白细胞介素-6对人脐静脉内皮细胞前列环素合成的影响
作者：田文 胡健
单位：田文(中国医科大学第一临床学院循环内科,沈阳 110001)；胡健(中国医科大学第一临床学院循环内科,沈阳 110001)
关键词：白细胞介素-6；人脐静脉内皮细胞；前列环素
中国医科大学学报000325 摘要 目的：探讨白细胞介素-6 (IL-6)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 合成前列环素( PGI2)的影响以及钙拮抗剂、糖皮质激素对 IL- 6的作用的影响。方法：采用培养的原代人脐静脉内皮细胞为实验对象，用放免法测定细胞培养液中的6-ketoPGF1α。结果：IL-6组内皮细胞合成的6-ketoPGF1α的量较对照组显著减少，对照组为(620.4±34.1)pg/ml，而IL-6组(50 u/ml、100 u/ml)分别为(503.2±23.6)、(470.3±23.6)pg/ml(P<0.05)；钙拮抗剂可以拮抗IL-6的上述效应与IL-6组比较，P<0.05，而地塞米松无此作用。结论：IL-6能抑制内皮细胞合成分泌 PGI2，此作用可能是通过钙离子作为第二信使而实现的。
, http://www.100md.com
Effect of Interleukin-6 on Prosglandin I2 Synthesis in Human
Umbilical Vessel Endothelial Cells
Tian Wen Hu Jian
(Department of Cardiology, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to determine the effect of interleukin-6 (IL-6) on the synthesis of PGI2 in endothelial cells and the influence of calcium antagonist-Nicardipine on the effect of IL-6.Methods: We put IL-6, monoclonal antibody of IL-6, and Nicardipine on cultured human umbilical veins endothelial cells(HUVEC) and then measured the concentration of PGI2 in cultural fluid by radioimmunoassay.Results: The concentration of PGI2 in IL-6 (50u/ml,100 u/ml) group was significantly lower than that of control [(503.2±23.6) pg/ml, (470.3±23.6) pg/ml, and (620.4±34.1) pg/ml ,P<0.05)]. That of IL-6 plus antibody or Nicardipine group were recovered to (470.3±20.3)pg/ml, (591.7±27.9)pg/ml, and (548.9±20.9) pg/ml respectively (P<0.05) .Conclusion:IL-6 inhibited PGI2 synthesis in HUVEC, monoclonal-antibody of IL-6 and Nicardipine blocked this effect of IL-6 and calcium might be the second messenger in this process .
, 百拇医药
KEY WORDS interleukin 6; human umbilical vessel endothelial cell; prosglandin I2
白细胞介素- 6(IL-6)是一种重要的细胞因子，它可由多种细胞产生，并作用于多种细胞而产生广泛的生物学效应。 IL-6可以刺激细胞的分化，促进肝细胞合成急性期蛋白及多能干细胞增殖分化、加快巨核细胞成熟等。因此在血液、肿瘤、炎症尤其是急性期反应过程中起着极为重要的作用。国外研究还发现，动脉粥样斑块中可见有 IL-6基因表达[1]，提示IL-6在动脉粥样硬化过程中具有促进作用。PGI2由血管内皮细胞合成分泌，是一种十分重要的血管活性物质，炎症、休克、动脉粥样硬化、心肌梗死等病理过程都与前列环素和血栓素 A2(TXA2) 的平衡失调密切相关，而 IL -6也参与了这些过程，但关于 IL-6和PGI2之间的关系，尚少见报道。本实验以原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象，观察IL-6对 PGI2合成的影响，并了解其可能机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
DMEM细胞培养基(SIGMA)，胰蛋白酶(GIBCO)，人重组 IL-6及IL-6单克隆抗体(中国军事医学科学院)，尼卡地平针剂由日本山之内制药提供， 6- keto PGF1α试剂盒(解放军总医院)，其余试剂均为分析纯或优级纯。
