DNA含量和细胞周期分析与恶性体腔积液诊断和腔内化疗疗效判断
作者：周从明 周继华 唐方 王靖 张正伟 周从全
单位：成都市第三人民医院检验科(成都 610031) 唐方；成都市天立肿瘤研究所 周从全；成都市第三人民医院肿；瘤科(成都 610031) 周从明 周继华 王靖 张正伟
关键词：DNA；恶性积液；腔内化疗；流式细胞术
华西医学990365 摘要：目的：探讨采用流式细胞仪测定DNA含量及作细胞周期分析在诊断恶性体腔积液及判断腔内化疗疗效中的意义。 方法：对41例患恶性肿瘤伴胸水、腹水和心包积液的患者，在腔内化疗前后进行积液中细胞DNA含量测定和细胞周期分析及细胞病理学检查。结果： 腔内化疗前：41例患者中19例查见癌细胞，34例中查见异倍体细胞。第一次腔内化疗6～7天后：41例患者积液中均未再查见癌细胞，有3例查见异倍体细胞；DNA指数(DI)、G2/M期所占比例，S期所占比例(SPF)均显著下降(P<0.001)。第二次腔内化疗6～7天后，所有病例中均未查见癌细胞和异倍体细胞。结论：采用流式细胞仪测定DNA含量及作细胞周期分析诊断恶性体腔积液和判断腔内化疗疗效具有快速、灵敏和可靠性高的优点。
, 百拇医药
[中图分类号]R73-36+1；R523；R-331 [文献标识码]B
Value of flow Cytometric DNA Analysis in the Evaluation of
Malignant Effusion and Intracavitary Chemotherapy
ZHOU Cong-ming, ZHOU Ji-hua , TANG Fang , et al .
文献报道恶性胸水中癌细胞的检出率仅有50%左右〔1，2，3〕，恶性腹水中癌细胞的检出率仅有40%左右〔4〕，虽多次送检阳性率可略有提高，但作为确诊癌性积液的标准，其阳性率低，给及时诊治和疗效判断带来困难。我们对41例伴有心包、胸腔或腹腔积液的恶性肿瘤患者在腔内化疗前后分别进行了细胞病理学、DNA含量检测和细胞周期分析，以探讨应用流式细胞仪进行DNA含量测定及细胞周期分析在恶性体腔积液诊断及腔内化疗疗效评定中的意义，现报道如下。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 病例选择 41例患者，男25例，女16例，年龄36～72岁，平均年龄53.3岁。其中肺癌18例，结肠癌8例，乳腺癌6例 ，肝癌4例，胰腺癌2例，卵巢癌、直肠癌、恶性神经鞘膜瘤各1例，所有病例均经病理学证实。伴发胸腔积液21例，腹腔积液17例，心包积液3例。所有病例在检测之前均未进行过腔内化疗。
1.2 标本采集 在腔内化疗前进行穿刺抽取体腔积液标本200ml，平分为2份，在30分钟内分别送达检验室，进行DNA含量测定、细胞周期分析和细胞病理学检查。
1.3 在抽取出尽量多的积液后，根据不同病理类型选择 Vp-16 100mg + DDP、40mg、DDP 30～40mg、BLM 50mg或MMC 6mg对患者进行腔内化疗。在第一次腔内化疗后第6～7天再次进行穿刺抽取体腔积液送检。第二次腔内化疗选在第一次腔内化疗后第10～12天进行。
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2 结果
2.1 腔内化疗前后积液细胞病理学检查及DNA含量变化见表1和表2。 经过1次腔内化疗后，原查见异倍体的34例病人体腔集液中，有31例异倍体完全消失；而有3例异倍体含量显著减少。经过2次腔内化疗后，所有41例病人体腔集液中均未查见异倍体，也未查见癌细胞。第一次腔内化疗后，有5例患者积液中发现有凋亡峰存在。
表1.腔内化疗前DNA含量及细胞病理学 细胞病理学
DNA含量
异倍体
二倍体
查见癌细胞
18
1
, 百拇医药
未查见癌细胞
16
6
表2. 第一次腔内化疗后DNA含量及细胞病理学 细胞病理学
DNA含量
异倍体
二倍体
查见癌细胞
0
0
未查见癌细胞
3
38
, 百拇医药
