组织金属蛋白酶抑制因子Ⅱ及Ⅳ型胶原与胃癌浸润转移的关系
作者：封国生 谭毓铨
单位：封国生(100038 北京，铁道部北京铁路总医院普通外科)；谭毓铨(白求恩医科大学第一临床学院)
关键词：
中华医学杂志000714
近年来，金属蛋白酶( MMP)及其抑制物组织金属蛋白酶抑制因子( TIMP)与细胞外基质和基底膜在肿瘤浸润转移中的作用受到重视。 TIMP2是 TIMP 的一个亚型，Ⅳ型胶原是构成细胞外基质和基底膜的主要成分。我们采用原位杂交和免疫组织化学染色技术，检测了 TIMP2和Ⅳ型胶原在胃癌中的表达，旨在探讨它们与胃癌浸润转移的关系。
一、对象与方法
1.对象：本组病例来源于本院住院胃癌病人，共27例，其中男22例，女5例，平均年龄59岁±20岁，均经手术及术后病理确定诊断。27例胃癌标本均在手术切除时立即取材，正常对照组的标本取距离癌组织5 cm以外的胃粘膜。
, 百拇医药
2.材料：TIMP2 cDNA探针，DACO公司生产。3H-dCTP 37 MBq/ml，购于上海原子核研究所。探针随机引物试验盒，原位交试剂盒，购于美国promaga公司，探针标记用随机引物法。抗Ⅳ型胶原单克隆抗体，ABC试剂盒，购于北京中山生物技术有限公司。
3.方法：(1)TIMP2原位杂交：杂交步骤：①0.5×SSC洗 3次×5 min,晾干,放入湿盒；②1 μg/ml蛋白酶K消化10 min，37℃；③0.5×SSC洗片1次,晾干；④加入新配制的含有体积分数为0.25%乙酰酐，0.1 mol/L三乙醇胺溶液(pH8.0)，浸泡10 min；⑤0.5×SSC洗2次，晾干；⑥加新配制的杂交液50 μl，盖片，置42℃温箱，16～18 h。(2)洗脱：①洗脱液Ⅰ洗3次×10 min，室温；②洗脱液Ⅱ洗3次×20 min，50℃；③洗脱液Ⅰ洗 3次×10 min，37℃；④洗脱液Ⅲ洗3次×20 min，37℃；⑤0.1×SSC洗3次×10 min；⑥乙醇梯度脱水，每次5 min，显影。(3)免疫组织化学染色法(ABC法)，染色流程按试剂盒说明进行。
, 百拇医药
4.结果判定： TIMP2原位杂交：由3人分别数取3个油镜视野细胞内阳性颗粒数，取其平均值作为单个油镜视野的阳性颗粒数。Ⅳ型胶原免疫组织化学染色，结果判定以Ⅳ型胶原在基底膜及间质分布情况作定性及半定量：基底膜缺失(-)或碎片状(+)为阴性；基底膜间断状(++)或连续线状(+++)为阳性。
5.统计学处理： TIMP2 mRNA表达阳性在每个油镜视野的颗粒数以
±s表示，用t检验或q检验(Newman-keuls法)作统计学处理。Ⅳ型胶原表达，用秩和检验或四格表确切概率法作统计学处理。
二、结果
1. TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原在胃癌中的表达： TIMP2 mRNA在胃癌及相应正常组织中均有表达，阳性细胞内呈黑褐色细小颗粒状。Ⅳ型胶原在正常胃粘膜及部分胃癌组织中主要位于腺体基底膜及细胞外间质中，呈连续状或间断状。TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原在胃癌和正常组织中表达变化(表1)。
, 百拇医药
表1 TIMP2、mRNA、Ⅳ型胶原在胃癌中的表达 组织
例数
TIMP2表达
(颗粒数，±s)
Ⅳ型胶原表达(例数)
-
+
++
+++
癌组织
27
, 百拇医药
166±84
6
12
6
3
正 常
27
125±45
0
5
8
14
