超氧化物歧化酶稳定性的研究
作者：常雅宁 田 欣 袁勤生
单位：华东理工大学生物工程学院，上海200237
关键词：海藻糖；乳糖；葡萄糖；柠檬酸；草酸；磺基水杨酸；SOD；活力
药物生物技术990309
摘 要 鉴于SOD在溶液中容易失活，无法长期保存。研究了不同浓度的糖类，包括海藻糖，乳糖，葡萄糖，不同浓度的有机酸类包括柠檬酸，草酸，磺基水杨酸，对SOD活力的影响。发现仅海藻糖对SOD活力有一定的保护作用，其它糖类对SOD活力影响不明显，有机酸均使SOD活力下降，但随着酸浓度的增加，SOD活力下降的程度也减轻。
Studies on Stability of SOD
Chang Yaning, Tian Xing,Yuan Qinsheng
, http://www.100md.com
(Institue of Biochemistry of East China University,Shanghai 200237)
Abstract SOD enzyme easily loses its activity and cannot be ke pt long. In this paper, we have studied and analyzed the function to SOD activity of different den sities of sugar (including trehalose, Lactose,glucose) and different densities of organic acid (including citric acid, oxalic acid, sulphosalicylic acid).Results are as follows;only trehalose can certainly protect the SOD, the others can′t protect the activity of SOD clearly and obviously and all organic acid can decr ease the bioactivity of SOD,besides,with the increase of acid density ,the decrease of activity of SOD enzyme is lightened.
, 百拇医药
Key Words Trehaose, Lactose, Glucose, Citricacid, Oxalic acid , Sulphosalicylic acid, SOD, Activity
酶是生物活性物质，酶的保存对其生物活性的发挥很重要，目前很多酶均以冻干粉的形式保存，冷冻干燥对酶的保护虽然很有效，但对有些酶而言，冷冻干燥比冻融法更易破坏酶的催化功能[1]。不过在冷冻干燥时加入糖，可使蛋白质分子受到保护。很多分子在溶液中对蛋白质起稳定作用，如氨基酸，糖类，某些盐类等，但只有糖类既能在干燥条件下起保护作用，又能在溶液中对蛋白质起稳定作用。本文就海藻糖，乳糖，葡萄糖等糖类，柠檬酸，草酸，磺基水杨酸等有机酸对SOD活力的影响作了初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
牛血SOD冻干粉(酶比活(3000U/mg.pro) 上海宝安生物技术公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris) 进口分装；连苯三酚AR 贵州遵义化工厂；海藻糖 上海宝安生物技术公司研制。其它试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.2 方 法
1.2.1 SOD活力测定 改进的连苯三酚自氧化法[2]。
1.2.2 糖对SOD活性的影响 在一定量的酶反应体系中，分别加入不同浓度的海藻糖，乳糖，葡萄糖，均隔2h,24h和48h后取样测定活力，以不加糖的SOD溶液的起始活力作对照(100%)，测定酶活力保留率。
1.2.3 有机酸对SOD活力的影响 在一定量的酶反应体系中，分别加入0.1,0.2,和0.5mol/L的柠檬酸，草酸，磺基水杨酸，隔24h和48h后取样测活，以不加酸的SOD溶液的起始活力作对照，测定酶活力保留率。
以上实验均在25℃的条件下进行。
2 结 果
2.1 糖类对SOD活力的影响
, 百拇医药
2.1.1 海藻糖对SOD活力的影响 不同浓度的海藻糖溶液对SOD活力的影响,见图1(以不加海藻糖的SOD溶液作对照)。
Fig1 Effect of trehalose on the activity of SOD
由图1可看出，不同浓度的海藻糖溶液均可提高酶活力，说明海藻糖具有保护SOD酶活力的作用，以0.28mol/L的海藻糖溶液保护作用最明显，随着时间的延长，海藻糖使SOD的稳定性增加，保护作用更为明显。
2.1.2 葡萄糖对SOD活力的影响 不同浓度的葡萄糖溶液对SOD活力的影响,见表1(以不加葡萄糖的SOD溶液作对照)。
Tab 1 Effect of glucose on the activity of SOD Glucose