1.2 方法
1.2.1 原代人脐静脉内皮细胞培养及鉴定：
脐带取自沈阳市妇婴医院，保存于PBS液中。分离静脉内皮细胞采用Jaffe法[2](略作改进，以胰蛋白酶代替胶原酶)。将消化液离心(1 000r/min,10 min)弃上清后，加入内皮细胞培养基DMEM 13.5 g/L，20%小牛血清，青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，pH7.2吹打成细胞悬液，计数后接种于24孔平底培养板 (Falcon)约每孔105个内皮细胞。于 37℃，5%CO2孵箱孵育， 24 h后换液，以后每2～3 d换液1次。4～5 d后，细胞可达融合。相差显微镜下观察，内皮细胞呈梭形及多角形，融合成单层，呈铺路石样外观，无重叠生长。免疫细胞化学染色Ⅷ因子相关抗原呈阳性，胞浆内可见棕黄色颗粒。
, 百拇医药
1.2.2 PGI2的测定：
内皮细胞接种后以20%小牛血清DMEM培养48 h，换用无血清培养基培养24 h ,使HUVEC处于静止期,然后分6组，每组4孔，分别加入实验因素：空白对照；IL-6 50 u/ml、100u/ml；IL-6100 u/ml+单克隆抗体；IL-6 100 u/ml+尼卡地平2×10-5 mol/l；IL-6 100 u/ml+地塞米松2×10-4 mol/L，(以上均为终浓度)。24 h后终止培养，分别收集上清于-30℃冷冻待测PGI2。PGI2的半衰期极短，其代谢产物为6-ketoPGF1α较为稳定。通过非平衡放免法检测其含量可以反映PGI2的水平[3]。具体操作步骤按说明书。
1.3 统计分析
, 百拇医药
全部结果用均值±标准差表示，多组间均数两两比较用q检验。
2 结果
2.1 IL-6对HUVEC合成分泌PGI2的影响
IL-6在50 u/ml时即可以使HUVEC合成PGI2的量明显减少 (503.2±23.6) pg/ml，与对照组(620.4±34.1)pg/ml比较P<0.05，在浓度为100 u/ml时，PGI2的合成进一步减少(470.3±20.3) pg/ml，但与50u/ml组比较无统计学差异。而加入IL-6单克隆抗体组中的PGI2合成有所恢复(591.7±27.9) pg/ml，与IL-6组(100 u/ml)比较P<0.05，与对照组比较无显著差异。
2.2 尼卡地平和地塞米松对IL-6抑制 PGI2合成作用的影响
, 百拇医药
尼卡地平能够对抗 IL-6抑制 PGI2合成的作用，该组内皮细胞合成的PGI2 (548.9±20.9) pg/ml与IL-6组比较，合成明显增多，P<0.05。与对照组比较无显著差异。而地塞米松组的 PGI2(494.8±20.8) pg/ml与单纯IL-6组比较无显著差异,地塞米松对IL-6的作用未显示出任何影响。
3 讨论
IL-6是一种多功能的细胞因子，在炎症尤其是急性期反应过程中起着极为重要的作用。Maruo等人在实验中发现， IL-6能够抑制体外培养的牛血管内皮细胞合成 PGI2，其机制为IL-6能够抑制花生四烯酸(AA)转化成 PGI2所需的关键酶—环加氧酶的活性，从而使 PGI2的合成减少[4]。本实验所得结果与Maruo 的结论相一致，且本实验以原代培养的人血管内皮细胞为实验对象，以期最大程度上与人的在体血管内皮细胞的生物学性状相近，从而对临床更有意义。实验中还发现，钙离子拮抗剂——尼卡地平能够拮抗IL-6对血管内皮细胞合成PGI2的抑制作用，这一结果提示IL-6作用于血管内皮细胞的信号传导可能是通过钙离子作为第二信使来实现的。糖皮质激素在抗炎、抗休克以及免疫抑制方面具有强大的作用，其主要作用机制是抑制磷脂酶A2，从而减少AA的释放，进一步使前列腺素(PGS)和白细胞三烯(LTS)等炎症介质生成减少，同时它还有拮抗IL-1、IL-6等细胞因子的作用。我们在另外的实验中发现，地塞米松能够拮抗IL-6所引起的促内皮细胞增殖和一氧化氮合成减少。但本实验发现地塞米松对IL-6抑制PGI2合成方面既无协同作用，也无拮抗作用。
, 百拇医药
PGI2与 TXA2是一对作用相反相互制衡的血管活性物质。PGI2能够抑制血小板聚集、附壁及血栓形成，促进血管松弛，还能抑制血管平滑肌细胞增殖[5]。当机体 IL-6水平增高时(如感染、应激、发热、损伤等)，可以通过抑制 PGI2的合成来破坏血管壁舒缩及生长状态的平衡，促进血小板聚集、血栓形成进一步损伤内皮，促使炎症、休克、动脉粥样硬化等病理过程恶化。理论上讲，钙离子通道阻断剂能够拮抗IL-6的这种作用，因此可能会对上述疾病的防治有一定的积极意义，但尚需进一步研究证实。
参考文献
1，Ikeda U, Ikeda M, Seino Y, et al. Interleukin-6 genetranscripts are expressed in atherosclerosis lesions of genetically hyperlipidemic rabbit. Atherosclerosis, 1992，92:213—218
, 百拇医药
