8种不同转移潜能人癌细胞系中nm23基因的表达
作者：李珊珊 方伟岗 任秀花 闫爱华 沈琼
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：nm23基因；基因，抑制，肿瘤转移；肿瘤细胞；Northern印迹
河南医科大学学报000207摘 要：目的：探讨肿瘤转移抑制基因nm23在人前列腺癌细胞、肺癌细胞和人黑色素瘤细胞系中的转移抑制作用。方法：应用Northern blot杂交法检测8种不同转移潜能人癌细胞中(PC3,PC3M,PAa,PG,WM35,WM1341b,WM983a和WM451) nm23基因的表达。结果：nm23 mRNA在8种不同转移潜能的人癌细胞中都有表达，且nm23表达水平也未见差异。结论：nm23基因可能与这些细胞系(前列腺癌细胞、肺癌细胞及黑色素瘤) 的转移抑制无关。
, 百拇医药
分类号：R730.2
Expressions of nm23 gene in eight human cancer cell lines with different metastatic potentials
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
, http://www.100md.com
YAN Aihua,REN Xiuhua,SHEN Qiong
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To investigate the nm23 gene suppression of metastasis in human prostate cancer,lung cancer and melanoma cell lines.Methods:Expressions of nm23 gene in eight human cancer cell lines,PC3,PC3M,PAa,PG,WM35,WM1341b,WM983a and WM451,with different metastasis potentials were studied by Northern blot hybridization.Results:mRNA of nm23 all expressed in eight human cancer cell lines with different metastasis potentials and no difference in nm23 expression levels was observed in these cancer cell lines.Conclusion:nm23 gene may not correlate with metastatic suppression of these cancer cell lines(human prostate and lung cancer cells，and human melanoma cells).
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Keys words：nm23 gene;gene,suppressor,neoplasm metastasis;human cancer cell;Northern blot▲
肿瘤转移是涉及一系列遗传因素的复杂过程。它可能受到两类作用相反基因既转移促进和转移抑制基因的调控。人们一直在试图寻找肿瘤转移中的促进和抑制因素，nm23是人们研究比较多的一个肿瘤转移抑制基因。nm23最初作为转移抑制基因被克隆是因其表达能降低肿瘤转移而不影响肿瘤生存。现已证实nm23低表达与包括乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤和胃癌在内的许多肿瘤转移和预后差有关。研究发现人类基因组中有两个nm23基因nm23-H1和nm23-H2。普遍认为nm23-H1具有抑制癌转移作用。作者观察了nm23基因在3组8种不同转移潜能的人癌细胞中的表达，进一步探讨nm23在这些肿瘤细胞中的转移抑制作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 选取8种不同转移潜能的人癌细胞系。PC3,PC3M(人前列腺癌细胞系)；PAa,PG(人肺癌细胞系)；WM35,WM1341b,WM983a,WM451(人黑色素瘤细胞系)。前列腺癌细胞系和肺癌细胞系均采用含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基；黑色素瘤细胞系采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃，体积分数5% CO2及恒定湿度条件下培养，每3 d换液1次。以上各组癌细胞的转移能力均经裸鼠体内实验确认。
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1.2 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。RNA甲醛变性凝胶电泳：配制12 g/L甲醛变性凝胶，甲醛浓度为体积分数2.2%，RNA上样量为20 μg。恒压电泳。以虹吸法将凝胶转移至尼龙膜上。
1.3 探针制备 PNM23-H1 cDNA重组质粒(北京医科大学分子病理实验室提供),按常规扩增质粒。用碱裂解法提取质粒DNA。以PCR扩增质粒DNA，制备裸探针。nm23-H1引物序列：5'-TTGAGCGTACCTCCATTGCGATC-3'(上游)，5'-TTTGCACTCTCCACAGAATCACT-3'(下游)；β-actin引物序列：5'-GAATTCATGTTTGAGACCTTCAA-3'(上游)，5'-CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'(下游) (两种引物均由北京医科大学分子病理实验室合成)。nm23-H1和β-actin扩增片段大小分别为366 bp和326 bp，并纯化之。探针标记(随机引物法)：采用Prime-α-Gene Labeling System (Promega公司)。取裸探针约30 ng，以α-32P-dCTP(北京亚辉生物医学公司)标记。