2.2 腔内化疗前后DNA含量及细胞各周期比例变化。DNA指数(DI)是指细胞DNA的相对含量 ，正常人成熟体细胞为二倍体，其DI=1。第一次腔内化疗前后DNA指数(DI)、S所占比例(SPF)、G2/M期所占比例等值测定结果及对上述各值进行前后配对t检验结果见表3。表3.腔内化疗前后积液中DNA含量、细胞周期分析、细胞学检查及配对t检验结果 指标
腔内化疗前
腔内化疗1次后
t
P
DI
1.63±0.80
1.02±0.12
4.79
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<0.001
DI-AN
1.76±0.82
1.03±0.14
5.31
<0.001
SPF(%)
10.38±4.64
2.95±1.73
11.44
<0.001
SPF-DI(%)
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6.70±5.19
2.42±0.85
2.28
>0.05
SPF-AN(%)
11.19±4.21
3.06±1.85
12.62
<0.001
G2/M(%)
13.39±6.53
4.06±2.78
, http://www.100md.com
10.11
<0.001
G2/M-DI(%)
8.05±5.79
3.00±1.97
2.43
>0.05
G2/M-AN(%)
14.49±6.19
4.28±2.90
10.51
<0.001
, http://www.100md.com
注：DI、DI-AN分别为全组41例和34例异倍体积液的细胞DNA指数；SPF、SPF-DI、SPF-AN分别为全组41例、7例二倍体及34例异倍体积液的S期细胞所占比例；G2/M、G2/M-DI、G2/M-AN分别为全组41例、7例二倍体及34例异倍体积液的G2/M期所占比例；t为前后配对t检验统计分析所得t值。
2.3 腔内化疗疗效 胸腔积液疗效判定标准采用上海市肺癌协作组晚期肺癌胸腔积液治疗的疗效评定标准，显效即治疗后胸腔积液完全吸收，症状消失，胸片和B超检查未见胸腔积液，见效后维持30天以上；有效为积液减少50%以上，症状改善，结合临床、胸片、B超检查证实有效，维持30天以上并不需要抽液者；无效为治疗后胸腔积液迅速产生或减少50%以下，治疗30天以内必须再次抽液者。腹腔及心包积液疗效参照上述标准。经过2次腔内化疗后，41例恶性体腔积液中显效11(26.83%)例，有效23(56.10%)例，无效7(17.07%)例。
3 讨论
, 百拇医药
肿瘤细胞的细胞核通常较大，常有染色体数及结构的畸变，肿瘤细胞DNA的非整倍性是恶性肿瘤的特征性标志之一。目前最常用的检测DNA含量和倍体性的方法是流式细胞术(Flow cytometry，FCM)。近十年来，用流式细胞仪测定肿瘤细胞DNA含量的结果表明：90%以上的肿瘤细胞DNA含量异常。肿瘤细胞增殖活跃，S期和G2/M期细胞比例明显增高，该比值越高，表明肿瘤细胞增殖越快，恶性程度越高，预后越差。
文献报道，应用流式细胞仪测定DNA含量作为诊断方法在诊断恶性胸腹腔积液中的敏感性和特异性分别可高达80%和94%以上〔5〕。而我们对41例恶性体腔集液患者进行腔内化疗的检测结果显示，在腔内化疗前积液中查见异倍体的比例(82.9%)较细胞学查见癌细胞的比例(46.3%)高，仅有1例细胞学阳性而DNA检查未发现异倍体；而在细胞学阴性的22例中仍有72.7 %( 16例 )查见异倍体。
DNA指数(DI)及S期所占比例(SPF)与肿瘤病理学之间有着相关性〔6〕，DI偏离其正常值1越远、SPF值越高提示异倍体细胞含量越多、增殖细胞所占比例越大、细胞增殖越活跃，预后越差。在第一次腔内化疗前，该组41例患者的DI、G2/M、SPF平均值分别为1.63、13.39%、14.67%，均较高，尤其是异倍体组。而在第一次腔内化疗6～7天后，上述各值均显著性下降(P<0.001)，异倍体组下降尤为显著。此结果与多数化疗药物对分裂增殖活跃的细胞有较强杀伤力的特点相符，提示化疗的有效性。第一次腔内化疗后仅有5例( 14.7% )中查见有凋亡细胞。这是由于化疗后癌细胞凋亡发生较早，能够检测到凋亡的时间较短。如果能够及时抽取积液进行第二次送检则可以得到更多的肿瘤细胞凋亡信息。
