表皮生长因子对培养的兔角膜上皮细胞的影响
作者：赵旭 刘丹 田钟绣
单位：赵旭(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)；刘丹(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)；田钟绣(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)
关键词：表皮生长因子；细胞培养；角膜上皮细胞
中国医科大学学报000127 摘要 目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对兔角膜上皮细胞的影响，观察活体细胞生长状况和细胞内超微结构的变化。方法：兔角膜上皮体外培养技术及组织学检查方法。结果：接种后240 h角膜上皮细胞总数实验组(培养液中加EGF)为(8.96±0.56)×105，对照组为(7.44±0.64)×105，二者差异显著，P<0.01。结论：EGF对角膜上皮细胞有显著的促进增殖的作用。
, 百拇医药
The Effect of Epidermal Growth Factor on Cultured Rabbit Corneal Epithelium
Zhao Xu Liu Dan Tian Zhongxiu
(Department of Ophthalmology,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to observe the effect of epidermal growth factor(EGF) on cultured corneal epithelial cells of rabbit.Methods:Twenty New Zealand rabbits were used.The EGF was performed on 20 corneals’ epithelial culture,the other 20 were controls.The numbers of cells in different periods were measured and histological examination was performed.Results:In the experimental group,epithelial cells proliferated faster than those in the control.Conclusion:EGF can promote the proliferation of corneal epithelium.
, 百拇医药
KEY WORDS epidermal growth factor; cell culture; corneal epithelium
角膜上皮的完整性是维持正常视功能的先决条件。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种能促进细胞分裂的生物活性物质，具有刺激上皮细胞增生、加快愈合的作用，由于EGF是由正常细胞分泌，既无免疫反应，也无药物的毒副作用[1]。泪液和房水中均含有EGF，在正常情况下或角膜损伤修复愈合过程中，EGF可能是维持角膜上皮完整性的必要因素[2～4]。对一些角膜疾病EGF可能成为一种有效的治疗方法。本实验应用国产hEGF观察其对角膜上皮细胞生长的影响，为EGF的临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 EGF由本校免疫化学教研室提供，浓度为400 μg/ml液体。DMEM培养液，含青霉毒100 u/ml，链霉素100 μg/ml，10%小牛血清。
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1.2 方法
1.2.1 实验动物及分组：6～8个月新西兰大白兔20只，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限。将每只兔的两眼随机分为实验组和对照组。实验组在DMEM培养液中加EGF，对照组为常规DMEM培养。
1.2.2 兔角膜上皮细胞的采集及培养：无菌操作下摘取 兔双眼 球，以0.25% Chloromycation冲洗3次，浸泡于含庆大(1000 u/ml)、二性霉素B(50 μg/ml)的生理盐水中15～20 min后，在手术显微镜下用圆刃刀片刮取角膜上皮团块，用眼科显微剪子剪碎，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，4℃消化14～16 h，然后吸出胰蛋白酶溶液，用Hanks溶液冲洗3次后，加入含10%小牛血清的DMEM培养液2 ml轻轻吹打，使其细胞均匀分散后，取出0.5 ml行细胞计数，余液按每孔1.5 ml细胞悬浮液分别接种在12孔中，于37℃二氧化碳孵箱内培养。实验组加入400 μg/ml hEGF 0.2 ml/孔。每3 d更换一次培养液。
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1.2.3 观察指标及判定方法：
细胞计数：接种前测定悬浮细胞液的细胞密度，上皮细胞培养24、96、168、240 h时，取实验组和对照组各1孔，倒掉培养液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化游离细胞，测定各孔细胞总数，计算各时段内细胞增殖数。组织学观察：接种后24 h，将培养板直接放在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖情况。电镜观察：2.5%戊二醛固定细胞后，透射电镜观察细胞的超微结构。统计学分析采用t检验。
2 结果
2.1 接种后24 h，实验组与对照组细胞数较接种时减少，主要是因不具有活性的细胞未贴壁生长呈悬浮状态，两者细胞数改变未见差异(P>0.05)；接种后24～240 h，各记录时段的细胞增殖数均大于对照组，P<0.01，差异显著(P<0.01)。hEGF对角膜上皮细胞增殖均有明显促进作用(表1)。
表1 角膜上皮细胞数比较(
±s，×105/cm2)
, 百拇医药
Table 1 Comparison of the corneal epithelial cell numbers，×105/cm2) 时间(h)
