表达白细胞介素-1 β转换酶逆转录病毒载体的构建及其对卵巢癌细胞生物学特性的影响
作者：李进 孔宪涛 钱其军 贾林 赵亚南 沙金燕
单位：200433 上海，笫二军医大学长海医院妇产科(李进，赵亚南，沙金燕)；长征医院(孔宪涛)；肝胆外科研究所(钱其军)，分子生物学教研室(贾林)
关键词：半胱氨酸蛋白酶类；卵巢肿瘤；基因表达
中华妇产科杂志990214 【摘要】 目的 探讨白细胞介素-1 β转换酶的表达，对卵巢癌细胞生物学特性的影响。 方法采用分子克隆方法，将人白细胞介素-1β转换酶(ICE)基因全序列正向插入哺乳动物表达载体 (pLXSN) 的EcoR Ⅰ位点，构建pLXSN-ICE重组体，用电穿孔方法将其导入逆转录病毒载体包装细胞系PA317细胞内，收集病毒上清液，再转染人卵巢癌细胞AO和 3AO。结果 所构建的人ICE基因逆转录病毒载体能在肿瘤细胞内稳定表达。基因转染后，表达ICE基因的细胞的克隆数明显较空载体减少，细胞生长速度明显减慢，并出现自发的凋亡现象；在裸鼠体内的致瘤性明显减弱。结论 ICE基因的表达，能抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，并影响肿瘤细胞在裸鼠体内的致瘤能力。
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The Influences of Interleukin-1β Converting Enzyme Expression on the Biologic Characteristics of Ovarian Cancer Cells LI Jin*, KONG Xiantao, QIAN Qijun, et al.*Second Military Medical University, Changhai Hospital, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the effects of interleukin-1 β converting enzyme (ICE) gene on the biologic characteristics of ovarian cancer cells. Methods A 1.3 Kilobase human ICE cDNA with 5' and 3' untranslated sequences was cloned into the EcoR I site of pLXSN retrovirus vector in sense orientation. After that, the recombinant plasmid pLXSN-ICE was transferred to virus-packing cell PA317 by electroporation method. And then the retrovirus containing human ICE cDNA generated by these PA317 cells were used to transfect human ovarian cancer cell lines, AO and 3AO. Results After being transfected with these retrovirus, the number of the clones obtained after G418 resistance selection is far less than that of controlled groups with plasmid pLXSN. The growth rate of these transfected cells was significantly suppressed in comparison with the parental cell line. Apoptosis was also found in these cells. After the transfection cancer cells were inoculated subcutaneously in nude mice, the tumor growth was significantly inhibited. Conclusion It suggests that human ICE gene can suppress the phenotype and tumorigenicity in nude mice of ovarian cancer cell lines AO and 3AO.
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【Key words】 Cysteine proteinases Ovarian neoplasms Gene expression
白细胞介素-1β转换酶(interleukin-1β converting enzyme, ICE)是一种从单核细胞分离出的胞浆半胱氨酸蛋白酶。其作用是将无活性白细胞介素-1β原转换为白细胞介素-1β，诱导产生炎症反应[1]。最近有研究提示，ICE有激活炎症反应和诱导细胞凋亡的双重功能,而以后者功能更为重要[2]。目前，ICE诱导细胞凋亡的机理尚不清楚。我们构建了表达ICE基因的逆转录病毒载体，并将其转染人卵巢癌细胞，观察ICE在肿瘤细胞内表达的情况，及对肿瘤细胞生物学特性的影响。现报道如下。
材料和方法
一、试剂和细胞株
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含有人ICE基因的质粒ICE-pGEM-4由美国Merck研究所Tocci博士惠赠。ICE多克隆抗体为北京中山公司产品。限制性内切酶EcoRⅠ及HindⅢ购自美国Promega公司。氨基糖甙抗生素(G 418)和聚季氨盐(polybrene)购自美国Sigma公司。本实验采用卵巢癌细胞株AO、3AO(中国科学院上海细胞研究所提供)作为靶细胞。
二、方法