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本文41例患者在进行1～2次腔内化疗之后，其积液中癌细胞及异倍体均完全消失，这表明腔内化疗效果极佳。但这并非说明所选药物都是对各个患者极其敏感的化疗药，而可能是由于在经过穿刺抽液后，患者的积液量较少，注射药物后其积液中化疗药物的有效浓度高，以致于1～2次腔内化疗后积液中的癌细胞均被完全杀死，这从另一个角度支持大剂量化疗的科学性和有效性。另外，除化疗药的细胞毒作用外，在腔内化疗中其理化特性(如pH值，渗透压等)和非特异性免疫功能也可能发挥一定肿瘤杀伤作用。
综上所述，应用流式细胞仪测定DNA含量和进行细胞周期分析作为诊断恶性体腔积液的方法具有较高的敏感性，是判断腔内化疗疗效的直观、可靠而有效的方法。
4 参考文献
1 陈灏珠：实用内科学。人民卫生出版社(第10版)，1997 ，11：1476～1477。
2 沈策，叶曜芩，罗文侗等：用流式细胞仪对胸水细胞的DNA含量和细胞周期的研究。中华结核和呼吸杂志，1994，17(2)：90～92。
, 百拇医药
3 陈灏珠，李宗明：内科学。人民卫生出版社(第三版)，1990，10：114～119。
4 汤钊猷：现代肿瘤学。上海医科大学出版社(第一版)，1993，6：441。
5 el-Habashi-AH, Freeman-SM, el-Morsi-B, et al.DNA ploidy and proliferating cell nuclear antigen image analysis of peritoneal and pleural effusion. A possiable diagnostic role. Acta Cytol. 1997；41(3):636～648.
6 Dilaver Demirel, Rodolfo Laucirica, Amiram Fishman, et al. Ovarian tumors of low malignant potential:correlation of DNA index and S-phase fraction with histopathologic grade and clinical outcome. Cancer,1996；77:1494～1500.
(收稿日期：1999-01-27), 百拇医药
单位：成都市第三人民医院检验科(成都 610031) 唐方；成都市天立肿瘤研究所 周从全；成都市第三人民医院肿；瘤科(成都 610031) 周从明 周继华 王靖 张正伟
关键词：DNA；恶性积液；腔内化疗；流式细胞术
华西医学990365 摘要：目的：探讨采用流式细胞仪测定DNA含量及作细胞周期分析在诊断恶性体腔积液及判断腔内化疗疗效中的意义。 方法：对41例患恶性肿瘤伴胸水、腹水和心包积液的患者，在腔内化疗前后进行积液中细胞DNA含量测定和细胞周期分析及细胞病理学检查。结果： 腔内化疗前：41例患者中19例查见癌细胞，34例中查见异倍体细胞。第一次腔内化疗6～7天后：41例患者积液中均未再查见癌细胞，有3例查见异倍体细胞；DNA指数(DI)、G2/M期所占比例，S期所占比例(SPF)均显著下降(P<0.001)。第二次腔内化疗6～7天后，所有病例中均未查见癌细胞和异倍体细胞。结论：采用流式细胞仪测定DNA含量及作细胞周期分析诊断恶性体腔积液和判断腔内化疗疗效具有快速、灵敏和可靠性高的优点。
, 百拇医药
[中图分类号]R73-36+1；R523；R-331 [文献标识码]B
Value of flow Cytometric DNA Analysis in the Evaluation of
Malignant Effusion and Intracavitary Chemotherapy
ZHOU Cong-ming, ZHOU Ji-hua , TANG Fang , et al .