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1.4 Northern blot杂交 将已转移的尼龙膜在预杂交液中浸湿(预杂交液：0.5 mol/L Na2HPO4，70 g/L SDS，1 mmol/L EDTA)，装入杂交袋中，68 ℃，预杂交30 min。将已标记的探针于95 ℃变性后，加入杂交袋中，68 ℃水浴摇床杂交12 h以上。杂交结束后取出滤膜，进行洗膜。室温稍晾，封入保鲜膜中，置暗盒内-70 ℃放射自显影14 d。观察nm23 mRNA在8种不同转移潜能人癌细胞系中的表达。
2 结果
nm23 Northern blot杂交结果见图1。a为3组8种不同转移潜能人癌细胞系中nm23的表达。b为同张膜杂β-actin作为内参对照。图2是对杂交信号进行扫描分析后，计算nm23与β-actin两者之间的光密度比值，以消除样品之间RNA上样量的误差。图1，2显示，8种细胞系不论转移潜能高低，nm23 mRNA表达强度未见明显差异。
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图1 8种癌细胞系nm23 Northern blot结果
a：nm23基因； b：β-actin内参对照
1：PC3M； 2：PC3； 3：PG； 4：PAa； 5：WM35； 6：WM451； 7：WM983a； 8：WM1341b
图2 8种癌细胞nm23与β-actin光密度比值
1：PC3M； 2：PC3； 3：PG； 4：PAa； 5：WM35； 6：WM451； 7：WM983a； 8：WM1341b
3 讨论
nm23基因是Steeg等[1]于1988年在K-1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交法分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因。它在低转移细胞株中表达强度是高转移细胞株中的10倍。之后，nm23的肿瘤转移抑制作用引起了人们的关注。人们观察了nm23在多种肿瘤组织中的转移抑制作用。现已证实乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤和胃癌等多种肿瘤的转移与nm23的低表达有关[1～3]。Leone等[4]报道nm23基因的等位丢失可能是其功能失活的原因。但有些学者的研究未能证实nm23的肿瘤转移抑制作用[5,6]，Thiede等[5]的研究在结直肠癌肝转移组织中未发现nm23-H1突变或杂合性丢失，且在正常组织和转移组织中nm23-H1 mRNA表达也无显著差异。为了进一步证实nm23的肿瘤转移抑制作用，作者观察了8种具有不同转移潜能人癌细胞中nm23基因的表达。
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PC3和PC3M为一对前列腺癌细胞系，两者均具有转移性，PC3M来自PC3的转移灶，为PC3的高转移亚系。PG为人肺巨细胞癌系，具有高转移潜能。PAa为人肺腺癌细胞系，基本无转移能力。4种人黑色素瘤细胞系WM35、WM1341b、WM983a、WM451，其转移能力逐渐升高，其中WM35无转移能力，WM451转移能力最强。8种细胞系中nm23 基因表达情况见图1。结果显示 ：8个细胞系nm23 mRNA均有表达，除PAa表达稍低外，其余细胞系nm23表达基本一致。由此可见，nm23基因可能与这些细胞系的转移抑制无关。有学者认为nm23基因的转移抑制作用具有组织特异性和时限性，其在人类肿瘤中的表达可因肿瘤发生器官不同而有差异[7]。目前对nm23的作用有3种看法：①nm23表达(mRNA或蛋白)的改变引起肿瘤转移能力相反或相应地改变，说明nm23是影响肿瘤转移的相关基因；②nm23基因结构的改变导致肿瘤转移发生而与nm23表达量无关；③nm23与肿瘤转移无关[8]。
癌转移是受多因素影响和多基因控制的。在肿瘤细胞获得侵袭、播散和转移的过程中，细胞基因改变且相互协调，瘤细胞必须表达有机组合的一系列基因产物才能完成转移过程。
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参考文献：
[1]Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastasis potential.J Natl Cancer Inst,1988,80:200
[2]Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1993,85:727
[3]Nakayama T,Ohtsuru A,Nakao K,et al.Expression in hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase,a homolog of the nm23 gene product.J Natl Cancer Inst,1992,84:1349
, http://www.100md.com
[4]Leone A,McBride OW,Weston A,et al.Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer.Cancer Res ,1991,51:2490
[5]Thiede HC,Poppe K,Kant ED，et al.Suppression and mutational analysis of nm23-H1 in liver metastases of colorectal cancer.Br J Cancer,1994,70:1 267
[6]Haut M,Steeg PS,Willson JK,et al.Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1991,83:712
, http://www.100md.com
[7]Mandai M,Konishi I,Koshiyama M,et al.Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas:Correlation with clinicopathology,EGFR,c-erbB-2,and c-erbB3 genes,and sex steroid receptor expression.Cancer Res,1994,54:1825
[8]Editorial.Nm23-A metastasis suppressor gene?J Pathol,1994,173:211
