Schiff碱稀土金属配合物对辐射导致肿瘤细胞DNA损伤及修复的影响
作者：倪瑾 孟祥顺 蔡建明 李雨 闵锐 杨平 吴秋业 孔德源
单位：倪瑾 孟祥顺 蔡建明 李雨 闵锐 杨平 吴秋业(上海，第二军医大学 200433)；孔德源(上海药物研究所)
关键词：稀土金属配合物；Schiff碱；DNA双链断裂(dsb)及修复；脉冲电场凝胶电泳；放射增敏
中华放射医学与防护杂志000113 【摘要】 目的 Schiff碱具有抗瘤抑菌活性，其抗癌作用与其对肿瘤细胞DNA的破坏有关。方法 利用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的方法，观察了某种Schiff碱稀土金属化合物对肿瘤细胞DNA双链断裂及修复的影响。结果 该化合物能够增加辐射导致的DNA双链断裂的生成，并抑制其修复。结论 Schiff碱稀土金属配合物能提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，为开发放化疗修饰剂提供了新的研究方向。
Effects of rare earth complexes with Schiff base on
, http://www.100md.com
radiation-induced DNA damage and repair of tumor cells
NI Jin MENG Xiangshun CAI Jianming,et al.
(The Second Military University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To examine the effects of rare earth complexes with Schiff base on DNA double strand breaks and repair induced by radiation. Methods Using pulsed field gel electrophoresis (PFGE) to detect the DNA dsb induced by different dose irradiation,the integrated OD (Int OD%) of DNA migrated into the gel were measured by the software OneDScan of Biological Medical Electrophoresis Image Progress Analytic System (BMIPAS). Results LR1 treatment before irradiation could increase DNA dsb formation of SGC-7901 cells, and inhibit the process of DNA damage repair. Conclusion As a rare earth complex with Schiff base,LR1 can increase the radiosensitivity of SGC-7901 cells. For exploiting new radiochemotherapeutic modifiers,further research on these compounds is deserved.
, 百拇医药
【Key words】 Rare earth complex； Schiff base； DNA double strand break (dsb) and repair； Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)； Radiosensitization▲
自70年代初Schiff碱有良好的抗癌活性得到肯定以来，Schiff碱在抗癌药物的合成筛选方面占据相当重要的地位[1]。许多Schiff碱对人体贲门癌、肺癌、胃癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌等癌细胞具有良好的抑制作用。本实验采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的方法检测肿瘤细胞受照射后双链DNA断裂的形成[2，3]及Schiff碱稀土金属配合物对DNA双链断裂形成及修复的影响。并与经典化疗药物顺铂[4]对比，初步从DNA分子水平探讨了该类化合物的放射增敏作用和抗肿瘤活性。
材料和方法
, 百拇医药
1.细胞培养：SGC-7901细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置湿度100%，含体积分数为5%的CO2，37℃培养箱内贴壁培养至指数生长期进行实验，每周传代两次。