文献报道恶性胸水中癌细胞的检出率仅有50%左右〔1，2，3〕，恶性腹水中癌细胞的检出率仅有40%左右〔4〕，虽多次送检阳性率可略有提高，但作为确诊癌性积液的标准，其阳性率低，给及时诊治和疗效判断带来困难。我们对41例伴有心包、胸腔或腹腔积液的恶性肿瘤患者在腔内化疗前后分别进行了细胞病理学、DNA含量检测和细胞周期分析，以探讨应用流式细胞仪进行DNA含量测定及细胞周期分析在恶性体腔积液诊断及腔内化疗疗效评定中的意义，现报道如下。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 病例选择 41例患者，男25例，女16例，年龄36～72岁，平均年龄53.3岁。其中肺癌18例，结肠癌8例，乳腺癌6例 ，肝癌4例，胰腺癌2例，卵巢癌、直肠癌、恶性神经鞘膜瘤各1例，所有病例均经病理学证实。伴发胸腔积液21例，腹腔积液17例，心包积液3例。所有病例在检测之前均未进行过腔内化疗。
1.2 标本采集 在腔内化疗前进行穿刺抽取体腔积液标本200ml，平分为2份，在30分钟内分别送达检验室，进行DNA含量测定、细胞周期分析和细胞病理学检查。
1.3 在抽取出尽量多的积液后，根据不同病理类型选择 Vp-16 100mg + DDP、40mg、DDP 30～40mg、BLM 50mg或MMC 6mg对患者进行腔内化疗。在第一次腔内化疗后第6～7天再次进行穿刺抽取体腔积液送检。第二次腔内化疗选在第一次腔内化疗后第10～12天进行。
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2 结果
2.1 腔内化疗前后积液细胞病理学检查及DNA含量变化见表1和表2。 经过1次腔内化疗后，原查见异倍体的34例病人体腔集液中，有31例异倍体完全消失；而有3例异倍体含量显著减少。经过2次腔内化疗后，所有41例病人体腔集液中均未查见异倍体，也未查见癌细胞。第一次腔内化疗后，有5例患者积液中发现有凋亡峰存在。
表1.腔内化疗前DNA含量及细胞病理学 细胞病理学
DNA含量
异倍体
二倍体
查见癌细胞
18
1
, 百拇医药
未查见癌细胞
16
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表2. 第一次腔内化疗后DNA含量及细胞病理学 细胞病理学
DNA含量
异倍体
二倍体
查见癌细胞
0
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未查见癌细胞
3
38
, 百拇医药
2.2 腔内化疗前后DNA含量及细胞各周期比例变化。DNA指数(DI)是指细胞DNA的相对含量 ，正常人成熟体细胞为二倍体，其DI=1。第一次腔内化疗前后DNA指数(DI)、S所占比例(SPF)、G2/M期所占比例等值测定结果及对上述各值进行前后配对t检验结果见表3。表3.腔内化疗前后积液中DNA含量、细胞周期分析、细胞学检查及配对t检验结果 指标
腔内化疗前
腔内化疗1次后
t
P
DI
1.63±0.80
1.02±0.12
4.79
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<0.001
DI-AN
1.76±0.82
1.03±0.14
5.31
<0.001
SPF(%)
10.38±4.64
2.95±1.73
11.44
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SPF-DI(%)
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6.70±5.19
2.42±0.85
2.28
>0.05
SPF-AN(%)
11.19±4.21
3.06±1.85
12.62
<0.001
G2/M(%)
13.39±6.53
4.06±2.78
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10.11
<0.001
G2/M-DI(%)
8.05±5.79
3.00±1.97
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>0.05
G2/M-AN(%)
14.49±6.19
4.28±2.90
10.51
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注：DI、DI-AN分别为全组41例和34例异倍体积液的细胞DNA指数；SPF、SPF-DI、SPF-AN分别为全组41例、7例二倍体及34例异倍体积液的S期细胞所占比例；G2/M、G2/M-DI、G2/M-AN分别为全组41例、7例二倍体及34例异倍体积液的G2/M期所占比例；t为前后配对t检验统计分析所得t值。