2，Jaffe EA, Nachman RL, Baker CG, et al. Culture of human endothelial cell derived from umbilical veins. J Clin Invest, 1973， 52: 2745—2749
3，汪钟，杨梅芳，高华，等.血栓素6-ketoPGF1a[125 I]放免分析及初步应用.生理科学,1988， 8：180～182
4，Maruo N，Morita I, Ishizaki, et al. Inhibitory effect of interleukin-6 on prostaglandin I2 production in cultured bovine vascular endothelial cell. Archives Biochem Biophys ,1992， 292:600—604
5，Nilsson J,Ollson AG. Prosglandin I2 inhibits DNA synthesis in arterial smooth muscle cells stimulated with platelet -derived growth factor. Atherosclerosis, 1984，53: 77—84
收稿日期：1999-09-06, http://www.100md.com
单位：田文(中国医科大学第一临床学院循环内科,沈阳 110001)；胡健(中国医科大学第一临床学院循环内科,沈阳 110001)
关键词：白细胞介素-6；人脐静脉内皮细胞；前列环素
中国医科大学学报000325 摘要 目的：探讨白细胞介素-6 (IL-6)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 合成前列环素( PGI2)的影响以及钙拮抗剂、糖皮质激素对 IL- 6的作用的影响。方法：采用培养的原代人脐静脉内皮细胞为实验对象，用放免法测定细胞培养液中的6-ketoPGF1α。结果：IL-6组内皮细胞合成的6-ketoPGF1α的量较对照组显著减少，对照组为(620.4±34.1)pg/ml，而IL-6组(50 u/ml、100 u/ml)分别为(503.2±23.6)、(470.3±23.6)pg/ml(P<0.05)；钙拮抗剂可以拮抗IL-6的上述效应与IL-6组比较，P<0.05，而地塞米松无此作用。结论：IL-6能抑制内皮细胞合成分泌 PGI2，此作用可能是通过钙离子作为第二信使而实现的。
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Effect of Interleukin-6 on Prosglandin I2 Synthesis in Human
Umbilical Vessel Endothelial Cells
Tian Wen Hu Jian
(Department of Cardiology, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:Our purpose was to determine the effect of interleukin-6 (IL-6) on the synthesis of PGI2 in endothelial cells and the influence of calcium antagonist-Nicardipine on the effect of IL-6.Methods: We put IL-6, monoclonal antibody of IL-6, and Nicardipine on cultured human umbilical veins endothelial cells(HUVEC) and then measured the concentration of PGI2 in cultural fluid by radioimmunoassay.Results: The concentration of PGI2 in IL-6 (50u/ml,100 u/ml) group was significantly lower than that of control [(503.2±23.6) pg/ml, (470.3±23.6) pg/ml, and (620.4±34.1) pg/ml ,P<0.05)]. That of IL-6 plus antibody or Nicardipine group were recovered to (470.3±20.3)pg/ml, (591.7±27.9)pg/ml, and (548.9±20.9) pg/ml respectively (P<0.05) .Conclusion:IL-6 inhibited PGI2 synthesis in HUVEC, monoclonal-antibody of IL-6 and Nicardipine blocked this effect of IL-6 and calcium might be the second messenger in this process .