1.质粒的构建：质粒的酶切、DNA的低溶点凝胶电泳回收、DNA连接、细菌转化，以及快速小量质粒DNA的制备等，均参照《分子克隆》进行[3]，将1.36 Kb的人ICE基因插入哺乳动物表达载体(pLXSN)的EcoR I位点内，构建pLXSN-ICE重组体。
2.基因转染:用电穿孔方法将pLXSN-ICE逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317内。将细胞置于含G 418的培养基内培养，筛选出G 418抗性克隆。4周后，采集细胞培养上清液，过滤后配制成含有8 μl/ml Polybrene的过滤病毒上清液，转染卵巢癌细胞。最后筛选出具有G 418抗性的卵巢癌细胞克隆3AO-ICE。
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3.基因表达产物的检测：扩增的阳性克隆细胞经0.25%胰酶消化，pH 7.0磷酸缓冲液冼涤3次后，用蛋白印迹法进行检测。
4.细胞生长曲线的测定：消化3AO和3AO-ICE细胞，调整细胞浓度为5×103个/ml，置入24孔细胞培养板，每孔400 μl，每24小时取1组(每组4孔)消化后，进行细胞计数并计算平均每孔细胞数。并与空载体进行比较。
5.裸鼠体内致瘤性实验：选取3～4周龄Balb/C裸鼠(第二军医大学动物所提供)8只，分两组,每组4只裸鼠，饲养于无菌层流架内。3AO和3AO-ICE细胞消化后，调整浓度为4×106个/ml，取0.2 ml接种于裸鼠背部皮下，观察细胞致瘤的情况(肿瘤体积=1/2×肿瘤最大径×肿瘤最小径)。
结 果
, http://www.100md.com 一、pLXSN-ICE质粒的鉴定
所构建的重组质粒pLXSN-ICE经限制性内切酶Hind Ⅲ酶切后出现1.3 Kb和5.8 Kb的片段。证明人ICE基因正向插入pLXSN中(图1)。
图1 pLXSN-ICE重组逆转录病毒载体的酶切电泳图
二、卵巢癌细胞转化子克隆形成及其形态
ICE基因导入3AO细胞后，所形成的抗G 418转化子克隆数(2.0±1.3)明显较空载体减少(5.0±1.8;P<0.01)。AO细胞在ICE基因转染后即出现明显的凋亡，未能筛选出抗G 418的阳性细胞克隆，空载体的转染则可以筛选出阳性细胞克隆(4.0±2.5;P<0.01)。ICE基因转染后的3AO细胞由椭圆形改变为梭形,培养过程中部分细胞有自发凋亡现象，细胞变圆，并出现悬浮的细胞(图2，3)。3AO细胞在培养的第3天由接种时2 000个/孔扩增至4 800个/孔,第4天达6 400个/孔。而ICE基因转染的3AO细胞的生长速度明显减慢，在接种后第6天才达到4 700个/孔。
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图2 野生型3AO细胞
图3 ICE基因转染后3AO细胞呈梭形，部分细胞有自发凋亡现象
三、蛋白印迹分析
蛋白印迹杂交结果显示，用人ICE多克隆抗体从基因转染细胞的蛋白抽提物中检测出单一的杂交条带，分子相对质量约为43 000。而在野生型3AO细胞中，未检测到任何杂交信号。
四、裸鼠成瘤实验结果
野生型3AO细胞皮下接种后2周，3只裸鼠在接种部位出现瘤结节；4周时瘤体积平均为0.194 cm3。基因转染细胞接种后无肿瘤生长。
讨 论
ICE最初被认为是一种炎症介质，参与炎症反应和其他一些生理病理反应。最近的研究发现，ICE能诱导自身细胞的凋亡，是通过白细胞介素-1β激发炎症反应之外的更重要的功能[2]。到目前为止，已发现了10余种ICE样的蛋白酶(称为ICE家族)。现已证明，ICE及其家族为真核细胞凋亡的关键途径[4，5],特别是在Fas和肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡的信号传导途径中，占据着很重要的位置[6]。
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尽管ICE在诱导细胞凋亡的过程中，需要接受外界凋亡信号的刺激，但从ICE的氨基酸序列及亚单位的分析可以断定，ICE是一个具有自我活化能力的蛋白转换酶[7]。在某些情况下，ICE的过度表达可以不通过外界的凋亡信号直接诱导细胞的凋亡。本实验证实，AO细胞在ICE基因转染后即出现明显的凋亡，3次实验均未能筛选出阳性细胞克隆，而空载体的转染则可以筛选出阳性细胞克隆。对于3AO细胞，外源性ICE基因导入后能筛选出少量抗G 418转化子细胞克隆。这可能是因为不同的细胞株对ICE的敏感性不同。高表达ICE是否引起细胞凋亡，还要根据其他相关因素，如bcl-2、p53等癌基因和抑癌基因的表达情况而定[8]。
本实验结果显示,导入外源性ICE基因，对3AO细胞的影响是非常明显的，能够筛选出的抗G 418转化子细胞克隆数明显较空载体所形成的克隆数少。筛选出的细胞形态有明显的改变，生长速度减慢，并出现自发的凋亡现象,丧失了在裸鼠体内的致瘤能力。
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目前，ICE诱导细胞凋亡的确切调控机理，以及其与肿瘤发生、发展的关系，尚知之甚少，需进一步研究。
参考文献
1 Black RA, Kronheim SR, Cantrell M, et al. Generation of biologically active interleukin-1 by proteolytic cleavage of the inactive precursor.J Biol Chem, 1988,263:9437-9442.
2 Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1β converting enzyme. Cell, 1993,75:641-652.
, 百拇医药
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T主编.分子克隆. 金冬雁译.第2版.北京:科学出版社,1993.16-34.
4 Solary E, Eymin B, Droin N,et al. Proteases, proteolysis, and apoptosis. Cell Biol Toxicol， 1998,14:121-132.