2.3 腔内化疗疗效 胸腔积液疗效判定标准采用上海市肺癌协作组晚期肺癌胸腔积液治疗的疗效评定标准，显效即治疗后胸腔积液完全吸收，症状消失，胸片和B超检查未见胸腔积液，见效后维持30天以上；有效为积液减少50%以上，症状改善，结合临床、胸片、B超检查证实有效，维持30天以上并不需要抽液者；无效为治疗后胸腔积液迅速产生或减少50%以下，治疗30天以内必须再次抽液者。腹腔及心包积液疗效参照上述标准。经过2次腔内化疗后，41例恶性体腔积液中显效11(26.83%)例，有效23(56.10%)例，无效7(17.07%)例。
3 讨论
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肿瘤细胞的细胞核通常较大，常有染色体数及结构的畸变，肿瘤细胞DNA的非整倍性是恶性肿瘤的特征性标志之一。目前最常用的检测DNA含量和倍体性的方法是流式细胞术(Flow cytometry，FCM)。近十年来，用流式细胞仪测定肿瘤细胞DNA含量的结果表明：90%以上的肿瘤细胞DNA含量异常。肿瘤细胞增殖活跃，S期和G2/M期细胞比例明显增高，该比值越高，表明肿瘤细胞增殖越快，恶性程度越高，预后越差。
文献报道，应用流式细胞仪测定DNA含量作为诊断方法在诊断恶性胸腹腔积液中的敏感性和特异性分别可高达80%和94%以上〔5〕。而我们对41例恶性体腔集液患者进行腔内化疗的检测结果显示，在腔内化疗前积液中查见异倍体的比例(82.9%)较细胞学查见癌细胞的比例(46.3%)高，仅有1例细胞学阳性而DNA检查未发现异倍体；而在细胞学阴性的22例中仍有72.7 %( 16例 )查见异倍体。
DNA指数(DI)及S期所占比例(SPF)与肿瘤病理学之间有着相关性〔6〕，DI偏离其正常值1越远、SPF值越高提示异倍体细胞含量越多、增殖细胞所占比例越大、细胞增殖越活跃，预后越差。在第一次腔内化疗前，该组41例患者的DI、G2/M、SPF平均值分别为1.63、13.39%、14.67%，均较高，尤其是异倍体组。而在第一次腔内化疗6～7天后，上述各值均显著性下降(P<0.001)，异倍体组下降尤为显著。此结果与多数化疗药物对分裂增殖活跃的细胞有较强杀伤力的特点相符，提示化疗的有效性。第一次腔内化疗后仅有5例( 14.7% )中查见有凋亡细胞。这是由于化疗后癌细胞凋亡发生较早，能够检测到凋亡的时间较短。如果能够及时抽取积液进行第二次送检则可以得到更多的肿瘤细胞凋亡信息。
, http://www.100md.com
本文41例患者在进行1～2次腔内化疗之后，其积液中癌细胞及异倍体均完全消失，这表明腔内化疗效果极佳。但这并非说明所选药物都是对各个患者极其敏感的化疗药，而可能是由于在经过穿刺抽液后，患者的积液量较少，注射药物后其积液中化疗药物的有效浓度高，以致于1～2次腔内化疗后积液中的癌细胞均被完全杀死，这从另一个角度支持大剂量化疗的科学性和有效性。另外，除化疗药的细胞毒作用外，在腔内化疗中其理化特性(如pH值，渗透压等)和非特异性免疫功能也可能发挥一定肿瘤杀伤作用。
综上所述，应用流式细胞仪测定DNA含量和进行细胞周期分析作为诊断恶性体腔积液的方法具有较高的敏感性，是判断腔内化疗疗效的直观、可靠而有效的方法。
4 参考文献
1 陈灏珠：实用内科学。人民卫生出版社(第10版)，1997 ，11：1476～1477。
2 沈策，叶曜芩，罗文侗等：用流式细胞仪对胸水细胞的DNA含量和细胞周期的研究。中华结核和呼吸杂志，1994，17(2)：90～92。
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3 陈灏珠，李宗明：内科学。人民卫生出版社(第三版)，1990，10：114～119。
4 汤钊猷：现代肿瘤学。上海医科大学出版社(第一版)，1993，6：441。
5 el-Habashi-AH, Freeman-SM, el-Morsi-B, et al.DNA ploidy and proliferating cell nuclear antigen image analysis of peritoneal and pleural effusion. A possiable diagnostic role. Acta Cytol. 1997；41(3):636～648.
6 Dilaver Demirel, Rodolfo Laucirica, Amiram Fishman, et al. Ovarian tumors of low malignant potential:correlation of DNA index and S-phase fraction with histopathologic grade and clinical outcome. Cancer,1996；77:1494～1500.
(收稿日期：1999-01-27), 百拇医药