2.照射：本室60Co源，吸收剂量率1 Gy/min。
3.药物配制：Schiff碱稀土金属化合物LR1(化合物的合成另文发表)及顺铂(DDP，齐鲁制药厂)溶于无血清RPMI 1640培养液内，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，配制成不同浓度的新鲜药液备用。
4.细胞DNA双链断裂及修复测定
(1)细胞胶块制备及处理：收集对数生长期SGC-7901 细胞，制成均匀细胞悬液，调整细胞浓度至(106～108)个/ml，将细胞悬液(约80～160 μl)与事先融化1%低熔点琼脂以1：3充分混合，迅速分装于制胶槽中；置4℃冰箱冷却10 min，小心推出胶块至青霉素小瓶，不同浓度药物作用一定时间；修复实验时，照射细胞后继续在含药液的培养液中37℃保温修复不同时间。
, 百拇医药
(2)细胞DNA制备：照射完毕取出胶块，放入1 ml溶胞液中(EDTA 0.25 mol/L，Tris 10!mmol/L，SDS 1%，蛋白酶K 0.5 mg/ml,pH 8.0)，56℃水浴24～48 h，裂解结束后用4℃TE溶液洗3遍，或立即进行电泳，或置0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0) 4℃保存待用。
(3)琼脂糖凝胶电泳：称量1.2 g琼脂糖，加入160 ml TBE(1×)，微波炉高温120～150 s完全溶化，冷却至40℃以下，加入50 μl溴化乙锭(EB，1 mg/ml)，混均后倒入制胶槽中，4℃放置15 min，使胶块完全凝固；拔出梳子，小心塞入制备好的DNA胶块，并以少许溶化的0.75%琼脂糖封住胶孔，以防胶块滑出；待琼脂糖凝固后，将胶块放入相应电泳槽内，加入适量TBE缓冲液，以主电场1 V/cm，持续600 s；辅电场 1 V/cm，持续 300 s，电泳40～48 h。电泳环境温度为4℃。
(4)电泳凝胶图像摄取及DNA进胶光密度分析：将电泳胶块置紫外检测仪下，EB荧光激发，选择合适的焦距及曝光时间进行照相；相片以256级灰度，300点像数扫描；扫描结果用ONE-DSCAN凝胶电泳图谱图像分析系统进行分析。检测进胶DNA光密度值(A值)百分率，以此代表细胞DNA断裂程度。
, 百拇医药
5.统计处理：3次重复实验结果，各实验组和相应对照组之间进行组间均数t检验。
结 果
1.γ射线照射SGC-7901细胞产生的DNA双链断裂
在有氧条件下，用0～80 Gy照射SGC-7901细胞。实验共分3次电泳扫描分析所得DNA进胶部分的A值(%)。平均结果是：照射2 Gy时，DNA dsb形成为(11.3±2.8)%；6 Gy时为(18.6±3.6)%； 10 Gy时为(28.7±4.6)%；20 Gy时为(51.8±1.9)%；40 Gy时为(61.9±0.6)%； 60 Gy时为(68.7±3.7)%；80 Gy时为(81.2±3.2)%。由此可见，随着照射剂量的增加， DNA进胶比也逐渐增大，γ射线所致DNA双链断裂逐渐增多。
2.不同浓度LR1和DDP对SGC-7901细胞的放射增敏作用
, 百拇医药
将5×10-4～0.5 mmol/L LR1与SGC-7901细胞作用2 h后照射20 Gy。LR1浓度分别是5×10-4、5×10-3、0.01、0.025、0.05、0.25和0.5 mmol/L；并设不照射对照、单独照射对照、单独0.5 mmol/L LR1作用不同时间(2、10、24 h)对照。当LR1浓度≥0.01 mmol/L，射线对细胞DNA损伤有增强作用，且随着LR1浓度增加，DNA dsb也逐渐增加。LR1单独作用 SGC-7901细胞表现出其细胞毒性，作用2 h，DNA dsb生成并不明显 (5.7%±0.78%)，但随着作用时间的延长 (10～24 h)，DNA dsb不断增加，10 h DNA dsb生成 (54.7±1.8)%；作用24 h，DNA dsb生成 (64.2±0.21)%。图1为电泳结果EB染色照相。
图1 LR1对SGC-7901细胞DNA dsb形成的影响
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0=Marker; 1=no radiation; 2～4=0.5 mmol/L LR1 for 24 h, 10 h,2 h; 5=radiation without LR1; 6～12=irradiated 20 Gy with 5×10-4、 5×10-3、 0.01、 0.025、 0.05、 0.25、 0.5 mmol/L LR1 respectively
