苯丙氨酸对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内钙的影响*
作者：李振波 赵光胜
单位：赵光胜 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海市高血压研究所(上海 200025)；李振波 北京天坛医院内科(100050)
关键词：高血压；大鼠；苯丙氨酸；肌；平滑；血管；钙
中国病理生理杂志990601 摘 要 目的：探索苯丙氨酸对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内钙的影响。方法：将SHR和WKY的血管平滑肌细胞在不同浓度苯丙氨酸培养液中培养一定时间后，加入[45CaCl2]温育一定时间后，测定进入细胞内[45Ca2+]的量；而后将在不同浓度苯丙氨酸培养液中培养一定时间后的SHR和WKY的血管平滑肌细胞同PSS液温育，采用Fura-2/AM荧光指示剂测定不同浓度苯丙氨酸对细胞内游离Ca2+的影响。结果：苯丙氨酸浓度越高，进入SHR血管平滑肌细胞内的钙和细胞内游离钙含量越少，但对WKY无影响。结论：苯丙氨酸可以特异性地抑制Ca2+进入SHR血管平滑肌细胞和使细胞内游离Ca2+减少。
, 百拇医药
L-phenylalanine effects on intracellular calcium in
vascular smooth muscle cell of spontaneously hypertensive rat
LI Zhen-Bo, ZHAO Guang-Sheng
Ruijin Hospital,Shanghai Institute of Hypertension, Shanghai Second Medical University, Shanghai (200025)
Abstract AIM:To find the L-Phenylalanine (Phe) effects on intracellular calcium in vascular smooth muscle cell(VSMC) of spontaneously hypertensive rat (SHR) and WKY.METHODS：VSMC of SHR and WKY were incubated with phenylalanine in 7 different concentration for a period, and then added[45CaCl2] into each well and incubated for another 30 minutes. The VSMC in each well were washed and counts.min-1 of[45CaCl2] was measured. Similar to above, incubated VSMC cultured in different concentration Phe with PSS solution, and measured the intracellular free calcium concentration with Fura-2/AM. RESULTS：The higher L-phenylalanine concentration, the lesser calcium influx from the extracellular and intracellular free calcium concentration in VSMC of SHR. However, there were no variations in VSMC of WKY. CONCLUSION：Phenylalanine effect that reduces total intracellular free calcium concentration may contribute to its action in preventing blood pressure rise and the hypertrophy of vessel in SHR.
, 百拇医药
MeSH Hypertension rats; Phenylalanine; Muscle, smooth, vascular; Calcium
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的生长加速、增殖和收缩是高血压血管平滑肌的特征性表现，也是高血压发病的主要原因[1]。生长因子、激素和自体效应物质促使细胞的有丝分裂[2]。钙作为重要的细胞内信使是各种促生长因素最终发挥其促细胞增殖作用的重要环节[3]，是多种生长活性肽分子发挥其促增殖作用的共同途径。钙拮抗剂可以抑制VSMC的增生和迁移[4，5]。我们的研究曾表明，L-苯丙氨酸可以预防双亲高血压病患者子女的血管壁增厚。本研究以自发性高血压[6]大鼠(SHR)和WKY的主动脉VSMC为材料，观察苯丙氨酸对VSMC外钙内流和细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响，进一步从细胞水平探索苯丙氨酸抑制SHR的血管平滑肌细胞增生的作用机制。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.试剂：Fura-2/AM、Triton-X-100、EGTA和L-苯丙氨酸均为美国Sigma公司产品(分析纯)。PSS1液(mmol/L)：取NaCl 140、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20，依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。PSS2溶(mmol/L)：取NaCl 95、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20,依次溶于800 mL三蒸水中，以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1000 mL。MLB终止反应液(mmol/L)：MgCl2 10、LaCl3 10，Hepes 10依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。[45CaCl2]购自美国Amersham公司(3.7×1010Bq/L)。液闪计数器为Bio-Rad公司产品，荧光分光光度计为美国Beckman公司产品，8周龄SHR由上海市高血压研究所动物室提供。