, http://www.100md.com
concentration
(mol/L)
After 2h
relative
activity
(%)
After 24h
relative
activity
(%)
After 48h
relative
, http://www.100md.com
activity
(%)
0
100
100
100
0.1
97.2
93.5
92.5
0.2
96.5
100
, 百拇医药
92.8
0.5
96.3
95.7
93.8
由表1可见，葡萄糖对SOD活力影响不明显，与不加葡萄糖的SOD对照相比，葡萄糖使SOD活力略有下降。
2.1.3 乳糖对SOD活力的影响 不同浓度的乳糖溶液对SOD活力的影响结果见图2(以不加乳糖SOD溶液作对照)。
Fig 2 Effect of lactose on the activity of SOD
, http://www.100md.com
由图2可见，乳糖对SOD活力的影响不明显，随着时间的延长，0.4mol/L乳糖使SOD活力下降。
2.2 有机酸对SOD活力影响
2.2.1 柠檬酸对SOD活力的影响 SOD溶液中加入不同浓度的柠檬酸后，其对SOD活力的影响结果见表2(以不加柠檬酸的SOD溶液作对照)。
Tab 2 Effect of citric acid on the activity of SOD Citric acid
concentration
(mol/L)
After 20h
relative activity
, http://www.100md.com
(%)
After 48h
relative activity
(%)
0
91.7
82.3
0.1
3.8
9
0.2
20.7
20.7
, 百拇医药
0.5
86.7
89
由表2可见，不同浓度的柠檬酸对SOD的活力影响不同，而且差别比较大，0.5mol/L柠檬酸对SOD活力几乎无影响，而0.1mol/L,0.2mol/L的柠檬酸对SOD活力有显著影响，使SOD明显失活，尤以0.1mol/L的柠檬酸最为明显，作用20h后，几乎使SOD完全失活。
2.2.2 草酸对SOD活力的影响 SOD溶液中加入不同浓度的草酸后，产生白色沉淀物，且A值很高，结果见图3(以不加草酸的SOD溶液作对照)。
Fig 3 Effect of oxalic acid on the activityof SOD
, 百拇医药
由图3可见，不同浓度的草酸均使SOD的活力下降，但随着浓度的增加，SOD失活的程度却减轻，0.1mol/L的草酸作用20h后，几乎使SOD完全失活，而0.5mol/L的草酸作用48h后，SOD的活力还保留60%以上。
2.2.3 磺基水杨酸对SOD活力的影响 在SOD溶液中加入不同浓度的磺基水杨酸后，其对SOD活力的影响结果见图4(以不加磺基水杨酸的SOD溶液作对照)。
Fig 4 Effect of sulfosalicylic acid
由图4可见，不同浓度的磺基水杨酸对SOD活力的影响不同，均使SOD的活力下降。且同样随着酸浓度增加，SOD失活程度减轻，0.1mol/L的磺基水杨酸作用24h后，几乎使SOD完全失活，而0.5mol/L的酸作用48h后，SOD的活力还保存60%以上。
, 百拇医药
3 讨 论
Arakawa等人的研究表明[3]，多元醇和糖类一直用来作为保护生物大分子活性的稳定剂，在蛋白质的水溶液中加入某些糖类会导致水的表面张力改变，继而引起表面自由能的改变。这是糖类与蛋白质相互作用中最为重要的因素，糖类的加入对蛋白质与水之间氢键的影响以及蛋白质表面的化学本质等也是重要的考虑因素。
加入到SOD水溶液的海藻糖分子结构中含有许多羟基，是一种多元醇化合物，水合能力很强，一方面，海藻糖溶液中，可能会使自由能向有利的方向改变。另一方面，海藻糖的多羟基结构使它既能通过氢键与酶蛋白表面分子相连，又能通过氢键有效地与外部水相连，因而能使酶蛋白结构得到稳定，酶活力得到保护。
实验结果表明，仅海藻糖对SOD有一定的保护作用，使SOD稳定性增加，活力有所提高，其它糖类对SOD活力影响不明显。有机酸均使SOD活力下降，但浓度升高SOD活力下降的程度却减轻。可能是由于有机酸浓度增加，水分子量减少，溶液极性减少，SOD是蛋白质，具有两性电解质的性质，因此极性减少适合它的稳定和保存。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Carpenter J F, Crowe J H.Modes of stability of a protein by organics olutes during desiccation.Cryobiology, 1988,25(5)∶459
2 谢卫华,姚菊芳，袁勤生.微量连苯三酚法测SOD活性.中国医药工业杂志,1 988,19(5)∶217
3 Arakawa T.Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry,1982,21(6)∶6536