处理过程同上述，比较5×10-3～1 mmol/L的LR1和DDP对受照细胞DNA损伤的影响。单独照射对照组照射20 Gy，SGC-7901细胞的DNA形成率为 (51.3±2.1)%。而经LR1和DDP作用2 h的电泳结果EB荧光照相的扫描A值(%)如表1所示。当DDP浓度≥0.05 mmol/L时，可以增强DNA的放射损伤效应 (与对照组比，P<0.01)，该作用随着DDP浓度的增大而增强。而LR1在0.01 mmol/L浓度即表现出增敏作用。当浓度≥0.5 mmol/L时DDP与LR1的DNA损伤增强效应相近。
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表1 LR1 与DDP对SGC-7901细胞
DNA dsb形成的影响 药物浓度
(mmol/L)
DNA dsb形成率 (
±s)%
LR1
DDP
5×10-4
50.8±0.7
—
5×10-3
, 百拇医药
51.4±1.3
51.8±0.9
0.01
65.7±2.4*
51.2±1.1
0.025
69.2±0.6
—
0.05
70.3±1.5
65.7±1.4
0.25
, http://www.100md.com
72.3±1.9
—
0.5
79.9±0.2
80.6±3.3
1.0
82.6±0.8
83.4±1.7
注：与对照组比较，*P<0.01；— 表示未测 3. 0.5 mmol/L LR1对DNA损伤修复的影响
将经0.5 mmol/L LR1作用2 h的SGC-7901细胞有氧条件下照射40 Gy，在37℃保温修复不同时间后提取细胞DNA，并与单独照射组作对比。180度PFGE作用30 h，电泳结果如表2所示。经LR1作用相应时间的DNA损伤均比单独照射组多，说明LR1在0.5 mmol/L水平对DNA损伤修复有抑制作用。
, 百拇医药
表2 0.5 mmol/L LR1对辐射致DNA dsb
的修复抑制作用 修复时间
(min)
DNA dsb形成率 (±s)%
对照组
LR1组
0
61.8±1.9
82.6±0.7
15
54.4±2.8
, 百拇医药
66.5±1.4
30
37.5±1.6
63.4±3.1
60
24.3±0.4
59.1±2.3
120
20.8±1.9
55.6±0.9
180
18.7±2.2
, 百拇医药
49.3±2.6*
注：与对照组比较，*P<0.05讨 论
DNA是电离辐射和化学物质作用于生物的主要靶分子，DNA双链断裂(DNA dsb)及修复在辐射及抗肿瘤研究领域中占据十分重要的地位。DNA双链断裂及其修复的研究，从分子水平进一步阐明射线及一些化疗药物、增敏剂等的作用机理，并据此评价药物的基本效价和生物效应。许多抗癌药物，通过直接(如DDP或烷化剂)、间接(如VP-16通过抑制拓扑异构酶)作用，使肿瘤细胞DNA发生断裂，DNA模板功能丧失，从而杀伤肿瘤细胞[5，6]；也有研究表明，放射增敏剂，如CMNa、MISO等，能增加受照细胞DNA双链断裂，且修复过程受抑，提高癌细胞的死亡率，从而增强射线的杀伤效应[7]。
PFGE是分子生物学领域近年来发展起来的一项新技术，简便、灵敏，结果可靠。根据进胶DNA和残留孔内DNA用EB荧光激发的光密度，用凝胶电泳图谱图像分析软件分析对比这两部分相应的光密度，计算进胶DNA片段光密度的百分值，用以反映DNA双链断裂程度。此比值与DNA双链断裂的数目成正比。运用光密度比值计算DNA双链断裂程度，与3H标记法测(计数.min-1)值对比，两者无明显差异，且重复性好，避免了同位素操作，方法安全可行[8]。
, 百拇医药
用PFGE法对所合成的Schiff碱稀土金属配合物LR1进行了初步的研究，并与经典抗肿瘤药物DDP进行了比较。LR1表现出较好的射线增强效应(P<0.01)，LR1的射线增敏作用与其浓度有关，当浓度>10-2mmol/L，增加辐射致细胞DNA dsb形成，即对SGC-7901细胞表现出放射增敏效应；低于这个浓度，未观察到LR1的增敏作用。与DDP对比，LR1在较低浓度(10-2 mmol/L)即表现出增敏效应，而DDP在其浓度>5×10-2 mmol/L时增加DNA双链断裂的形成。单独LR1处理细胞，也提示较有意义的实验结果。由图可以看出，用LR1处理细胞不同时间，可以导致DNA dsb生成，尤其随着作用时间延长(10～24 h)，DNA dsb量明显增加，表现出LR1的细胞毒性作用，肿瘤细胞DNA发生断裂。这与文献报道Schiff碱稀土金属配合物抗肿瘤作用一致[9]。Schiff碱稀土化合物LR1具有一定的增敏作用，且随着作用时间的延长，继续破坏肿瘤细胞的DNA双链结构，表现出抗肿瘤活性。LR1的这一特性，对放化疗修饰剂的研究具有新的探索价值。
, 百拇医药