5 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide.Science,1995,267:1445-1449.
6 Iida T , Igarashi T, Ichimura H,et al. Fas antigen expression and apoptosis of lymphocytes in macaques infected with simian immunodeficiency virus strain mac. Arch Virol， 1998,143: 717-729.
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7 Cerretti DP,Kozlosky CJ, Mosley B,et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science,1992,256:97-100.
8 Boise LH, Thompson CB. Bcl-x(L) can inhibit apoptosis in cells that have undergone Fas-induced protease activation. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94: 3759-3764.
(收稿：1997-09-06 修回：1998-12-10), 百拇医药
单位：200433 上海，笫二军医大学长海医院妇产科(李进，赵亚南，沙金燕)；长征医院(孔宪涛)；肝胆外科研究所(钱其军)，分子生物学教研室(贾林)
关键词：半胱氨酸蛋白酶类；卵巢肿瘤；基因表达
中华妇产科杂志990214 【摘要】 目的 探讨白细胞介素-1 β转换酶的表达，对卵巢癌细胞生物学特性的影响。 方法采用分子克隆方法，将人白细胞介素-1β转换酶(ICE)基因全序列正向插入哺乳动物表达载体 (pLXSN) 的EcoR Ⅰ位点，构建pLXSN-ICE重组体，用电穿孔方法将其导入逆转录病毒载体包装细胞系PA317细胞内，收集病毒上清液，再转染人卵巢癌细胞AO和 3AO。结果 所构建的人ICE基因逆转录病毒载体能在肿瘤细胞内稳定表达。基因转染后，表达ICE基因的细胞的克隆数明显较空载体减少，细胞生长速度明显减慢，并出现自发的凋亡现象；在裸鼠体内的致瘤性明显减弱。结论 ICE基因的表达，能抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，并影响肿瘤细胞在裸鼠体内的致瘤能力。
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The Influences of Interleukin-1β Converting Enzyme Expression on the Biologic Characteristics of Ovarian Cancer Cells LI Jin*, KONG Xiantao, QIAN Qijun, et al.*Second Military Medical University, Changhai Hospital, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the effects of interleukin-1 β converting enzyme (ICE) gene on the biologic characteristics of ovarian cancer cells. Methods A 1.3 Kilobase human ICE cDNA with 5' and 3' untranslated sequences was cloned into the EcoR I site of pLXSN retrovirus vector in sense orientation. After that, the recombinant plasmid pLXSN-ICE was transferred to virus-packing cell PA317 by electroporation method. And then the retrovirus containing human ICE cDNA generated by these PA317 cells were used to transfect human ovarian cancer cell lines, AO and 3AO. Results After being transfected with these retrovirus, the number of the clones obtained after G418 resistance selection is far less than that of controlled groups with plasmid pLXSN. The growth rate of these transfected cells was significantly suppressed in comparison with the parental cell line. Apoptosis was also found in these cells. After the transfection cancer cells were inoculated subcutaneously in nude mice, the tumor growth was significantly inhibited. Conclusion It suggests that human ICE gene can suppress the phenotype and tumorigenicity in nude mice of ovarian cancer cell lines AO and 3AO.