收稿日期：199-01-04, 百拇医药
单位：华东理工大学生物工程学院，上海200237
关键词：海藻糖；乳糖；葡萄糖；柠檬酸；草酸；磺基水杨酸；SOD；活力
药物生物技术990309
摘 要 鉴于SOD在溶液中容易失活，无法长期保存。研究了不同浓度的糖类，包括海藻糖，乳糖，葡萄糖，不同浓度的有机酸类包括柠檬酸，草酸，磺基水杨酸，对SOD活力的影响。发现仅海藻糖对SOD活力有一定的保护作用，其它糖类对SOD活力影响不明显，有机酸均使SOD活力下降，但随着酸浓度的增加，SOD活力下降的程度也减轻。
Studies on Stability of SOD
Chang Yaning, Tian Xing,Yuan Qinsheng
, http://www.100md.com
(Institue of Biochemistry of East China University,Shanghai 200237)
Abstract SOD enzyme easily loses its activity and cannot be ke pt long. In this paper, we have studied and analyzed the function to SOD activity of different den sities of sugar (including trehalose, Lactose,glucose) and different densities of organic acid (including citric acid, oxalic acid, sulphosalicylic acid).Results are as follows;only trehalose can certainly protect the SOD, the others can′t protect the activity of SOD clearly and obviously and all organic acid can decr ease the bioactivity of SOD,besides,with the increase of acid density ,the decrease of activity of SOD enzyme is lightened.
, 百拇医药
Key Words Trehaose, Lactose, Glucose, Citricacid, Oxalic acid , Sulphosalicylic acid, SOD, Activity
酶是生物活性物质，酶的保存对其生物活性的发挥很重要，目前很多酶均以冻干粉的形式保存，冷冻干燥对酶的保护虽然很有效，但对有些酶而言，冷冻干燥比冻融法更易破坏酶的催化功能[1]。不过在冷冻干燥时加入糖，可使蛋白质分子受到保护。很多分子在溶液中对蛋白质起稳定作用，如氨基酸，糖类，某些盐类等，但只有糖类既能在干燥条件下起保护作用，又能在溶液中对蛋白质起稳定作用。本文就海藻糖，乳糖，葡萄糖等糖类，柠檬酸，草酸，磺基水杨酸等有机酸对SOD活力的影响作了初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
牛血SOD冻干粉(酶比活(3000U/mg.pro) 上海宝安生物技术公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris) 进口分装；连苯三酚AR 贵州遵义化工厂；海藻糖 上海宝安生物技术公司研制。其它试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.2 方 法
1.2.1 SOD活力测定 改进的连苯三酚自氧化法[2]。
1.2.2 糖对SOD活性的影响 在一定量的酶反应体系中，分别加入不同浓度的海藻糖，乳糖，葡萄糖，均隔2h,24h和48h后取样测定活力，以不加糖的SOD溶液的起始活力作对照(100%)，测定酶活力保留率。
1.2.3 有机酸对SOD活力的影响 在一定量的酶反应体系中，分别加入0.1,0.2,和0.5mol/L的柠檬酸，草酸，磺基水杨酸，隔24h和48h后取样测活，以不加酸的SOD溶液的起始活力作对照，测定酶活力保留率。
以上实验均在25℃的条件下进行。
2 结 果
2.1 糖类对SOD活力的影响
, 百拇医药
2.1.1 海藻糖对SOD活力的影响 不同浓度的海藻糖溶液对SOD活力的影响,见图1(以不加海藻糖的SOD溶液作对照)。
Fig1 Effect of trehalose on the activity of SOD
由图1可看出，不同浓度的海藻糖溶液均可提高酶活力，说明海藻糖具有保护SOD酶活力的作用，以0.28mol/L的海藻糖溶液保护作用最明显，随着时间的延长，海藻糖使SOD的稳定性增加，保护作用更为明显。
2.1.2 葡萄糖对SOD活力的影响 不同浓度的葡萄糖溶液对SOD活力的影响,见表1(以不加葡萄糖的SOD溶液作对照)。
Tab 1 Effect of glucose on the activity of SOD Glucose