与正常细胞相比，肿瘤细胞增殖快，这也是肿瘤不易控制容易复发的原因之一。肿瘤细胞的快速增殖，与其DNA链断裂后的较强的修复能力有关。实验表明，正常细胞照射后保温1 h测得的dsb重接率只有15%，人白血病细胞HL-60的重接率69%，L7712细胞受照后保温2 h其DNA dsb可修复到照前水平[10]。本实验采用的SGC-7901细胞在保温180 min后，断裂的dsb几乎都被修复；而将0.5 mmol/L LR1与SGC-7901细胞一起保温作用不同时间，与单独照射组相比，LR1抑制其修复，保温180 min后，细胞DNA双链断裂与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。
DNA分子水平表明LR1既具有抗肿瘤作用，又能增强射线的生物效应，因此可进一步探讨该化合物对离体肿瘤细胞、整体动物的作用，以验证DNA分子水平的实验结果。LR1的这一特性为开发放化疗修饰剂提供了新的研究方向，在放化疗联合治疗肿瘤方面有良好的开发和应用前景。■
, 百拇医药
参考文献
[1]Hodnett ME,Mooney PD. Antitumor activities of some Schiff bases. J Med Chem,1970,13:786.
[2]周平坤，魏康.用脉冲电场凝胶电泳检测电离辐射所致哺乳动物DNA双链断裂.生物化学杂志，1991，7：513-517.
[3]李雨.Wortmannin (WT) 的辐射增敏作用及其机制研究.中华医学会放射医学与防护学分会第二次中青年专题研讨会论文汇编(光盘版)，大连，1999.
[4]胡璧.金属络合物用于放射增敏的研究进展.国外医学放射医学核医学分册，1995，19(2)：75-81.
[5]Ray S,Ponnathpur V,Huang Y,et al. Improved method for detection of internucleosomal DNA fragmentation. Cancer Chemother Pharmacol,1994,34:365-371.
, 百拇医药
[6]刘宗潮，谢冰芬，王理开，等.鬼臼乙叉甙对人鼻咽癌细胞CNE2的细胞毒作用和对DNA的断裂作用.中山医科大学学报，1993，14：234-235.
[7]Whitaker SJ,Ung YC,McMillan TJ. DNA double-strand break induction and rejoining as determinants of human tumor cell radiosensitivity: a pulsed-field gel electrophoresis study. Int J Radiat Biol,1995,67:7-18.
[8]Rosemann M,Kanon B,Konings AWT, et al. An image analysis technique for detection of radiation-induced DNA fragmentation after CHEF eletrophoresis. Int J Radiat Biol,1993,64:245-249.
[9]杨正银，艾军，王流芳，等.希夫碱稀土三元配合的合成、表征及抗肿瘤活性研究.兰州大学学报(自然科学版)，1993，29：162-166.
[10]孟祥顺，郑秀龙. DNA链断裂损伤修复及其修复酶.国外医学放射医学核医学分册，1989，13：241-246.
收稿日期:1999-09-08, 百拇医药
单位：倪瑾 孟祥顺 蔡建明 李雨 闵锐 杨平 吴秋业(上海，第二军医大学 200433)；孔德源(上海药物研究所)
关键词：稀土金属配合物；Schiff碱；DNA双链断裂(dsb)及修复；脉冲电场凝胶电泳；放射增敏
中华放射医学与防护杂志000113 【摘要】 目的 Schiff碱具有抗瘤抑菌活性，其抗癌作用与其对肿瘤细胞DNA的破坏有关。方法 利用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的方法，观察了某种Schiff碱稀土金属化合物对肿瘤细胞DNA双链断裂及修复的影响。结果 该化合物能够增加辐射导致的DNA双链断裂的生成，并抑制其修复。结论 Schiff碱稀土金属配合物能提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，为开发放化疗修饰剂提供了新的研究方向。
Effects of rare earth complexes with Schiff base on
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radiation-induced DNA damage and repair of tumor cells
NI Jin MENG Xiangshun CAI Jianming,et al.
