多糖NP混悬液适量，用透射电镜测定NP的粒径。
1.2.4 125I-BSA-黄芪多糖NP在小鼠体内分布：取昆明种小鼠45只分成15组，每组3只，禁食16 h后，按每只148×108 Bq灌胃，于不同时间取眼眶血(加肝素抗凝)，随即将小鼠脊髓断离处死，取各有关组织、脏器，洗净血污，用滤纸吸去水份后，称重，并用GAMA计数器计算出重量各组织计数，计算各时间点的组织/血比值。用计算机3P87程序，经拟合符合血管外给药开放二室模型，取得有关动力学参数。
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1.2.5 放射自显影：在进行组织分布实验同时取部分时间点(4、8、12 h)的肝、脾、肺、肾组织，分别制成6 μm厚的冰冻切片及石蜡切片，用核4-型液体乳胶作微观自显影。
2 结果
2.1 125I-BSA的制备、纯化
BSA经过125I标记后，用Sephadex G-50凝胶柱层分离，取得纯化的125I-BSA。
2.2 125I-BSA-黄芪多糖NP的粒径测定结果
取125I-BSA-黄芪多糖NP混悬液适量，经透射电镜测定粒径，其平均粒径为(168±62) nm，其中<50 nm占11%，50～100 nm 16%，100～150 nm 24%，150～200 nm 33%，>200 nm 16%。
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2.3 125I-BSA-黄芪多糖NP的体内分布
小鼠口服125I-BSA黄芪多糖NP 30 min后，血中有明显放射计数，2 h时肝、脾、肺中的放射计数分别是血中的1.72、1.82、1.14倍，8 h时肝、脾、肺中的放射计数分别是血中的2.39、2.45、1.24倍，见表1。
2.4 125I-BSA黄芪多糖NP小鼠体内代谢动力学
将小鼠各时间点的放射计数输入计算机，用3P87程序按开二室模型计算代谢动力学参数，结果见表2。
2.5 放射自显影
微观自显影实验结果表明，动物口服125I-BSA-黄芪多糖NP后主要分布在肝脏的Kuffer's细胞及肝实质细胞(图1)。在脾脏的吞噬细胞内可见银颗粒(图2)，在肺泡细胞内可见银颗粒(图3)。
, http://www.100md.com
图1 NP在肝内的分布。HE染色 ×400
图2 NP在脾内的分布。HE染色×1000
图3 NP在肺内的分布。HE染色×1000
表1 125I-BSA-黄芪多糖NP小鼠体内分布(n=3，
±s，灌胃剂量为148×108 Bq/只) 器官
每100 mg组织30 s的放射计数
1 h
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2 h
4 h
8 h
16 h
24 h
36 h
血液
477
±116
736
±102
618
±124
, http://www.100md.com
407
±101
302
±39
211
±28
138
±21
心
376
±101
492
±97
, 百拇医药
517
±114
262
±91
207
±71
134
±21
76
±206
肝
617
±108
, 百拇医药
1263
±340
1066
±214
976
±102
677
±62
313
±67
159
±19
脾
, http://www.100md.com
832
±161
1343
±389
1291
±207
996
±173
718
±91
390
±67
171
, 百拇医药
±20
肺
492
±72
836
±103
711
±112
506
±91
431
±39
176
, 百拇医药
±31
151
±22
肾
413
±96
871
±166
393
±131
361
±102
324
, 百拇医药
±106
130
±29
116
±37
脑
92
±27
119
±74
101
±39
90
, 百拇医药 ±62
73
±14
42
±11
27
±8
胃
96741
±6329
72754
±2319
31062
, http://www.100md.com
±2718
26775
±1716
4538
±806
783
±104
311
±68
表2 125I-BSA黄芪多糖NP在小鼠体内代谢动力学参数
参 数
单位
, 百拇医药
数值
截距(A)
Bq
3.16×103
混杂参数(α)
1/h
0.06
截距(B)
Bq
3.11×103
混杂参数(β)
1/h
, 百拇医药
-0.13
吸收速度常数(Ka)
1/h
1.37
表现分布容积(V/F)
Bq
-1.406×103
分布半衰期(t1/2α)
h
9.33
消除半衰期(t1/2β)
, 百拇医药 h
-5.90
吸收半衰期(t1/2Ka)
h
0.43
转运速度常数(K21)
1/h
-0.12
消除速度常数(K10)
1/h
-0.06
转运速度常数(K12)
, 百拇医药
1/h
-0.000 32
曲线下面积(AUC)
Bq×h
3.7×109
总清除率[CL(s)]
(Bq×h)Bq
1.44×103
达峰时间[T(peak)]
h
2.11
达峰浓度(Cmax)
, 百拇医药
Bq
2.43×107
3 讨论
NP作为靶向给药系统自70年代后期问世以来，国内外文献报道了一些人工合成材料如聚氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸等NP制备的方法以及影响载药量的因素，静脉给药后体内分布情况[1]。本文有别于以往的研究，使用牛血清白蛋白及黄芪多糖作毫微粒的载体，探讨了动物口服该毫微粒后体内的分布情况，试图为寻找毒性小、生物相容性好的载体提供一定依据。