注：TIMP2比较，t=1.73，P>0.05；Uc=3.969，P<0.001 2. TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原表达与胃癌浸润及转移的关系：按浸润程度把胃癌分为浸润浆膜和未浸润浆膜两组。结果显示，TIMP2 在无浸润浆膜组中的表达高于有浆膜浸润组(t=2.37，P<0.05)(图1)，Ⅳ型胶原在有浆膜浸润的胃癌中多表现为基底膜缺失或碎片状，而在无浆膜浸润组基底膜多呈间断状，或基本完整线状(P=0.011)(图2)。TIMP2 在有淋巴结转移胃癌中的表达明显低于无淋巴结转移组(t=2.98，P<0.01)，Ⅳ型胶原在有淋巴结转移的胃癌中大多数阴性染色或碎片状(P=0.036)。
, 百拇医药
图1 TIMP2在胃癌中的高表达 原位杂交×100
图2 Ⅳ型胶原在无浆膜浸润及转移胃癌中的表达，可见基底膜完整 免疫组织化学染色×40
3. TIMP2 Ⅳ型胶原表达与胃癌大体类型及分化程度的关系(表2)。
表2 TIMP2、COⅣ表达与胃癌生长方式及分化程度的关系 胃癌类型
例数
TIMP2表达
(阳性颗粒性数，±s)
, 百拇医药
Ⅳ型胶原表达(例数)
阴性
阳性
生长方式
肿块
5
175± 98
1(20)
4(80)
溃疡
16
148±103
12(75)
, 百拇医药
4(25)
浸润
6
127± 83*
5(83)
1(17)
分化程度
高分化
4
148± 98
1(25)
3(75)
中分化
, 百拇医药
16
158± 95
11(69)
5(21)
低分化
7
103± 49
6(86)
1(14)
注：与肿块组q=4.32，P<0.05；Ⅳ型胶原各组之间经秩和检验差异无显著意义；括号内为百分率(%)
三、讨论
MMP和TIMP之间的平衡是影响肿瘤浸润和转移的重要因素[1]。另外，癌细胞基底膜的破坏也与肿瘤细胞Ⅳ型胶原分泌减少有关[2]。在Ⅳ型胶原合成减少的同时，癌细胞Ⅳ型胶原酶的合成增加，TIMP分泌再减少，将使Ⅳ型胶原过度分解，从而导致癌细胞较容易穿透基底膜而发生浸润和转移。本结果显示，TIMP2在胃癌中的表达与正常胃粘膜组织相比有增高趋势，提示TIMP2表达水平增高可能为肿瘤细胞分泌所致。本研究表明，TIMP2在未浸润浆膜及无淋巴结转移胃癌中的表达明显高于已有浆膜浸润及淋巴结转移组；从肿瘤生长方式看，TIMP2在浸润性生长胃癌中的表达低于肿块型胃癌组。说明TIMP2可能有抑制胃癌浸润及转移的作用。Ⅳ型胶原在有浆膜浸润及淋巴结转移的胃癌中，染色多呈碎片状或阴性，基底膜缺失率为80%以上。而在无浆膜浸润及淋巴结转移的胃癌中可见基底膜基本完整，染色表现为基底膜呈间断状或连续状，癌巢周围基质可见阳性染色。从分化程度及生长方式来看，Ⅳ型胶原在低分化及浸润性生长胃癌中的表达呈下降趋势。本研究结果说明，TIMP2和Ⅳ型胶原可能具有抑制胃癌浸润和转移的作用，当TIMP2和Ⅳ型胶原表达降低时，金属蛋白酶，尤其是Ⅳ型胶原酶活性增加，降解肿瘤细胞外基质和基底膜，从而导致肿瘤细胞的浸润和转移发生。
, 百拇医药
参考文献
1，Mignattip. Biology and biochemistry of proteinase in tumor invasion. Physiolrev, 1993,73:161.
2，Levy AT, Cioce V, Sobel Me , et al . Increased expression of the Mr 72000 type collagenase in human colonic adnocarcinoma. Cancer Res. 1991, 51:439-441.