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2.SHR和WKY主动脉VSMC培养和平滑肌细胞钙内流的测定：参照Campbell和Smith的方法操作[7，8]。将WKY和SHR的VSMC细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔5×104个。加入DMEM培养液，常规条件培养至呈融合状态。使细胞进入G0期，之后，加入苯丙氨酸使达到既定浓度。培养12 h。届时，吸弃培养液，每孔用1 mL PSS1冲洗两次。加入PSS2 1 mL，置培养箱平衡30 min后，加入37×103 Bq[45CaCl2](空白孔不加)后于培养箱中30 min取出，快速倾弃上述液体，将培养板迅速置于碎冰上，加入预冷的MLB液1 mL终止钙的内流。5 min后，以MLB液将每孔清洗两次。以0.2%胰蛋白酶消化细胞，弃消化液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液，使细胞充分分散并计数每一孔的细胞总数，将细胞收集于0.22 μm的醋酸纤维滤膜上，1 mL PBS洗膜3次，6%(W/V)三氯醋酸1 mL冲洗3次，无水乙醇1 mL冲洗3次，80℃烘干2 h。置于液闪瓶中，加入0.5% PPO二甲苯溶液6 mL，盖紧瓶盖，放置过夜，测CPM(counts.min-1)值。
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3.SHR和WKY主动脉VSMC内游离钙的测定：参照Grynkie的方法操作[9]。如上将与苯丙氨酸温育12 h的VSMC取出，弃培养液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液洗涤6次。之后，加入含钙(1 mmol/L)的PSS2作为温育液，同时加入5 mmol/L的Fura-2/AM使终浓度为5 μmol/L,30 min后取出弃液，以0.2%胰蛋白酶消化细胞。激发光栅10 nm，发射光栅16 nm，发射光波长500 nm，激发光波长在340 nm处时说明Fura-2/AM进入细胞并由其分解出的Fura-2与Ca2+结合，固定激发波长于340 nm分别测定细胞在基础状态下和不同浓度苯丙氨酸作用后细胞的荧光强度，最后加入0.1% Triton-X-100测Fmax和 3 mmol/L的EGTA测Fmin,根据公式计算细胞内游离钙浓度。
[Ca2+]i=KD(F-Fmin)/(Fmax-F)。
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结果
1.苯丙氨酸可以抑制细胞外钙进入SHR的VSMC内的量，且与苯丙氨酸浓度呈反相关。而对WKY的VSMC无影响，如图1。
Fig 1 Effect of phenylalanine (Phe) on cellular calcium
influx from the extracellular in VSMC of SHR
图1 苯丙氨酸对SHR的VSMC的细胞外钙内流的影响
2.苯丙氨酸可以减少细胞内游离钙的总量，随苯丙氨酸浓度的增大，细胞内[Ca2+]i减少；而对WKY的VSMC无影响，如图2。
, 百拇医药
Fig 2 Effect of phenylalanine (phe)on intracellular free
calcium ion concentration ([Ca2+]i) in VSMC of SHR
图2 苯丙氨酸对SHR的VSMC的细胞内游离钙浓度的影响
讨论
细胞内钙浓度增高可促使血管平滑肌增殖与肥大，使血管壁增厚，外周阻力增加，这是高血压发病的重要病理学基础。因此，减少细胞内钙浓度是阻止细胞增殖与肥大的重要环节[3]。血管平滑肌内的线粒体少，肌浆网欠发达，肌膜的贮钙量少。因此，细胞膜外钙的内流与肌浆网钙的释放是决定细胞内钙浓度的重要因素。各类钙拮抗剂阻止VSMC增殖肥大的实验研究已多有报道。牛磺酸对钙的代谢有重要的调节作用[10]，但有关苯丙氨酸对细胞外钙内流的影响未见报道。本实验结果表明：苯丙氨酸可以减少细胞外[45Ca2+]的内流。但只有胞内游离钙方具有生理调节作用。为此，进一步采用Fura-2/AM荧光指示剂测定苯丙氨酸对VSMC[Ca2+]i的影响，结果表明苯丙氨酸不但可以减少细胞外钙内流，而且可降低VSMC的[Ca2+]i。但[Ca2+]i是细胞外钙内流、肌浆网钙的释放和细胞内钙外流共同平衡调节的结果，苯丙氨酸是否可以促进VSMC的钙外流尚待进一步研究。
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*国家自然科学基金资助(No.39470626)
参考文献
1 Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Replication of smooth muscle cells in vascular disease. Circ Res, 1986,58:427.