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KEY WORDS interleukin 6; human umbilical vessel endothelial cell; prosglandin I2
白细胞介素- 6(IL-6)是一种重要的细胞因子，它可由多种细胞产生，并作用于多种细胞而产生广泛的生物学效应。 IL-6可以刺激细胞的分化，促进肝细胞合成急性期蛋白及多能干细胞增殖分化、加快巨核细胞成熟等。因此在血液、肿瘤、炎症尤其是急性期反应过程中起着极为重要的作用。国外研究还发现，动脉粥样斑块中可见有 IL-6基因表达[1]，提示IL-6在动脉粥样硬化过程中具有促进作用。PGI2由血管内皮细胞合成分泌，是一种十分重要的血管活性物质，炎症、休克、动脉粥样硬化、心肌梗死等病理过程都与前列环素和血栓素 A2(TXA2) 的平衡失调密切相关，而 IL -6也参与了这些过程，但关于 IL-6和PGI2之间的关系，尚少见报道。本实验以原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象，观察IL-6对 PGI2合成的影响，并了解其可能机制。
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1 材料与方法
1.1 药品与试剂
DMEM细胞培养基(SIGMA)，胰蛋白酶(GIBCO)，人重组 IL-6及IL-6单克隆抗体(中国军事医学科学院)，尼卡地平针剂由日本山之内制药提供， 6- keto PGF1α试剂盒(解放军总医院)，其余试剂均为分析纯或优级纯。
1.2 方法
1.2.1 原代人脐静脉内皮细胞培养及鉴定：
脐带取自沈阳市妇婴医院，保存于PBS液中。分离静脉内皮细胞采用Jaffe法[2](略作改进，以胰蛋白酶代替胶原酶)。将消化液离心(1 000r/min,10 min)弃上清后，加入内皮细胞培养基DMEM 13.5 g/L，20%小牛血清，青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，pH7.2吹打成细胞悬液，计数后接种于24孔平底培养板 (Falcon)约每孔105个内皮细胞。于 37℃，5%CO2孵箱孵育， 24 h后换液，以后每2～3 d换液1次。4～5 d后，细胞可达融合。相差显微镜下观察，内皮细胞呈梭形及多角形，融合成单层，呈铺路石样外观，无重叠生长。免疫细胞化学染色Ⅷ因子相关抗原呈阳性，胞浆内可见棕黄色颗粒。
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1.2.2 PGI2的测定：
内皮细胞接种后以20%小牛血清DMEM培养48 h，换用无血清培养基培养24 h ,使HUVEC处于静止期,然后分6组，每组4孔，分别加入实验因素：空白对照；IL-6 50 u/ml、100u/ml；IL-6100 u/ml+单克隆抗体；IL-6 100 u/ml+尼卡地平2×10-5 mol/l；IL-6 100 u/ml+地塞米松2×10-4 mol/L，(以上均为终浓度)。24 h后终止培养，分别收集上清于-30℃冷冻待测PGI2。PGI2的半衰期极短，其代谢产物为6-ketoPGF1α较为稳定。通过非平衡放免法检测其含量可以反映PGI2的水平[3]。具体操作步骤按说明书。
1.3 统计分析
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全部结果用均值±标准差表示，多组间均数两两比较用q检验。
2 结果
2.1 IL-6对HUVEC合成分泌PGI2的影响
IL-6在50 u/ml时即可以使HUVEC合成PGI2的量明显减少 (503.2±23.6) pg/ml，与对照组(620.4±34.1)pg/ml比较P<0.05，在浓度为100 u/ml时，PGI2的合成进一步减少(470.3±20.3) pg/ml，但与50u/ml组比较无统计学差异。而加入IL-6单克隆抗体组中的PGI2合成有所恢复(591.7±27.9) pg/ml，与IL-6组(100 u/ml)比较P<0.05，与对照组比较无显著差异。