收稿日期：2000-03-25, http://www.100md.com
单位：封国生(100038 北京，铁道部北京铁路总医院普通外科)；谭毓铨(白求恩医科大学第一临床学院)
关键词：
中华医学杂志000714
近年来，金属蛋白酶( MMP)及其抑制物组织金属蛋白酶抑制因子( TIMP)与细胞外基质和基底膜在肿瘤浸润转移中的作用受到重视。 TIMP2是 TIMP 的一个亚型，Ⅳ型胶原是构成细胞外基质和基底膜的主要成分。我们采用原位杂交和免疫组织化学染色技术，检测了 TIMP2和Ⅳ型胶原在胃癌中的表达，旨在探讨它们与胃癌浸润转移的关系。
一、对象与方法
1.对象：本组病例来源于本院住院胃癌病人，共27例，其中男22例，女5例，平均年龄59岁±20岁，均经手术及术后病理确定诊断。27例胃癌标本均在手术切除时立即取材，正常对照组的标本取距离癌组织5 cm以外的胃粘膜。
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2.材料：TIMP2 cDNA探针，DACO公司生产。3H-dCTP 37 MBq/ml，购于上海原子核研究所。探针随机引物试验盒，原位交试剂盒，购于美国promaga公司，探针标记用随机引物法。抗Ⅳ型胶原单克隆抗体，ABC试剂盒，购于北京中山生物技术有限公司。
3.方法：(1)TIMP2原位杂交：杂交步骤：①0.5×SSC洗 3次×5 min,晾干,放入湿盒；②1 μg/ml蛋白酶K消化10 min，37℃；③0.5×SSC洗片1次,晾干；④加入新配制的含有体积分数为0.25%乙酰酐，0.1 mol/L三乙醇胺溶液(pH8.0)，浸泡10 min；⑤0.5×SSC洗2次，晾干；⑥加新配制的杂交液50 μl，盖片，置42℃温箱，16～18 h。(2)洗脱：①洗脱液Ⅰ洗3次×10 min，室温；②洗脱液Ⅱ洗3次×20 min，50℃；③洗脱液Ⅰ洗 3次×10 min，37℃；④洗脱液Ⅲ洗3次×20 min，37℃；⑤0.1×SSC洗3次×10 min；⑥乙醇梯度脱水，每次5 min，显影。(3)免疫组织化学染色法(ABC法)，染色流程按试剂盒说明进行。
, 百拇医药
4.结果判定： TIMP2原位杂交：由3人分别数取3个油镜视野细胞内阳性颗粒数，取其平均值作为单个油镜视野的阳性颗粒数。Ⅳ型胶原免疫组织化学染色，结果判定以Ⅳ型胶原在基底膜及间质分布情况作定性及半定量：基底膜缺失(-)或碎片状(+)为阴性；基底膜间断状(++)或连续线状(+++)为阳性。
5.统计学处理： TIMP2 mRNA表达阳性在每个油镜视野的颗粒数以
±s表示，用t检验或q检验(Newman-keuls法)作统计学处理。Ⅳ型胶原表达，用秩和检验或四格表确切概率法作统计学处理。二、结果
1. TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原在胃癌中的表达： TIMP2 mRNA在胃癌及相应正常组织中均有表达，阳性细胞内呈黑褐色细小颗粒状。Ⅳ型胶原在正常胃粘膜及部分胃癌组织中主要位于腺体基底膜及细胞外间质中，呈连续状或间断状。TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原在胃癌和正常组织中表达变化(表1)。
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表1 TIMP2、mRNA、Ⅳ型胶原在胃癌中的表达 组织
例数
TIMP2表达
(颗粒数，
±s)Ⅳ型胶原表达(例数)
-
+
++
+++
癌组织
27
, 百拇医药
166±84
6
12
6
3
正 常
27
125±45
0
5
8
14