2 Berridge MJ. Inositolphosphate and calcium signalling. Nature, 1993,361:315.
3 Orlov S, Resink TJ, Ernhardt J, et al. Vascular smooth muscle cell calcium fluxes: Regulation by angiotensin Ⅱ and lipoproteins. Hypertension, 1993,21:195.
, http://www.100md.com
4 Hoberg E, Schwartz F, Schomig A, et al. Prevention of restenosis by verapamil. The verapamil angioplasty study. Circulation, 1990,82(suppl Ⅲ):428.
5 Unverdoben M, Kunkel B, Leucht M, et al. Reduction of restenosis after PTCA by diltiazem? Circulation, 1992,86(Suppl Ⅰ):53.
6 赵光胜，邱慧丽，范明昌，等.苯丙氨酸对高血压病后代的遗传性心脏改变的作用.中华医学杂志，1997，77：58.
7 Campbell JH, Campbell GR. Culture techniques and their applications to study of VSMC. Clin Sci, 1993,85:501.
, 百拇医药
8 Smith JB, Smith L, Brown ER, et al. Angiotenin Ⅱ rapidly increase posphatidate-phosphoinositide synthesis and phosphoinositide hydrolysis and mobilizes intracellular calcium in cultured arterial muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1984,81:7812.
9 Grynkie Wicoz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicator with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 1985,260:3440.
10 Kruse HJ, Bauriedel G, Heimerl, et al, Role of L-type calcium channels on stimulated calcium influx and on proliferition activity of human coronary smooth muscle cells. J Cardiovasc Pharmacol, 1994,24:32835.
(1998年6月1日收稿，1999年1月11日修回), http://www.100md.com
单位：赵光胜 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海市高血压研究所(上海 200025)；李振波 北京天坛医院内科(100050)
关键词：高血压；大鼠；苯丙氨酸；肌；平滑；血管；钙
中国病理生理杂志990601 摘 要 目的：探索苯丙氨酸对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内钙的影响。方法：将SHR和WKY的血管平滑肌细胞在不同浓度苯丙氨酸培养液中培养一定时间后，加入[45CaCl2]温育一定时间后，测定进入细胞内[45Ca2+]的量；而后将在不同浓度苯丙氨酸培养液中培养一定时间后的SHR和WKY的血管平滑肌细胞同PSS液温育，采用Fura-2/AM荧光指示剂测定不同浓度苯丙氨酸对细胞内游离Ca2+的影响。结果：苯丙氨酸浓度越高，进入SHR血管平滑肌细胞内的钙和细胞内游离钙含量越少，但对WKY无影响。结论：苯丙氨酸可以特异性地抑制Ca2+进入SHR血管平滑肌细胞和使细胞内游离Ca2+减少。
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L-phenylalanine effects on intracellular calcium in
vascular smooth muscle cell of spontaneously hypertensive rat
LI Zhen-Bo, ZHAO Guang-Sheng
Ruijin Hospital,Shanghai Institute of Hypertension, Shanghai Second Medical University, Shanghai (200025)
Abstract AIM:To find the L-Phenylalanine (Phe) effects on intracellular calcium in vascular smooth muscle cell(VSMC) of spontaneously hypertensive rat (SHR) and WKY.METHODS：VSMC of SHR and WKY were incubated with phenylalanine in 7 different concentration for a period, and then added[45CaCl2] into each well and incubated for another 30 minutes. The VSMC in each well were washed and counts.min-1 of[45CaCl2] was measured. Similar to above, incubated VSMC cultured in different concentration Phe with PSS solution, and measured the intracellular free calcium concentration with Fura-2/AM. RESULTS：The higher L-phenylalanine concentration, the lesser calcium influx from the extracellular and intracellular free calcium concentration in VSMC of SHR. However, there were no variations in VSMC of WKY. CONCLUSION：Phenylalanine effect that reduces total intracellular free calcium concentration may contribute to its action in preventing blood pressure rise and the hypertrophy of vessel in SHR.