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：nm23基因；基因，抑制，肿瘤转移；肿瘤细胞；Northern印迹
河南医科大学学报000207摘 要：目的：探讨肿瘤转移抑制基因nm23在人前列腺癌细胞、肺癌细胞和人黑色素瘤细胞系中的转移抑制作用。方法：应用Northern blot杂交法检测8种不同转移潜能人癌细胞中(PC3,PC3M,PAa,PG,WM35,WM1341b,WM983a和WM451) nm23基因的表达。结果：nm23 mRNA在8种不同转移潜能的人癌细胞中都有表达，且nm23表达水平也未见差异。结论：nm23基因可能与这些细胞系(前列腺癌细胞、肺癌细胞及黑色素瘤) 的转移抑制无关。
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分类号：R730.2
Expressions of nm23 gene in eight human cancer cell lines with different metastatic potentials
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
, http://www.100md.com
YAN Aihua,REN Xiuhua,SHEN Qiong
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To investigate the nm23 gene suppression of metastasis in human prostate cancer,lung cancer and melanoma cell lines.Methods:Expressions of nm23 gene in eight human cancer cell lines,PC3,PC3M,PAa,PG,WM35,WM1341b,WM983a and WM451,with different metastasis potentials were studied by Northern blot hybridization.Results:mRNA of nm23 all expressed in eight human cancer cell lines with different metastasis potentials and no difference in nm23 expression levels was observed in these cancer cell lines.Conclusion:nm23 gene may not correlate with metastatic suppression of these cancer cell lines(human prostate and lung cancer cells，and human melanoma cells).
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Keys words：nm23 gene;gene,suppressor,neoplasm metastasis;human cancer cell;Northern blot▲
肿瘤转移是涉及一系列遗传因素的复杂过程。它可能受到两类作用相反基因既转移促进和转移抑制基因的调控。人们一直在试图寻找肿瘤转移中的促进和抑制因素，nm23是人们研究比较多的一个肿瘤转移抑制基因。nm23最初作为转移抑制基因被克隆是因其表达能降低肿瘤转移而不影响肿瘤生存。现已证实nm23低表达与包括乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤和胃癌在内的许多肿瘤转移和预后差有关。研究发现人类基因组中有两个nm23基因nm23-H1和nm23-H2。普遍认为nm23-H1具有抑制癌转移作用。作者观察了nm23基因在3组8种不同转移潜能的人癌细胞中的表达，进一步探讨nm23在这些肿瘤细胞中的转移抑制作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 选取8种不同转移潜能的人癌细胞系。PC3,PC3M(人前列腺癌细胞系)；PAa,PG(人肺癌细胞系)；WM35,WM1341b,WM983a,WM451(人黑色素瘤细胞系)。前列腺癌细胞系和肺癌细胞系均采用含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基；黑色素瘤细胞系采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃，体积分数5% CO2及恒定湿度条件下培养，每3 d换液1次。以上各组癌细胞的转移能力均经裸鼠体内实验确认。
, 百拇医药
1.2 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。RNA甲醛变性凝胶电泳：配制12 g/L甲醛变性凝胶，甲醛浓度为体积分数2.2%，RNA上样量为20 μg。恒压电泳。以虹吸法将凝胶转移至尼龙膜上。
1.3 探针制备 PNM23-H1 cDNA重组质粒(北京医科大学分子病理实验室提供),按常规扩增质粒。用碱裂解法提取质粒DNA。以PCR扩增质粒DNA，制备裸探针。nm23-H1引物序列：5'-TTGAGCGTACCTCCATTGCGATC-3'(上游)，5'-TTTGCACTCTCCACAGAATCACT-3'(下游)；β-actin引物序列：5'-GAATTCATGTTTGAGACCTTCAA-3'(上游)，5'-CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'(下游) (两种引物均由北京医科大学分子病理实验室合成)。nm23-H1和β-actin扩增片段大小分别为366 bp和326 bp，并纯化之。探针标记(随机引物法)：采用Prime-α-Gene Labeling System (Promega公司)。取裸探针约30 ng，以α-32P-dCTP(北京亚辉生物医学公司)标记。
, http://www.100md.com