小鼠口服125I-标记BSA黄芪多糖NP 30 min后，血中可检出放射性物质，说明毫微粒口服后吸收较快，2 h后血液计数达到高峰。通过放射计数说明，毫微粒主要分布在肝、脾、肺组织中，而心脏中也有少量分布，脑组织中分布量极少，说明毫微粒不易通过血脑屏障。试验结果提示，口服BSA黄芪多糖NP可通过胃肠道吸收进入大循环，主要分布在吞噬细胞较丰富的肝、脾组织中，与文献报道相一致[2]。
, 百拇医药
在体内分布试验中可以看出，给药12 h后胃肠道中仍有较大量的放射计数，说明此时仍有一些NP未被吸收，这是因为NP混悬液中有一些NP呈絮凝状态，不是单个分散体，由于这些聚集体的粒径较大，不易被肠道吸收。
为了提高口服毫微粒的吸收程度，必须控制NP粒径大小，防止形成多聚体。
* 国家自然科学基金资助项目(No. 39270809)
作者简介:易以木，男，1954年生，副教授
参考文献
1 Elizaeth M G, Groscurth P, Kreuter J. Distribution of polyhexlcyanoacrylate nanoparticles in nude mice over extended times and after repeated injectional. J Pharm Sci, 1988, 77: 208
, 百拇医药
2 Morincent P, Le Verge R, Sado P et al. Disposition kinetics and oral bioavailability of vincamin-loaded polyalkyl cyanocarylate nanoparticles. J Pharm Sci, 1986, 75: 955
3 Brannon-Peppae L. Recent advances on the use of biodegradable microparticles and nanoparticles in controlled drug delivery. Int J Pharm， 1995， 116: 1
4 杨唐玉. 5-Fu肝素钠-白蛋白毫微粒的研究. 中国药学杂志, 1995, 30(20): 728
(1998-12-25 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学药学院药剂学教研室，武汉 430030 易以木；同济医科大学药学院药物学研究室，武汉 430030 杨唐玉；同济医科大学实验医学研究中心核医学实验室，武汉 430030 潘卫民
关键词：125I-标记；牛血清白蛋白-黄芪多糖毫微粒；药物载体；药代动力学
同济医科大学学报990322 摘要 用乳液固化方法制备了125I-牛血清白蛋白-黄芪多糖毫微粒，透射电子显微镜测得粒径为(168±62) nm，小鼠口服毫微粒(148×108 Bq/只)后，主要分布在肝、脾、肺中，而心、脑组织中有少量分布。微观放射自显影实验结果表明，毫微粒分布在肝脏的Kuffers细胞和肝实质细胞中，以及在肺和脾脏的吞噬细胞中。实验数据用3P87程序处理，按血管外给药开放二室模型计算得代谢动力参数，Tmax为2.11 h，Cmax为2.43×107 Bq，t1/2为9.33 h，曲线下面积为3.7×109 Bq。
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Studies on Distribution of 125 I- Bovine Serum Albumin Astragalus
Polysaccharide Nanoparticle in vivo
Yi Yimu1, Yang Tangyu2, Pan Weimin3
1 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Drug Research Department, School of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
3 Nuclear Medical Laboratory, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract 125I-labled bovine serum albumin astragalus polysaccharide nanoparticle was prepared by using emulsion solidification method with the size being (168±62)nm unde the transmission electron microscopy . After oral administration of nanoparticles (148×108 Bq) to mice, nanoparticles mainly distributed in liver, spleen and lung, little was found in the heart and brain, and no nanoparticle in the muscle. The microhistological radioautographic test showed that nanoparticles existed in Kuppffers cells of liver, and phagocytes of spleen and lung. Metabolic dynamic parameters were calculated in two-compartment model: Tmax=2.11 h, Cmax=2.43×107 Bq, t1/2=9.33 h, AUC=3.7×109 Bq.