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MeSH Hypertension rats; Phenylalanine; Muscle, smooth, vascular; Calcium
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的生长加速、增殖和收缩是高血压血管平滑肌的特征性表现，也是高血压发病的主要原因[1]。生长因子、激素和自体效应物质促使细胞的有丝分裂[2]。钙作为重要的细胞内信使是各种促生长因素最终发挥其促细胞增殖作用的重要环节[3]，是多种生长活性肽分子发挥其促增殖作用的共同途径。钙拮抗剂可以抑制VSMC的增生和迁移[4，5]。我们的研究曾表明，L-苯丙氨酸可以预防双亲高血压病患者子女的血管壁增厚。本研究以自发性高血压[6]大鼠(SHR)和WKY的主动脉VSMC为材料，观察苯丙氨酸对VSMC外钙内流和细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响，进一步从细胞水平探索苯丙氨酸抑制SHR的血管平滑肌细胞增生的作用机制。
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材料与方法
1.试剂：Fura-2/AM、Triton-X-100、EGTA和L-苯丙氨酸均为美国Sigma公司产品(分析纯)。PSS1液(mmol/L)：取NaCl 140、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20，依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。PSS2溶(mmol/L)：取NaCl 95、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20,依次溶于800 mL三蒸水中，以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1000 mL。MLB终止反应液(mmol/L)：MgCl2 10、LaCl3 10，Hepes 10依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。[45CaCl2]购自美国Amersham公司(3.7×1010Bq/L)。液闪计数器为Bio-Rad公司产品，荧光分光光度计为美国Beckman公司产品，8周龄SHR由上海市高血压研究所动物室提供。
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2.SHR和WKY主动脉VSMC培养和平滑肌细胞钙内流的测定：参照Campbell和Smith的方法操作[7，8]。将WKY和SHR的VSMC细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔5×104个。加入DMEM培养液，常规条件培养至呈融合状态。使细胞进入G0期，之后，加入苯丙氨酸使达到既定浓度。培养12 h。届时，吸弃培养液，每孔用1 mL PSS1冲洗两次。加入PSS2 1 mL，置培养箱平衡30 min后，加入37×103 Bq[45CaCl2](空白孔不加)后于培养箱中30 min取出，快速倾弃上述液体，将培养板迅速置于碎冰上，加入预冷的MLB液1 mL终止钙的内流。5 min后，以MLB液将每孔清洗两次。以0.2%胰蛋白酶消化细胞，弃消化液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液，使细胞充分分散并计数每一孔的细胞总数，将细胞收集于0.22 μm的醋酸纤维滤膜上，1 mL PBS洗膜3次，6%(W/V)三氯醋酸1 mL冲洗3次，无水乙醇1 mL冲洗3次，80℃烘干2 h。置于液闪瓶中，加入0.5% PPO二甲苯溶液6 mL，盖紧瓶盖，放置过夜，测CPM(counts.min-1)值。
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3.SHR和WKY主动脉VSMC内游离钙的测定：参照Grynkie的方法操作[9]。如上将与苯丙氨酸温育12 h的VSMC取出，弃培养液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液洗涤6次。之后，加入含钙(1 mmol/L)的PSS2作为温育液，同时加入5 mmol/L的Fura-2/AM使终浓度为5 μmol/L,30 min后取出弃液，以0.2%胰蛋白酶消化细胞。激发光栅10 nm，发射光栅16 nm，发射光波长500 nm，激发光波长在340 nm处时说明Fura-2/AM进入细胞并由其分解出的Fura-2与Ca2+结合，固定激发波长于340 nm分别测定细胞在基础状态下和不同浓度苯丙氨酸作用后细胞的荧光强度，最后加入0.1% Triton-X-100测Fmax和 3 mmol/L的EGTA测Fmin,根据公式计算细胞内游离钙浓度。
[Ca2+]i=KD(F-Fmin)/(Fmax-F)。
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结果
1.苯丙氨酸可以抑制细胞外钙进入SHR的VSMC内的量，且与苯丙氨酸浓度呈反相关。而对WKY的VSMC无影响，如图1。
Fig 1 Effect of phenylalanine (Phe) on cellular calcium