(The Second Military University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To examine the effects of rare earth complexes with Schiff base on DNA double strand breaks and repair induced by radiation. Methods Using pulsed field gel electrophoresis (PFGE) to detect the DNA dsb induced by different dose irradiation,the integrated OD (Int OD%) of DNA migrated into the gel were measured by the software OneDScan of Biological Medical Electrophoresis Image Progress Analytic System (BMIPAS). Results LR1 treatment before irradiation could increase DNA dsb formation of SGC-7901 cells, and inhibit the process of DNA damage repair. Conclusion As a rare earth complex with Schiff base,LR1 can increase the radiosensitivity of SGC-7901 cells. For exploiting new radiochemotherapeutic modifiers,further research on these compounds is deserved.
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【Key words】 Rare earth complex； Schiff base； DNA double strand break (dsb) and repair； Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)； Radiosensitization▲
自70年代初Schiff碱有良好的抗癌活性得到肯定以来，Schiff碱在抗癌药物的合成筛选方面占据相当重要的地位[1]。许多Schiff碱对人体贲门癌、肺癌、胃癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌等癌细胞具有良好的抑制作用。本实验采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的方法检测肿瘤细胞受照射后双链DNA断裂的形成[2，3]及Schiff碱稀土金属配合物对DNA双链断裂形成及修复的影响。并与经典化疗药物顺铂[4]对比，初步从DNA分子水平探讨了该类化合物的放射增敏作用和抗肿瘤活性。
材料和方法
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1.细胞培养：SGC-7901细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置湿度100%，含体积分数为5%的CO2，37℃培养箱内贴壁培养至指数生长期进行实验，每周传代两次。
2.照射：本室60Co源，吸收剂量率1 Gy/min。
3.药物配制：Schiff碱稀土金属化合物LR1(化合物的合成另文发表)及顺铂(DDP，齐鲁制药厂)溶于无血清RPMI 1640培养液内，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，配制成不同浓度的新鲜药液备用。
4.细胞DNA双链断裂及修复测定
(1)细胞胶块制备及处理：收集对数生长期SGC-7901 细胞，制成均匀细胞悬液，调整细胞浓度至(106～108)个/ml，将细胞悬液(约80～160 μl)与事先融化1%低熔点琼脂以1：3充分混合，迅速分装于制胶槽中；置4℃冰箱冷却10 min，小心推出胶块至青霉素小瓶，不同浓度药物作用一定时间；修复实验时，照射细胞后继续在含药液的培养液中37℃保温修复不同时间。
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(2)细胞DNA制备：照射完毕取出胶块，放入1 ml溶胞液中(EDTA 0.25 mol/L，Tris 10!mmol/L，SDS 1%，蛋白酶K 0.5 mg/ml,pH 8.0)，56℃水浴24～48 h，裂解结束后用4℃TE溶液洗3遍，或立即进行电泳，或置0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0) 4℃保存待用。