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Key words 125 I-labeled; bovine serum albumin astragalus polysaccharide nanoparticle; drug carriers; pharmacokinetics
毫微粒(Nanoparticle，简称NP)是一种粒径在1～1000 nm的超微粒给药系统，自70年代末问世以来，国内外学者对它的制备方法、稳定性及体内分布等进行过大量的研究[1～3]。早期的文献主要报道了NP的制备方法，影响载药量的因素，以及静脉给药后的体内分布情况。80年代后科学家们开始探讨NP作为口服给药的可能性，并对吸收途径和体内分布情况进行了深入的研究。
我们使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)以及黄芪多糖作为口服毫微粒的载体，探讨其动物口服后体内分布及代谢情况。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 材料
黄芪多糖(成都地奥制药厂生产)，BSA(生化试剂，德国生产，上海分装)，戊二醛(生化试剂Merck生产)；透射电子显微镜(日立Hu-11A)，GAMA计数器(西安262厂生产)，Na 125 I(中国原子能科学研究院，放射性浓度为7.87 TBq/L)，核-4型液体核乳胶(中国原子能科学研究院物理所)；实验动物：昆明种小白鼠，体重(20±2) g，同济医科大学实验动物学部提供。
1.2 方法
1.2.1 125I- BSA的制备：取BSA 10 mg溶于10 ml蒸馏水中，以氯胺-T法，用125I-标记，终止反应后，用Sephadex G-50(10 mm×340 mm)凝胶柱层分离，用Na2S2O3洗脱，再用三氯醋酸法测定放化纯度。
, 百拇医药
1.2.2 125I-BSA-黄芪多糖NP制备：取上述制得的125I-BSA(1 mg/ml，放射活度107 Bq)溶液1 ml，掺入到BSA溶液中，按文献[4]方法制备BSA黄芪多糖NP。
1.2.3 毫微粒的粒径测定：取125I标记的BSA-黄芪多糖NP混悬液适量，用透射电镜测定NP的粒径。
1.2.4 125I-BSA-黄芪多糖NP在小鼠体内分布：取昆明种小鼠45只分成15组，每组3只，禁食16 h后，按每只148×108 Bq灌胃，于不同时间取眼眶血(加肝素抗凝)，随即将小鼠脊髓断离处死，取各有关组织、脏器，洗净血污，用滤纸吸去水份后，称重，并用GAMA计数器计算出重量各组织计数，计算各时间点的组织/血比值。用计算机3P87程序，经拟合符合血管外给药开放二室模型，取得有关动力学参数。
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1.2.5 放射自显影：在进行组织分布实验同时取部分时间点(4、8、12 h)的肝、脾、肺、肾组织，分别制成6 μm厚的冰冻切片及石蜡切片，用核4-型液体乳胶作微观自显影。
2 结果
2.1 125I-BSA的制备、纯化
BSA经过125I标记后，用Sephadex G-50凝胶柱层分离，取得纯化的125I-BSA。
2.2 125I-BSA-黄芪多糖NP的粒径测定结果
取125I-BSA-黄芪多糖NP混悬液适量，经透射电镜测定粒径，其平均粒径为(168±62) nm，其中<50 nm占11%，50～100 nm 16%，100～150 nm 24%，150～200 nm 33%，>200 nm 16%。
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2.3 125I-BSA-黄芪多糖NP的体内分布
小鼠口服125I-BSA黄芪多糖NP 30 min后，血中有明显放射计数，2 h时肝、脾、肺中的放射计数分别是血中的1.72、1.82、1.14倍，8 h时肝、脾、肺中的放射计数分别是血中的2.39、2.45、1.24倍，见表1。
2.4 125I-BSA黄芪多糖NP小鼠体内代谢动力学
将小鼠各时间点的放射计数输入计算机，用3P87程序按开二室模型计算代谢动力学参数，结果见表2。
2.5 放射自显影
微观自显影实验结果表明，动物口服125I-BSA-黄芪多糖NP后主要分布在肝脏的Kuffer's细胞及肝实质细胞(图1)。在脾脏的吞噬细胞内可见银颗粒(图2)，在肺泡细胞内可见银颗粒(图3)。
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图1 NP在肝内的分布。HE染色 ×400
图2 NP在脾内的分布。HE染色×1000
图3 NP在肺内的分布。HE染色×1000
表1 125I-BSA-黄芪多糖NP小鼠体内分布(n=3，
±s，灌胃剂量为148×108 Bq/只) 器官每100 mg组织30 s的放射计数
1 h
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2 h
4 h
8 h
16 h
24 h
36 h
血液
477
±116
736
±102
618
±124
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407