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【Key words】 Cysteine proteinases Ovarian neoplasms Gene expression
白细胞介素-1β转换酶(interleukin-1β converting enzyme, ICE)是一种从单核细胞分离出的胞浆半胱氨酸蛋白酶。其作用是将无活性白细胞介素-1β原转换为白细胞介素-1β，诱导产生炎症反应[1]。最近有研究提示，ICE有激活炎症反应和诱导细胞凋亡的双重功能,而以后者功能更为重要[2]。目前，ICE诱导细胞凋亡的机理尚不清楚。我们构建了表达ICE基因的逆转录病毒载体，并将其转染人卵巢癌细胞，观察ICE在肿瘤细胞内表达的情况，及对肿瘤细胞生物学特性的影响。现报道如下。
材料和方法
一、试剂和细胞株
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含有人ICE基因的质粒ICE-pGEM-4由美国Merck研究所Tocci博士惠赠。ICE多克隆抗体为北京中山公司产品。限制性内切酶EcoRⅠ及HindⅢ购自美国Promega公司。氨基糖甙抗生素(G 418)和聚季氨盐(polybrene)购自美国Sigma公司。本实验采用卵巢癌细胞株AO、3AO(中国科学院上海细胞研究所提供)作为靶细胞。
二、方法
1.质粒的构建：质粒的酶切、DNA的低溶点凝胶电泳回收、DNA连接、细菌转化，以及快速小量质粒DNA的制备等，均参照《分子克隆》进行[3]，将1.36 Kb的人ICE基因插入哺乳动物表达载体(pLXSN)的EcoR I位点内，构建pLXSN-ICE重组体。
2.基因转染:用电穿孔方法将pLXSN-ICE逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317内。将细胞置于含G 418的培养基内培养，筛选出G 418抗性克隆。4周后，采集细胞培养上清液，过滤后配制成含有8 μl/ml Polybrene的过滤病毒上清液，转染卵巢癌细胞。最后筛选出具有G 418抗性的卵巢癌细胞克隆3AO-ICE。
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3.基因表达产物的检测：扩增的阳性克隆细胞经0.25%胰酶消化，pH 7.0磷酸缓冲液冼涤3次后，用蛋白印迹法进行检测。
4.细胞生长曲线的测定：消化3AO和3AO-ICE细胞，调整细胞浓度为5×103个/ml，置入24孔细胞培养板，每孔400 μl，每24小时取1组(每组4孔)消化后，进行细胞计数并计算平均每孔细胞数。并与空载体进行比较。
5.裸鼠体内致瘤性实验：选取3～4周龄Balb/C裸鼠(第二军医大学动物所提供)8只，分两组,每组4只裸鼠，饲养于无菌层流架内。3AO和3AO-ICE细胞消化后，调整浓度为4×106个/ml，取0.2 ml接种于裸鼠背部皮下，观察细胞致瘤的情况(肿瘤体积=1/2×肿瘤最大径×肿瘤最小径)。
结 果
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所构建的重组质粒pLXSN-ICE经限制性内切酶Hind Ⅲ酶切后出现1.3 Kb和5.8 Kb的片段。证明人ICE基因正向插入pLXSN中(图1)。
图1 pLXSN-ICE重组逆转录病毒载体的酶切电泳图
二、卵巢癌细胞转化子克隆形成及其形态
ICE基因导入3AO细胞后，所形成的抗G 418转化子克隆数(2.0±1.3)明显较空载体减少(5.0±1.8;P<0.01)。AO细胞在ICE基因转染后即出现明显的凋亡，未能筛选出抗G 418的阳性细胞克隆，空载体的转染则可以筛选出阳性细胞克隆(4.0±2.5;P<0.01)。ICE基因转染后的3AO细胞由椭圆形改变为梭形,培养过程中部分细胞有自发凋亡现象，细胞变圆，并出现悬浮的细胞(图2，3)。3AO细胞在培养的第3天由接种时2 000个/孔扩增至4 800个/孔,第4天达6 400个/孔。而ICE基因转染的3AO细胞的生长速度明显减慢，在接种后第6天才达到4 700个/孔。
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图2 野生型3AO细胞
图3 ICE基因转染后3AO细胞呈梭形，部分细胞有自发凋亡现象
三、蛋白印迹分析
蛋白印迹杂交结果显示，用人ICE多克隆抗体从基因转染细胞的蛋白抽提物中检测出单一的杂交条带，分子相对质量约为43 000。而在野生型3AO细胞中，未检测到任何杂交信号。
四、裸鼠成瘤实验结果