1.4 Northern blot杂交 将已转移的尼龙膜在预杂交液中浸湿(预杂交液：0.5 mol/L Na2HPO4，70 g/L SDS，1 mmol/L EDTA)，装入杂交袋中，68 ℃，预杂交30 min。将已标记的探针于95 ℃变性后，加入杂交袋中，68 ℃水浴摇床杂交12 h以上。杂交结束后取出滤膜，进行洗膜。室温稍晾，封入保鲜膜中，置暗盒内-70 ℃放射自显影14 d。观察nm23 mRNA在8种不同转移潜能人癌细胞系中的表达。
2 结果
nm23 Northern blot杂交结果见图1。a为3组8种不同转移潜能人癌细胞系中nm23的表达。b为同张膜杂β-actin作为内参对照。图2是对杂交信号进行扫描分析后，计算nm23与β-actin两者之间的光密度比值，以消除样品之间RNA上样量的误差。图1，2显示，8种细胞系不论转移潜能高低，nm23 mRNA表达强度未见明显差异。
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图1 8种癌细胞系nm23 Northern blot结果
a：nm23基因； b：β-actin内参对照
1：PC3M； 2：PC3； 3：PG； 4：PAa； 5：WM35； 6：WM451； 7：WM983a； 8：WM1341b
图2 8种癌细胞nm23与β-actin光密度比值
1：PC3M； 2：PC3； 3：PG； 4：PAa； 5：WM35； 6：WM451； 7：WM983a； 8：WM1341b
3 讨论
nm23基因是Steeg等[1]于1988年在K-1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交法分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因。它在低转移细胞株中表达强度是高转移细胞株中的10倍。之后，nm23的肿瘤转移抑制作用引起了人们的关注。人们观察了nm23在多种肿瘤组织中的转移抑制作用。现已证实乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤和胃癌等多种肿瘤的转移与nm23的低表达有关[1～3]。Leone等[4]报道nm23基因的等位丢失可能是其功能失活的原因。但有些学者的研究未能证实nm23的肿瘤转移抑制作用[5,6]，Thiede等[5]的研究在结直肠癌肝转移组织中未发现nm23-H1突变或杂合性丢失，且在正常组织和转移组织中nm23-H1 mRNA表达也无显著差异。为了进一步证实nm23的肿瘤转移抑制作用，作者观察了8种具有不同转移潜能人癌细胞中nm23基因的表达。
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PC3和PC3M为一对前列腺癌细胞系，两者均具有转移性，PC3M来自PC3的转移灶，为PC3的高转移亚系。PG为人肺巨细胞癌系，具有高转移潜能。PAa为人肺腺癌细胞系，基本无转移能力。4种人黑色素瘤细胞系WM35、WM1341b、WM983a、WM451，其转移能力逐渐升高，其中WM35无转移能力，WM451转移能力最强。8种细胞系中nm23 基因表达情况见图1。结果显示 ：8个细胞系nm23 mRNA均有表达，除PAa表达稍低外，其余细胞系nm23表达基本一致。由此可见，nm23基因可能与这些细胞系的转移抑制无关。有学者认为nm23基因的转移抑制作用具有组织特异性和时限性，其在人类肿瘤中的表达可因肿瘤发生器官不同而有差异[7]。目前对nm23的作用有3种看法：①nm23表达(mRNA或蛋白)的改变引起肿瘤转移能力相反或相应地改变，说明nm23是影响肿瘤转移的相关基因；②nm23基因结构的改变导致肿瘤转移发生而与nm23表达量无关；③nm23与肿瘤转移无关[8]。
癌转移是受多因素影响和多基因控制的。在肿瘤细胞获得侵袭、播散和转移的过程中，细胞基因改变且相互协调，瘤细胞必须表达有机组合的一系列基因产物才能完成转移过程。
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参考文献：
[1]Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastasis potential.J Natl Cancer Inst,1988,80:200
[2]Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1993,85:727
[3]Nakayama T,Ohtsuru A,Nakao K,et al.Expression in hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase,a homolog of the nm23 gene product.J Natl Cancer Inst,1992,84:1349
, http://www.100md.com
[4]Leone A,McBride OW,Weston A,et al.Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer.Cancer Res ,1991,51:2490
[5]Thiede HC,Poppe K,Kant ED，et al.Suppression and mutational analysis of nm23-H1 in liver metastases of colorectal cancer.Br J Cancer,1994,70:1 267
[6]Haut M,Steeg PS,Willson JK,et al.Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1991,83:712
, http://www.100md.com
[7]Mandai M,Konishi I,Koshiyama M,et al.Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas:Correlation with clinicopathology,EGFR,c-erbB-2,and c-erbB3 genes,and sex steroid receptor expression.Cancer Res,1994,54:1825
[8]Editorial.Nm23-A metastasis suppressor gene?J Pathol,1994,173:211
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药