, http://www.100md.com
concentration
(mol/L)
After 2h
relative
activity
(%)
After 24h
relative
activity
(%)
After 48h
relative
, http://www.100md.com
activity
(%)
0
100
100
100
0.1
97.2
93.5
92.5
0.2
96.5
100
, 百拇医药
92.8
0.5
96.3
95.7
93.8
由表1可见，葡萄糖对SOD活力影响不明显，与不加葡萄糖的SOD对照相比，葡萄糖使SOD活力略有下降。
2.1.3 乳糖对SOD活力的影响 不同浓度的乳糖溶液对SOD活力的影响结果见图2(以不加乳糖SOD溶液作对照)。
Fig 2 Effect of lactose on the activity of SOD
, http://www.100md.com
由图2可见，乳糖对SOD活力的影响不明显，随着时间的延长，0.4mol/L乳糖使SOD活力下降。
2.2 有机酸对SOD活力影响
2.2.1 柠檬酸对SOD活力的影响 SOD溶液中加入不同浓度的柠檬酸后，其对SOD活力的影响结果见表2(以不加柠檬酸的SOD溶液作对照)。
Tab 2 Effect of citric acid on the activity of SOD Citric acid
concentration
(mol/L)
After 20h
relative activity
, http://www.100md.com
(%)
After 48h
relative activity
(%)
0
91.7
82.3
0.1
3.8
9
0.2
20.7
20.7
, 百拇医药
0.5
86.7
89
由表2可见，不同浓度的柠檬酸对SOD的活力影响不同，而且差别比较大，0.5mol/L柠檬酸对SOD活力几乎无影响，而0.1mol/L,0.2mol/L的柠檬酸对SOD活力有显著影响，使SOD明显失活，尤以0.1mol/L的柠檬酸最为明显，作用20h后，几乎使SOD完全失活。
2.2.2 草酸对SOD活力的影响 SOD溶液中加入不同浓度的草酸后，产生白色沉淀物，且A值很高，结果见图3(以不加草酸的SOD溶液作对照)。
Fig 3 Effect of oxalic acid on the activityof SOD
, 百拇医药
由图3可见，不同浓度的草酸均使SOD的活力下降，但随着浓度的增加，SOD失活的程度却减轻，0.1mol/L的草酸作用20h后，几乎使SOD完全失活，而0.5mol/L的草酸作用48h后，SOD的活力还保留60%以上。
2.2.3 磺基水杨酸对SOD活力的影响 在SOD溶液中加入不同浓度的磺基水杨酸后，其对SOD活力的影响结果见图4(以不加磺基水杨酸的SOD溶液作对照)。
Fig 4 Effect of sulfosalicylic acid
由图4可见，不同浓度的磺基水杨酸对SOD活力的影响不同，均使SOD的活力下降。且同样随着酸浓度增加，SOD失活程度减轻，0.1mol/L的磺基水杨酸作用24h后，几乎使SOD完全失活，而0.5mol/L的酸作用48h后，SOD的活力还保存60%以上。
, 百拇医药
3 讨 论
Arakawa等人的研究表明[3]，多元醇和糖类一直用来作为保护生物大分子活性的稳定剂，在蛋白质的水溶液中加入某些糖类会导致水的表面张力改变，继而引起表面自由能的改变。这是糖类与蛋白质相互作用中最为重要的因素，糖类的加入对蛋白质与水之间氢键的影响以及蛋白质表面的化学本质等也是重要的考虑因素。
加入到SOD水溶液的海藻糖分子结构中含有许多羟基，是一种多元醇化合物，水合能力很强，一方面，海藻糖溶液中，可能会使自由能向有利的方向改变。另一方面，海藻糖的多羟基结构使它既能通过氢键与酶蛋白表面分子相连，又能通过氢键有效地与外部水相连，因而能使酶蛋白结构得到稳定，酶活力得到保护。
实验结果表明，仅海藻糖对SOD有一定的保护作用，使SOD稳定性增加，活力有所提高，其它糖类对SOD活力影响不明显。有机酸均使SOD活力下降，但浓度升高SOD活力下降的程度却减轻。可能是由于有机酸浓度增加，水分子量减少，溶液极性减少，SOD是蛋白质，具有两性电解质的性质，因此极性减少适合它的稳定和保存。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Carpenter J F, Crowe J H.Modes of stability of a protein by organics olutes during desiccation.Cryobiology, 1988,25(5)∶459
2 谢卫华,姚菊芳，袁勤生.微量连苯三酚法测SOD活性.中国医药工业杂志,1 988,19(5)∶217
3 Arakawa T.Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry,1982,21(6)∶6536
收稿日期：199-01-04, 百拇医药