野生型3AO细胞皮下接种后2周，3只裸鼠在接种部位出现瘤结节；4周时瘤体积平均为0.194 cm3。基因转染细胞接种后无肿瘤生长。
讨 论
ICE最初被认为是一种炎症介质，参与炎症反应和其他一些生理病理反应。最近的研究发现，ICE能诱导自身细胞的凋亡，是通过白细胞介素-1β激发炎症反应之外的更重要的功能[2]。到目前为止，已发现了10余种ICE样的蛋白酶(称为ICE家族)。现已证明，ICE及其家族为真核细胞凋亡的关键途径[4，5],特别是在Fas和肿瘤坏死因子诱导细胞凋亡的信号传导途径中，占据着很重要的位置[6]。
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尽管ICE在诱导细胞凋亡的过程中，需要接受外界凋亡信号的刺激，但从ICE的氨基酸序列及亚单位的分析可以断定，ICE是一个具有自我活化能力的蛋白转换酶[7]。在某些情况下，ICE的过度表达可以不通过外界的凋亡信号直接诱导细胞的凋亡。本实验证实，AO细胞在ICE基因转染后即出现明显的凋亡，3次实验均未能筛选出阳性细胞克隆，而空载体的转染则可以筛选出阳性细胞克隆。对于3AO细胞，外源性ICE基因导入后能筛选出少量抗G 418转化子细胞克隆。这可能是因为不同的细胞株对ICE的敏感性不同。高表达ICE是否引起细胞凋亡，还要根据其他相关因素，如bcl-2、p53等癌基因和抑癌基因的表达情况而定[8]。
本实验结果显示,导入外源性ICE基因，对3AO细胞的影响是非常明显的，能够筛选出的抗G 418转化子细胞克隆数明显较空载体所形成的克隆数少。筛选出的细胞形态有明显的改变，生长速度减慢，并出现自发的凋亡现象,丧失了在裸鼠体内的致瘤能力。
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目前，ICE诱导细胞凋亡的确切调控机理，以及其与肿瘤发生、发展的关系，尚知之甚少，需进一步研究。
参考文献
1 Black RA, Kronheim SR, Cantrell M, et al. Generation of biologically active interleukin-1 by proteolytic cleavage of the inactive precursor.J Biol Chem, 1988,263:9437-9442.
2 Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1β converting enzyme. Cell, 1993,75:641-652.
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3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T主编.分子克隆. 金冬雁译.第2版.北京:科学出版社,1993.16-34.
4 Solary E, Eymin B, Droin N,et al. Proteases, proteolysis, and apoptosis. Cell Biol Toxicol， 1998,14:121-132.
5 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide.Science,1995,267:1445-1449.
6 Iida T , Igarashi T, Ichimura H,et al. Fas antigen expression and apoptosis of lymphocytes in macaques infected with simian immunodeficiency virus strain mac. Arch Virol， 1998,143: 717-729.
, 百拇医药
7 Cerretti DP,Kozlosky CJ, Mosley B,et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science,1992,256:97-100.
8 Boise LH, Thompson CB. Bcl-x(L) can inhibit apoptosis in cells that have undergone Fas-induced protease activation. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94: 3759-3764.
(收稿：1997-09-06 修回：1998-12-10), 百拇医药