实验组(n=20)
对照组(n=20)
t
P
接种时
1.93±0.32
1.98±0.21
0.86
>0.05
, http://www.100md.com
24
1.72±0.04
1.70±0.02
0.68
>0.05
96
3.56±0.32
2.73±0.26
3.47
<0.01
168
5.43±0.34
, http://www.100md.com 4.53±0.32
5.26
<0.01
240
8.96±0.56
7.44±0.64
5.78
<0.01
3 讨论
EGF最初是由Cohen和Montalcin于1960年从小鼠颌下腺纯化神经生长因子时发现。以后的研究证实，EGF是一种很强的促细胞分裂因子，可刺激多种细胞在体内和体外增殖，已在角膜上皮、晶体等眼组织中发现。本实验利用体外细胞培养技术观察hEGF对角膜上皮细胞增殖的促进作用。
, http://www.100md.com
角膜上皮细胞原代培养的关键是把握恰当的消化条件。本实验证明角膜上皮以0.25%胰蛋白酶4℃消化14～16 h效果最佳。hEGF浓度采用促进上皮增生最适宜浓度50 μg/ml[5]。
本研究结果显示EGF促进角膜上皮细胞的增殖。其作用机理是EGF与角膜上皮细胞表面的EGF受体结合，形成EGF受体复合体，促进角膜上皮细胞摄入DNA、RNA和标志蛋白前体，促进细胞的有丝分裂，使细胞数量增加[6]。
在倒置相差显微镜下实验组与对照组在形态学上未见差异，只是在细胞数量上实验组多于对照组。结合透射电镜结果，实验组与对照组相比，细胞内粗面内质网、核糖体和糖原颗粒均有明显增加，线粒体发育良好，细胞核大且形态不整，说明细胞增生活跃，进一步证实了EGF有促进角膜上皮有丝分裂，增加细胞数量的作用。本实验证明EGF对角膜上皮细胞确有促进生长的作用，为EGF应用于角膜疾病的治疗提供了实验依据。
, 百拇医药
参考文献
1，蔡良琬.生长因子的研究进展与临床应用.基础医学与临床，1991，36(7)：488～495
2，Ohashi Y.，Presence of epidermal growth factor in tears.Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:1879-1882
3，Joseph J,Margery N, Jay SP, et al. Epidermal growth factor in human aqueous humor. Am J Ophthalmol,1990,109(15):603
4，Kitazawa T,Kinoshita S,Fujita K,et al.The mechanism of accelerated corneal epithelial healing by human epidermal growth factor.IOVS,1990,31(9):1773-1778
, http://www.100md.com
5，Sheardown H,Wedge C,Chou L, et al.，Continuous epidermal growth factor delivery in corneal epithelial wound healing.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:3593-3601
6，Brightwell JR. Biosynthetic human EGF accelerates heal of neodecadron treated primatic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci,1985,26:105-111
1999-05-19收稿, 百拇医药
单位：赵旭(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)；刘丹(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)；田钟绣(中国医科大学第一临床学院眼科，沈阳 110001)
关键词：表皮生长因子；细胞培养；角膜上皮细胞
中国医科大学学报000127 摘要 目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对兔角膜上皮细胞的影响，观察活体细胞生长状况和细胞内超微结构的变化。方法：兔角膜上皮体外培养技术及组织学检查方法。结果：接种后240 h角膜上皮细胞总数实验组(培养液中加EGF)为(8.96±0.56)×105，对照组为(7.44±0.64)×105，二者差异显著，P<0.01。结论：EGF对角膜上皮细胞有显著的促进增殖的作用。
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The Effect of Epidermal Growth Factor on Cultured Rabbit Corneal Epithelium
Zhao Xu Liu Dan Tian Zhongxiu
(Department of Ophthalmology,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to observe the effect of epidermal growth factor(EGF) on cultured corneal epithelial cells of rabbit.Methods:Twenty New Zealand rabbits were used.The EGF was performed on 20 corneals’ epithelial culture,the other 20 were controls.The numbers of cells in different periods were measured and histological examination was performed.Results:In the experimental group,epithelial cells proliferated faster than those in the control.Conclusion:EGF can promote the proliferation of corneal epithelium.