(3)琼脂糖凝胶电泳：称量1.2 g琼脂糖，加入160 ml TBE(1×)，微波炉高温120～150 s完全溶化，冷却至40℃以下，加入50 μl溴化乙锭(EB，1 mg/ml)，混均后倒入制胶槽中，4℃放置15 min，使胶块完全凝固；拔出梳子，小心塞入制备好的DNA胶块，并以少许溶化的0.75%琼脂糖封住胶孔，以防胶块滑出；待琼脂糖凝固后，将胶块放入相应电泳槽内，加入适量TBE缓冲液，以主电场1 V/cm，持续600 s；辅电场 1 V/cm，持续 300 s，电泳40～48 h。电泳环境温度为4℃。
(4)电泳凝胶图像摄取及DNA进胶光密度分析：将电泳胶块置紫外检测仪下，EB荧光激发，选择合适的焦距及曝光时间进行照相；相片以256级灰度，300点像数扫描；扫描结果用ONE-DSCAN凝胶电泳图谱图像分析系统进行分析。检测进胶DNA光密度值(A值)百分率，以此代表细胞DNA断裂程度。
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5.统计处理：3次重复实验结果，各实验组和相应对照组之间进行组间均数t检验。
结 果
1.γ射线照射SGC-7901细胞产生的DNA双链断裂
在有氧条件下，用0～80 Gy照射SGC-7901细胞。实验共分3次电泳扫描分析所得DNA进胶部分的A值(%)。平均结果是：照射2 Gy时，DNA dsb形成为(11.3±2.8)%；6 Gy时为(18.6±3.6)%； 10 Gy时为(28.7±4.6)%；20 Gy时为(51.8±1.9)%；40 Gy时为(61.9±0.6)%； 60 Gy时为(68.7±3.7)%；80 Gy时为(81.2±3.2)%。由此可见，随着照射剂量的增加， DNA进胶比也逐渐增大，γ射线所致DNA双链断裂逐渐增多。
2.不同浓度LR1和DDP对SGC-7901细胞的放射增敏作用
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将5×10-4～0.5 mmol/L LR1与SGC-7901细胞作用2 h后照射20 Gy。LR1浓度分别是5×10-4、5×10-3、0.01、0.025、0.05、0.25和0.5 mmol/L；并设不照射对照、单独照射对照、单独0.5 mmol/L LR1作用不同时间(2、10、24 h)对照。当LR1浓度≥0.01 mmol/L，射线对细胞DNA损伤有增强作用，且随着LR1浓度增加，DNA dsb也逐渐增加。LR1单独作用 SGC-7901细胞表现出其细胞毒性，作用2 h，DNA dsb生成并不明显 (5.7%±0.78%)，但随着作用时间的延长 (10～24 h)，DNA dsb不断增加，10 h DNA dsb生成 (54.7±1.8)%；作用24 h，DNA dsb生成 (64.2±0.21)%。图1为电泳结果EB染色照相。
图1 LR1对SGC-7901细胞DNA dsb形成的影响
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0=Marker; 1=no radiation; 2～4=0.5 mmol/L LR1 for 24 h, 10 h,2 h; 5=radiation without LR1; 6～12=irradiated 20 Gy with 5×10-4、 5×10-3、 0.01、 0.025、 0.05、 0.25、 0.5 mmol/L LR1 respectively
处理过程同上述，比较5×10-3～1 mmol/L的LR1和DDP对受照细胞DNA损伤的影响。单独照射对照组照射20 Gy，SGC-7901细胞的DNA形成率为 (51.3±2.1)%。而经LR1和DDP作用2 h的电泳结果EB荧光照相的扫描A值(%)如表1所示。当DDP浓度≥0.05 mmol/L时，可以增强DNA的放射损伤效应 (与对照组比，P<0.01)，该作用随着DDP浓度的增大而增强。而LR1在0.01 mmol/L浓度即表现出增敏作用。当浓度≥0.5 mmol/L时DDP与LR1的DNA损伤增强效应相近。
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表1 LR1 与DDP对SGC-7901细胞
DNA dsb形成的影响 药物浓度
(mmol/L)
DNA dsb形成率 (
±s)%LR1
DDP
5×10-4
50.8±0.7
—
5×10-3
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51.4±1.3
51.8±0.9
0.01
65.7±2.4*
51.2±1.1
0.025
69.2±0.6
—
0.05
70.3±1.5
65.7±1.4
0.25
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72.3±1.9
—
0.5
79.9±0.2
80.6±3.3
1.0
82.6±0.8
83.4±1.7
注：与对照组比较，*P<0.01；— 表示未测 3. 0.5 mmol/L LR1对DNA损伤修复的影响