注：TIMP2比较，t=1.73，P>0.05；Uc=3.969，P<0.001 2. TIMP2 mRNA及Ⅳ型胶原表达与胃癌浸润及转移的关系：按浸润程度把胃癌分为浸润浆膜和未浸润浆膜两组。结果显示，TIMP2 在无浸润浆膜组中的表达高于有浆膜浸润组(t=2.37，P<0.05)(图1)，Ⅳ型胶原在有浆膜浸润的胃癌中多表现为基底膜缺失或碎片状，而在无浆膜浸润组基底膜多呈间断状，或基本完整线状(P=0.011)(图2)。TIMP2 在有淋巴结转移胃癌中的表达明显低于无淋巴结转移组(t=2.98，P<0.01)，Ⅳ型胶原在有淋巴结转移的胃癌中大多数阴性染色或碎片状(P=0.036)。
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图1 TIMP2在胃癌中的高表达 原位杂交×100
图2 Ⅳ型胶原在无浆膜浸润及转移胃癌中的表达，可见基底膜完整 免疫组织化学染色×40
3. TIMP2 Ⅳ型胶原表达与胃癌大体类型及分化程度的关系(表2)。
表2 TIMP2、COⅣ表达与胃癌生长方式及分化程度的关系 胃癌类型
例数
TIMP2表达
(阳性颗粒性数，
±s), 百拇医药
Ⅳ型胶原表达(例数)
阴性
阳性
生长方式
肿块
5
175± 98
1(20)
4(80)
溃疡
16
148±103
12(75)
, 百拇医药
4(25)
浸润
6
127± 83*
5(83)
1(17)
分化程度
高分化
4
148± 98
1(25)
3(75)
中分化
, 百拇医药
16
158± 95
11(69)
5(21)
低分化
7
103± 49
6(86)
1(14)
注：与肿块组q=4.32，P<0.05；Ⅳ型胶原各组之间经秩和检验差异无显著意义；括号内为百分率(%)
三、讨论
MMP和TIMP之间的平衡是影响肿瘤浸润和转移的重要因素[1]。另外，癌细胞基底膜的破坏也与肿瘤细胞Ⅳ型胶原分泌减少有关[2]。在Ⅳ型胶原合成减少的同时，癌细胞Ⅳ型胶原酶的合成增加，TIMP分泌再减少，将使Ⅳ型胶原过度分解，从而导致癌细胞较容易穿透基底膜而发生浸润和转移。本结果显示，TIMP2在胃癌中的表达与正常胃粘膜组织相比有增高趋势，提示TIMP2表达水平增高可能为肿瘤细胞分泌所致。本研究表明，TIMP2在未浸润浆膜及无淋巴结转移胃癌中的表达明显高于已有浆膜浸润及淋巴结转移组；从肿瘤生长方式看，TIMP2在浸润性生长胃癌中的表达低于肿块型胃癌组。说明TIMP2可能有抑制胃癌浸润及转移的作用。Ⅳ型胶原在有浆膜浸润及淋巴结转移的胃癌中，染色多呈碎片状或阴性，基底膜缺失率为80%以上。而在无浆膜浸润及淋巴结转移的胃癌中可见基底膜基本完整，染色表现为基底膜呈间断状或连续状，癌巢周围基质可见阳性染色。从分化程度及生长方式来看，Ⅳ型胶原在低分化及浸润性生长胃癌中的表达呈下降趋势。本研究结果说明，TIMP2和Ⅳ型胶原可能具有抑制胃癌浸润和转移的作用，当TIMP2和Ⅳ型胶原表达降低时，金属蛋白酶，尤其是Ⅳ型胶原酶活性增加，降解肿瘤细胞外基质和基底膜，从而导致肿瘤细胞的浸润和转移发生。
, 百拇医药
参考文献
1，Mignattip. Biology and biochemistry of proteinase in tumor invasion. Physiolrev, 1993,73:161.
2，Levy AT, Cioce V, Sobel Me , et al . Increased expression of the Mr 72000 type collagenase in human colonic adnocarcinoma. Cancer Res. 1991, 51:439-441.
收稿日期：2000-03-25, http://www.100md.com