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KEY WORDS epidermal growth factor; cell culture; corneal epithelium
角膜上皮的完整性是维持正常视功能的先决条件。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种能促进细胞分裂的生物活性物质，具有刺激上皮细胞增生、加快愈合的作用，由于EGF是由正常细胞分泌，既无免疫反应，也无药物的毒副作用[1]。泪液和房水中均含有EGF，在正常情况下或角膜损伤修复愈合过程中，EGF可能是维持角膜上皮完整性的必要因素[2～4]。对一些角膜疾病EGF可能成为一种有效的治疗方法。本实验应用国产hEGF观察其对角膜上皮细胞生长的影响，为EGF的临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 EGF由本校免疫化学教研室提供，浓度为400 μg/ml液体。DMEM培养液，含青霉毒100 u/ml，链霉素100 μg/ml，10%小牛血清。
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1.2 方法
1.2.1 实验动物及分组：6～8个月新西兰大白兔20只，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限。将每只兔的两眼随机分为实验组和对照组。实验组在DMEM培养液中加EGF，对照组为常规DMEM培养。
1.2.2 兔角膜上皮细胞的采集及培养：无菌操作下摘取 兔双眼 球，以0.25% Chloromycation冲洗3次，浸泡于含庆大(1000 u/ml)、二性霉素B(50 μg/ml)的生理盐水中15～20 min后，在手术显微镜下用圆刃刀片刮取角膜上皮团块，用眼科显微剪子剪碎，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，4℃消化14～16 h，然后吸出胰蛋白酶溶液，用Hanks溶液冲洗3次后，加入含10%小牛血清的DMEM培养液2 ml轻轻吹打，使其细胞均匀分散后，取出0.5 ml行细胞计数，余液按每孔1.5 ml细胞悬浮液分别接种在12孔中，于37℃二氧化碳孵箱内培养。实验组加入400 μg/ml hEGF 0.2 ml/孔。每3 d更换一次培养液。
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1.2.3 观察指标及判定方法：
细胞计数：接种前测定悬浮细胞液的细胞密度，上皮细胞培养24、96、168、240 h时，取实验组和对照组各1孔，倒掉培养液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化游离细胞，测定各孔细胞总数，计算各时段内细胞增殖数。组织学观察：接种后24 h，将培养板直接放在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖情况。电镜观察：2.5%戊二醛固定细胞后，透射电镜观察细胞的超微结构。统计学分析采用t检验。
2 结果
2.1 接种后24 h，实验组与对照组细胞数较接种时减少，主要是因不具有活性的细胞未贴壁生长呈悬浮状态，两者细胞数改变未见差异(P>0.05)；接种后24～240 h，各记录时段的细胞增殖数均大于对照组，P<0.01，差异显著(P<0.01)。hEGF对角膜上皮细胞增殖均有明显促进作用(表1)。
表1 角膜上皮细胞数比较(
±s，×105/cm2), 百拇医药
Table 1 Comparison of the corneal epithelial cell numbers，×105/cm2) 时间(h)
实验组(n=20)
对照组(n=20)
t
P
接种时
1.93±0.32
1.98±0.21
0.86
>0.05
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24
1.72±0.04
1.70±0.02
0.68
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3.56±0.32
2.73±0.26
3.47
<0.01
168
5.43±0.34
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5.26
<0.01
240
8.96±0.56
7.44±0.64
5.78
<0.01
3 讨论
EGF最初是由Cohen和Montalcin于1960年从小鼠颌下腺纯化神经生长因子时发现。以后的研究证实，EGF是一种很强的促细胞分裂因子，可刺激多种细胞在体内和体外增殖，已在角膜上皮、晶体等眼组织中发现。本实验利用体外细胞培养技术观察hEGF对角膜上皮细胞增殖的促进作用。
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角膜上皮细胞原代培养的关键是把握恰当的消化条件。本实验证明角膜上皮以0.25%胰蛋白酶4℃消化14～16 h效果最佳。hEGF浓度采用促进上皮增生最适宜浓度50 μg/ml[5]。
本研究结果显示EGF促进角膜上皮细胞的增殖。其作用机理是EGF与角膜上皮细胞表面的EGF受体结合，形成EGF受体复合体，促进角膜上皮细胞摄入DNA、RNA和标志蛋白前体，促进细胞的有丝分裂，使细胞数量增加[6]。
在倒置相差显微镜下实验组与对照组在形态学上未见差异，只是在细胞数量上实验组多于对照组。结合透射电镜结果，实验组与对照组相比，细胞内粗面内质网、核糖体和糖原颗粒均有明显增加，线粒体发育良好，细胞核大且形态不整，说明细胞增生活跃，进一步证实了EGF有促进角膜上皮有丝分裂，增加细胞数量的作用。本实验证明EGF对角膜上皮细胞确有促进生长的作用，为EGF应用于角膜疾病的治疗提供了实验依据。
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参考文献
1，蔡良琬.生长因子的研究进展与临床应用.基础医学与临床，1991，36(7)：488～495
2，Ohashi Y.，Presence of epidermal growth factor in tears.Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:1879-1882
3，Joseph J,Margery N, Jay SP, et al. Epidermal growth factor in human aqueous humor. Am J Ophthalmol,1990,109(15):603
4，Kitazawa T,Kinoshita S,Fujita K,et al.The mechanism of accelerated corneal epithelial healing by human epidermal growth factor.IOVS,1990,31(9):1773-1778
, http://www.100md.com
5，Sheardown H,Wedge C,Chou L, et al.，Continuous epidermal growth factor delivery in corneal epithelial wound healing.Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:3593-3601
6，Brightwell JR. Biosynthetic human EGF accelerates heal of neodecadron treated primatic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci,1985,26:105-111
1999-05-19收稿, 百拇医药