将经0.5 mmol/L LR1作用2 h的SGC-7901细胞有氧条件下照射40 Gy，在37℃保温修复不同时间后提取细胞DNA，并与单独照射组作对比。180度PFGE作用30 h，电泳结果如表2所示。经LR1作用相应时间的DNA损伤均比单独照射组多，说明LR1在0.5 mmol/L水平对DNA损伤修复有抑制作用。
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表2 0.5 mmol/L LR1对辐射致DNA dsb
的修复抑制作用 修复时间
(min)
DNA dsb形成率 (
±s)%对照组
LR1组
0
61.8±1.9
82.6±0.7
15
54.4±2.8
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66.5±1.4
30
37.5±1.6
63.4±3.1
60
24.3±0.4
59.1±2.3
120
20.8±1.9
55.6±0.9
180
18.7±2.2
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49.3±2.6*
注：与对照组比较，*P<0.05讨 论
DNA是电离辐射和化学物质作用于生物的主要靶分子，DNA双链断裂(DNA dsb)及修复在辐射及抗肿瘤研究领域中占据十分重要的地位。DNA双链断裂及其修复的研究，从分子水平进一步阐明射线及一些化疗药物、增敏剂等的作用机理，并据此评价药物的基本效价和生物效应。许多抗癌药物，通过直接(如DDP或烷化剂)、间接(如VP-16通过抑制拓扑异构酶)作用，使肿瘤细胞DNA发生断裂，DNA模板功能丧失，从而杀伤肿瘤细胞[5，6]；也有研究表明，放射增敏剂，如CMNa、MISO等，能增加受照细胞DNA双链断裂，且修复过程受抑，提高癌细胞的死亡率，从而增强射线的杀伤效应[7]。
PFGE是分子生物学领域近年来发展起来的一项新技术，简便、灵敏，结果可靠。根据进胶DNA和残留孔内DNA用EB荧光激发的光密度，用凝胶电泳图谱图像分析软件分析对比这两部分相应的光密度，计算进胶DNA片段光密度的百分值，用以反映DNA双链断裂程度。此比值与DNA双链断裂的数目成正比。运用光密度比值计算DNA双链断裂程度，与3H标记法测(计数.min-1)值对比，两者无明显差异，且重复性好，避免了同位素操作，方法安全可行[8]。
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用PFGE法对所合成的Schiff碱稀土金属配合物LR1进行了初步的研究，并与经典抗肿瘤药物DDP进行了比较。LR1表现出较好的射线增强效应(P<0.01)，LR1的射线增敏作用与其浓度有关，当浓度>10-2mmol/L，增加辐射致细胞DNA dsb形成，即对SGC-7901细胞表现出放射增敏效应；低于这个浓度，未观察到LR1的增敏作用。与DDP对比，LR1在较低浓度(10-2 mmol/L)即表现出增敏效应，而DDP在其浓度>5×10-2 mmol/L时增加DNA双链断裂的形成。单独LR1处理细胞，也提示较有意义的实验结果。由图可以看出，用LR1处理细胞不同时间，可以导致DNA dsb生成，尤其随着作用时间延长(10～24 h)，DNA dsb量明显增加，表现出LR1的细胞毒性作用，肿瘤细胞DNA发生断裂。这与文献报道Schiff碱稀土金属配合物抗肿瘤作用一致[9]。Schiff碱稀土化合物LR1具有一定的增敏作用，且随着作用时间的延长，继续破坏肿瘤细胞的DNA双链结构，表现出抗肿瘤活性。LR1的这一特性，对放化疗修饰剂的研究具有新的探索价值。
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与正常细胞相比，肿瘤细胞增殖快，这也是肿瘤不易控制容易复发的原因之一。肿瘤细胞的快速增殖，与其DNA链断裂后的较强的修复能力有关。实验表明，正常细胞照射后保温1 h测得的dsb重接率只有15%，人白血病细胞HL-60的重接率69%，L7712细胞受照后保温2 h其DNA dsb可修复到照前水平[10]。本实验采用的SGC-7901细胞在保温180 min后，断裂的dsb几乎都被修复；而将0.5 mmol/L LR1与SGC-7901细胞一起保温作用不同时间，与单独照射组相比，LR1抑制其修复，保温180 min后，细胞DNA双链断裂与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。
DNA分子水平表明LR1既具有抗肿瘤作用，又能增强射线的生物效应，因此可进一步探讨该化合物对离体肿瘤细胞、整体动物的作用，以验证DNA分子水平的实验结果。LR1的这一特性为开发放化疗修饰剂提供了新的研究方向，在放化疗联合治疗肿瘤方面有良好的开发和应用前景。■
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参考文献
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收稿日期:1999-09-08, 百拇医药