influx from the extracellular in VSMC of SHR
图1 苯丙氨酸对SHR的VSMC的细胞外钙内流的影响
2.苯丙氨酸可以减少细胞内游离钙的总量，随苯丙氨酸浓度的增大，细胞内[Ca2+]i减少；而对WKY的VSMC无影响，如图2。
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Fig 2 Effect of phenylalanine (phe)on intracellular free
calcium ion concentration ([Ca2+]i) in VSMC of SHR
图2 苯丙氨酸对SHR的VSMC的细胞内游离钙浓度的影响
讨论
细胞内钙浓度增高可促使血管平滑肌增殖与肥大，使血管壁增厚，外周阻力增加，这是高血压发病的重要病理学基础。因此，减少细胞内钙浓度是阻止细胞增殖与肥大的重要环节[3]。血管平滑肌内的线粒体少，肌浆网欠发达，肌膜的贮钙量少。因此，细胞膜外钙的内流与肌浆网钙的释放是决定细胞内钙浓度的重要因素。各类钙拮抗剂阻止VSMC增殖肥大的实验研究已多有报道。牛磺酸对钙的代谢有重要的调节作用[10]，但有关苯丙氨酸对细胞外钙内流的影响未见报道。本实验结果表明：苯丙氨酸可以减少细胞外[45Ca2+]的内流。但只有胞内游离钙方具有生理调节作用。为此，进一步采用Fura-2/AM荧光指示剂测定苯丙氨酸对VSMC[Ca2+]i的影响，结果表明苯丙氨酸不但可以减少细胞外钙内流，而且可降低VSMC的[Ca2+]i。但[Ca2+]i是细胞外钙内流、肌浆网钙的释放和细胞内钙外流共同平衡调节的结果，苯丙氨酸是否可以促进VSMC的钙外流尚待进一步研究。
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*国家自然科学基金资助(No.39470626)
参考文献
1 Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Replication of smooth muscle cells in vascular disease. Circ Res, 1986,58:427.
2 Berridge MJ. Inositolphosphate and calcium signalling. Nature, 1993,361:315.
3 Orlov S, Resink TJ, Ernhardt J, et al. Vascular smooth muscle cell calcium fluxes: Regulation by angiotensin Ⅱ and lipoproteins. Hypertension, 1993,21:195.
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4 Hoberg E, Schwartz F, Schomig A, et al. Prevention of restenosis by verapamil. The verapamil angioplasty study. Circulation, 1990,82(suppl Ⅲ):428.
5 Unverdoben M, Kunkel B, Leucht M, et al. Reduction of restenosis after PTCA by diltiazem? Circulation, 1992,86(Suppl Ⅰ):53.
6 赵光胜，邱慧丽，范明昌，等.苯丙氨酸对高血压病后代的遗传性心脏改变的作用.中华医学杂志，1997，77：58.
7 Campbell JH, Campbell GR. Culture techniques and their applications to study of VSMC. Clin Sci, 1993,85:501.
, 百拇医药
8 Smith JB, Smith L, Brown ER, et al. Angiotenin Ⅱ rapidly increase posphatidate-phosphoinositide synthesis and phosphoinositide hydrolysis and mobilizes intracellular calcium in cultured arterial muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1984,81:7812.
9 Grynkie Wicoz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicator with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 1985,260:3440.
10 Kruse HJ, Bauriedel G, Heimerl, et al, Role of L-type calcium channels on stimulated calcium influx and on proliferition activity of human coronary smooth muscle cells. J Cardiovasc Pharmacol, 1994,24:32835.
(1998年6月1日收稿，1999年1月11日修回), http://www.100md.com