2.2 尼卡地平和地塞米松对IL-6抑制 PGI2合成作用的影响
, 百拇医药
尼卡地平能够对抗 IL-6抑制 PGI2合成的作用，该组内皮细胞合成的PGI2 (548.9±20.9) pg/ml与IL-6组比较，合成明显增多，P<0.05。与对照组比较无显著差异。而地塞米松组的 PGI2(494.8±20.8) pg/ml与单纯IL-6组比较无显著差异,地塞米松对IL-6的作用未显示出任何影响。
3 讨论
IL-6是一种多功能的细胞因子，在炎症尤其是急性期反应过程中起着极为重要的作用。Maruo等人在实验中发现， IL-6能够抑制体外培养的牛血管内皮细胞合成 PGI2，其机制为IL-6能够抑制花生四烯酸(AA)转化成 PGI2所需的关键酶—环加氧酶的活性，从而使 PGI2的合成减少[4]。本实验所得结果与Maruo 的结论相一致，且本实验以原代培养的人血管内皮细胞为实验对象，以期最大程度上与人的在体血管内皮细胞的生物学性状相近，从而对临床更有意义。实验中还发现，钙离子拮抗剂——尼卡地平能够拮抗IL-6对血管内皮细胞合成PGI2的抑制作用，这一结果提示IL-6作用于血管内皮细胞的信号传导可能是通过钙离子作为第二信使来实现的。糖皮质激素在抗炎、抗休克以及免疫抑制方面具有强大的作用，其主要作用机制是抑制磷脂酶A2，从而减少AA的释放，进一步使前列腺素(PGS)和白细胞三烯(LTS)等炎症介质生成减少，同时它还有拮抗IL-1、IL-6等细胞因子的作用。我们在另外的实验中发现，地塞米松能够拮抗IL-6所引起的促内皮细胞增殖和一氧化氮合成减少。但本实验发现地塞米松对IL-6抑制PGI2合成方面既无协同作用，也无拮抗作用。
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PGI2与 TXA2是一对作用相反相互制衡的血管活性物质。PGI2能够抑制血小板聚集、附壁及血栓形成，促进血管松弛，还能抑制血管平滑肌细胞增殖[5]。当机体 IL-6水平增高时(如感染、应激、发热、损伤等)，可以通过抑制 PGI2的合成来破坏血管壁舒缩及生长状态的平衡，促进血小板聚集、血栓形成进一步损伤内皮，促使炎症、休克、动脉粥样硬化等病理过程恶化。理论上讲，钙离子通道阻断剂能够拮抗IL-6的这种作用，因此可能会对上述疾病的防治有一定的积极意义，但尚需进一步研究证实。
参考文献
1，Ikeda U, Ikeda M, Seino Y, et al. Interleukin-6 genetranscripts are expressed in atherosclerosis lesions of genetically hyperlipidemic rabbit. Atherosclerosis, 1992，92:213—218
, 百拇医药
2，Jaffe EA, Nachman RL, Baker CG, et al. Culture of human endothelial cell derived from umbilical veins. J Clin Invest, 1973， 52: 2745—2749
3，汪钟，杨梅芳，高华，等.血栓素6-ketoPGF1a[125 I]放免分析及初步应用.生理科学,1988， 8：180～182
4，Maruo N，Morita I, Ishizaki, et al. Inhibitory effect of interleukin-6 on prostaglandin I2 production in cultured bovine vascular endothelial cell. Archives Biochem Biophys ,1992， 292:600—604
5，Nilsson J,Ollson AG. Prosglandin I2 inhibits DNA synthesis in arterial smooth muscle cells stimulated with platelet -derived growth factor. Atherosclerosis, 1984，53: 77—84
收稿日期：1999-09-06, http://www.100md.com