±101
302
±39
211
±28
138
±21
心
376
±101
492
±97
, 百拇医药
517
±114
262
±91
207
±71
134
±21
76
±206
肝
617
±108
, 百拇医药
1263
±340
1066
±214
976
±102
677
±62
313
±67
159
±19
脾
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832
±161
1343
±389
1291
±207
996
±173
718
±91
390
±67
171
, 百拇医药
±20
肺
492
±72
836
±103
711
±112
506
±91
431
±39
176
, 百拇医药
±31
151
±22
肾
413
±96
871
±166
393
±131
361
±102
324
, 百拇医药
±106
130
±29
116
±37
脑
92
±27
119
±74
101
±39
90
, 百拇医药 ±62
73
±14
42
±11
27
±8
胃
96741
±6329
72754
±2319
31062
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±2718
26775
±1716
4538
±806
783
±104
311
±68
表2 125I-BSA黄芪多糖NP在小鼠体内代谢动力学参数
参 数
单位
, 百拇医药
数值
截距(A)
Bq
3.16×103
混杂参数(α)
1/h
0.06
截距(B)
Bq
3.11×103
混杂参数(β)
1/h
, 百拇医药
-0.13
吸收速度常数(Ka)
1/h
1.37
表现分布容积(V/F)
Bq
-1.406×103
分布半衰期(t1/2α)
h
9.33
消除半衰期(t1/2β)
, 百拇医药 h
-5.90
吸收半衰期(t1/2Ka)
h
0.43
转运速度常数(K21)
1/h
-0.12
消除速度常数(K10)
1/h
-0.06
转运速度常数(K12)
, 百拇医药
1/h
-0.000 32
曲线下面积(AUC)
Bq×h
3.7×109
总清除率[CL(s)]
(Bq×h)Bq
1.44×103
达峰时间[T(peak)]
h
2.11
达峰浓度(Cmax)
, 百拇医药
Bq
2.43×107
3 讨论
NP作为靶向给药系统自70年代后期问世以来，国内外文献报道了一些人工合成材料如聚氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸等NP制备的方法以及影响载药量的因素，静脉给药后体内分布情况[1]。本文有别于以往的研究，使用牛血清白蛋白及黄芪多糖作毫微粒的载体，探讨了动物口服该毫微粒后体内的分布情况，试图为寻找毒性小、生物相容性好的载体提供一定依据。
小鼠口服125I-标记BSA黄芪多糖NP 30 min后，血中可检出放射性物质，说明毫微粒口服后吸收较快，2 h后血液计数达到高峰。通过放射计数说明，毫微粒主要分布在肝、脾、肺组织中，而心脏中也有少量分布，脑组织中分布量极少，说明毫微粒不易通过血脑屏障。试验结果提示，口服BSA黄芪多糖NP可通过胃肠道吸收进入大循环，主要分布在吞噬细胞较丰富的肝、脾组织中，与文献报道相一致[2]。
, 百拇医药
在体内分布试验中可以看出，给药12 h后胃肠道中仍有较大量的放射计数，说明此时仍有一些NP未被吸收，这是因为NP混悬液中有一些NP呈絮凝状态，不是单个分散体，由于这些聚集体的粒径较大，不易被肠道吸收。
为了提高口服毫微粒的吸收程度，必须控制NP粒径大小，防止形成多聚体。
* 国家自然科学基金资助项目(No. 39270809)
作者简介:易以木，男，1954年生，副教授
参考文献
1 Elizaeth M G, Groscurth P, Kreuter J. Distribution of polyhexlcyanoacrylate nanoparticles in nude mice over extended times and after repeated injectional. J Pharm Sci, 1988, 77: 208
, 百拇医药
2 Morincent P, Le Verge R, Sado P et al. Disposition kinetics and oral bioavailability of vincamin-loaded polyalkyl cyanocarylate nanoparticles. J Pharm Sci, 1986, 75: 955
3 Brannon-Peppae L. Recent advances on the use of biodegradable microparticles and nanoparticles in controlled drug delivery. Int J Pharm， 1995， 116: 1
4 杨唐玉. 5-Fu肝素钠-白蛋白毫微粒的研究. 中国药学杂志, 1995, 30(20): 728
(1998-12-25 收稿), 百拇医药