MTS1和反义MTS1真核表达载体的构建与鉴定
作者：顾广玉 王文亮△ 黄高升△ 詹洲
单位：第二军医大学长海医院病理科，上海，200433;△第四军医大学基础医学部病理解剖学教研室
关键词：抑癌基因；逆转录病毒载体
为了研究MTS1基因与肿瘤的关系 为了研究MTS1基因与肿瘤的关系，我们构建了MTS1和反义MTS1真核表达载体，并检测了MTS1产物p16在人肝癌细胞株中的表达。
1 材料和方法
1.1 质粒及载体 含MTS1的pUC19质粒由美国Priya Dayananth博士惠赠。它由0.48 kb的人MTS1 cDNA克隆至pUC19的EcoRⅠ及BamHⅠ位点而成[1,2]。逆转录病毒载体pDOR(6.5 kb)由第四军医大学陈协群博士惠赠。真核表达载体pSG5(4.0 kb)由第四军医大学张富泉博士惠赠。
1.2 细胞株及抗体 人肝癌细胞株9204由第四军医大学病理解剖学教研室构建。兔抗p16多克隆抗体购自美国Sunta Cruz公司。
1.3 MTS1基因的克隆和鉴定 分别用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pUC19-MTS1，pDOR和pSG5质粒，回收，经T4连接酶连接，转化大肠杆菌HB101，铺板挑选菌落，提取质粒，酶切鉴定。正义MTS1逆转录病毒载体转染9204细胞，48 h后，用免疫荧光细胞化学方法检测p16的表达。
2 结 果
2.1 重组子的酶切鉴定 正义MTS1逆转录病毒载体命名为pDOR-PM，反义MTS1表达载体命名为pSG5-NM。用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pDOR-PM，出现6.5和0.48 kb两条带；仅用EcoRⅠ酶切出现7.0 kb一条带。用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pSG5-NM，出现4.0和0.48 kb两条带；用EcoRⅠ酶切出现4.5 kb一条带。
2.2 pDOR-PM在肝癌细胞中的表达 将pDOR-PM转染人肝癌细胞株9204，培养48 h，收获细胞进行免疫荧光细胞化学染色，结果可见少数阳性细胞，MTS1表达产物阳性染色位于细胞核及细胞浆(图1)。
3 讨 论
pDOR与pSG5作为真核表达载体，均可在宿主细胞中表达外源基因，pDOR-PM可被转录并翻译成p16蛋白，pSG5-NM的转录物可与内源性p16 mRNA杂交，阻断p16
图1 p16蛋白免疫荧光染色(×400)
的表达。这两种重组载体可用于研究p16基因与肿瘤的关系，并可用于进一步探讨MTS1基因与Rb及p53等基因的关系。进一步的研究正在进行中。
中国图书资料分类法分类号 Q 782
参 考 文 献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumer types.Science，1994,264(5157):436
2 Serrano M，Hannon GJ，Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature，1993，366(6456):704
(1997-09-21收稿，1997-12-31修回)
顾广玉，男，1966年8月生，硕士，主治医师, http://www.100md.com
单位：第二军医大学长海医院病理科，上海，200433;△第四军医大学基础医学部病理解剖学教研室
关键词：抑癌基因；逆转录病毒载体
为了研究MTS1基因与肿瘤的关系 为了研究MTS1基因与肿瘤的关系，我们构建了MTS1和反义MTS1真核表达载体，并检测了MTS1产物p16在人肝癌细胞株中的表达。
1 材料和方法
1.1 质粒及载体 含MTS1的pUC19质粒由美国Priya Dayananth博士惠赠。它由0.48 kb的人MTS1 cDNA克隆至pUC19的EcoRⅠ及BamHⅠ位点而成[1,2]。逆转录病毒载体pDOR(6.5 kb)由第四军医大学陈协群博士惠赠。真核表达载体pSG5(4.0 kb)由第四军医大学张富泉博士惠赠。
1.2 细胞株及抗体 人肝癌细胞株9204由第四军医大学病理解剖学教研室构建。兔抗p16多克隆抗体购自美国Sunta Cruz公司。
1.3 MTS1基因的克隆和鉴定 分别用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pUC19-MTS1，pDOR和pSG5质粒，回收，经T4连接酶连接，转化大肠杆菌HB101，铺板挑选菌落，提取质粒，酶切鉴定。正义MTS1逆转录病毒载体转染9204细胞，48 h后，用免疫荧光细胞化学方法检测p16的表达。
2 结 果
2.1 重组子的酶切鉴定 正义MTS1逆转录病毒载体命名为pDOR-PM，反义MTS1表达载体命名为pSG5-NM。用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pDOR-PM，出现6.5和0.48 kb两条带；仅用EcoRⅠ酶切出现7.0 kb一条带。用EcoRⅠ+BamHⅠ酶切pSG5-NM，出现4.0和0.48 kb两条带；用EcoRⅠ酶切出现4.5 kb一条带。
2.2 pDOR-PM在肝癌细胞中的表达 将pDOR-PM转染人肝癌细胞株9204，培养48 h，收获细胞进行免疫荧光细胞化学染色，结果可见少数阳性细胞，MTS1表达产物阳性染色位于细胞核及细胞浆(图1)。
3 讨 论
pDOR与pSG5作为真核表达载体，均可在宿主细胞中表达外源基因，pDOR-PM可被转录并翻译成p16蛋白，pSG5-NM的转录物可与内源性p16 mRNA杂交，阻断p16
图1 p16蛋白免疫荧光染色(×400)
的表达。这两种重组载体可用于研究p16基因与肿瘤的关系，并可用于进一步探讨MTS1基因与Rb及p53等基因的关系。进一步的研究正在进行中。
中国图书资料分类法分类号 Q 782
参 考 文 献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumer types.Science，1994,264(5157):436
2 Serrano M，Hannon GJ，Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature，1993，366(6456):704
(1997-09-21收稿，1997-12-31修回)
顾广玉，男，1966年8月生，硕士，主治医师, http://www.100md.com