姜黄素联用γ-IFN对Cyclin D3、P27kip1在HL-60细胞增殖中的影响
作者：陈燕 吴裕丹 陈文娟 李惠玉 喻冬姣
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院、血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000918 姜黄素能有效地抑制HL-60细胞的增殖,其机制可涉及姜黄素干扰HL-60细胞周期、诱导细胞凋亡。进一步研究表明姜黄素与γ-干扰素(γ-IFN)联用有协同作用,其抑制效率远远超过单用其中的一种[1]。细胞增殖调节分子研究的最新成果显示，正性调控分子Cyclin D3和负性调控分子P27kip1的表达状态对肿瘤细胞的异常增殖可能起重要的作用。故我们联用姜黄素和γ-IFN对Cyclin D3和P27kipl在细胞增殖作用上的影响进行了研究。
材料和方法
, 百拇医药
1 主要试剂 姜黄素和5-溴脲嘧啶(5-Brdu)及鼠抗人Brdu单抗购自Sigma公司。γ-IFN由上海克隆生物高技术有限公司惠赠,活性为1×104IU/mg蛋白。鼠抗人Cyclin D3单抗和鼠抗人P27kip1单抗购自Pharmagin公司。FITC标记的羊抗鼠二抗购自天津中国医学科学院血液学研究所科技公司。缺口末端标记TUNEL试剂盒购自宝灵曼公司。HL-60细胞系来自英国癌症协会保存中心。
2 细胞系的培养及处理 HL-60细胞用含体积分数为10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液常规传代培养,倍增时间约为24h,姜黄素用磷酸缓冲液配成浓度为5mmol/L溶液,-20℃保存,临用前解冻,处理细胞时终浓度为5，10，25μmol/L,γ-IFN的终浓度为100，1000，2000IU/L。
3 细胞增殖功能检测 对数生长的细胞以2×106/ml接种于培养瓶中,经不同浓度姜黄素和/或γ-IFN处理6～24h,锥虫蓝(台盼蓝)染色后计数,试验重复三次。
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两个单药合用后是否有效按下列公式计算q值：
q=E(A+B)/[EA+(1-EA)EB],E(A+B)为两药合用抑制率;EA和EB为各药单用的抑制率；q>1.15 表示两药作用协同，q<0.85表示两药作用拮抗。
4 细胞DNA合成率的检测 药物处理的HL-60细胞在收获前1h加入终浓度为50μmol/L 的Brdu，经洗涤后制片、固定、变性，加入抗Brdu(1∶300)抗体，用SABC法测定阳性细胞百分率。
5 CyclinD3和P27kip1表达量的检测 细胞固定于-20℃乙醇中24h，再用含2.5 g/L曲拉通的磷酸缓冲液在冰上处理7min，加入抗CyclinD3或抗P27kip1抗体于4℃过夜，再经FITC标记的羊抗小鼠二抗桥联60min，加入RNA酶和碘化丙锭染色液，用流式细胞术同时检测CyclinD3或抗P27kip1和DNA含量，同型IgG1抗体作平行对照。
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6 TUNEL检测 TUNEL检测按试剂盒说明书进行操作，即细胞涂片经固定后透化，加入50μlTUNEL反应液，经POD转化后，DAB显色，用甲基绿或苏木青反染，细胞核着棕色者为阳性细胞，计算阳性细胞百分率。
结果
1 姜黄素对HL-60细胞增殖的影响 细胞经5，10，25μmol/L姜黄素处理18h，细胞增殖抑制率分别为(4.7±1.2)%，(18.0±2.0)%，(37.5±2.4)%；而处理24h后，增殖抑制率分别达到(6.3±1.9)%,(25.0±2.2)%,(43.8±2.0)%,分别增至1.39，1.38和1.16倍，在18h和24h两个时间点，10μmol/L组抑制率同25μmol/L 组的结果相比差异有显著性(t<0.05)，说明姜黄素以时间、计量依赖方式抑制细胞的增殖。
2 姜黄素与γ-IFN联用对HL-60细胞增殖的影响 在100，1000，2000IU γ-IFN处理细胞24h，增殖抑制率分别为(10.0±3.0)%，(21.3±2.4)%，(26.1±1.8)%,当不同浓度的γ-IFN与25μmol/L姜黄素联用后，抗增殖作用明显增强80%以上。q值分别为2.04，1.47，1.36。在所检测的γ-IFN浓度范围内，观察到联合增殖抑制率不依赖于γ-IFN浓度。
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3 联用对细胞周期及DNA合成率的影响 从DNA分布图中得知：单用姜黄素组的S期细胞百分率由(55.15±1.93)%降至(32.22±0.25)%,而G1期细胞百分率由(38.44±1.13)%增加到(47.55±2.89)%,γ-IFN组各期细胞百分率变化却不明显,联用组的DNA含量变化同姜黄素组的结果相近。γ-IFN以剂量依赖性方式轻度抑制Brdu摄取率,γ-IFN三个组其值分别为(39.66±2.13)%、(26.12±3.51)%，(21.30±2.89)%。姜黄素组的Brdu摄取率为(15.00±3.00)%,与对照组(50.00±1.00)%相比抑制率达90%,而联用组的摄取率均低于(3.00±0.53)%,与其他各组比较均有显著性差异(P<0.05)。
4 联用对凋亡的影响 姜黄素以时间依赖方式诱发细胞凋亡,γ-IFN促进了姜黄素诱导细胞凋亡的能力,凋亡率比单用姜黄素组增加了20%～50%(表1),而单用组凋亡率与空白对照组的自发凋亡率相似。
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表1 姜黄素和γ-IFN单独及联用时对HL-60细胞凋亡率和Cyclin D3和P27kip1表达的影响 组别
亚G1峰值
TUNEL阳性率(%)
Cyclin D3表达率(%)
P27kip1表达率(%)
对照组
1.95±0.11
1.00±0.57
44.09±4.42
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8.08±3.22
γ-IFN组(1000 IU)
3.26±1.44
1.87±0.99
40.11±4.32
36.05±2.19*
姜黄素组(25μmol/L)
14.09±1.39*
15.33±1.53*
25.97±2.71*
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29.96±2.19*
联用组
19.33±1.29*△
21.33±2.51*△
1.13±3.61*
60.53±1.18*
注：①作用时间为24h；②联用组姜黄素为25μmol/L、γ-IFN为1000U；③*与对照组相比，P<0.01； △与单用姜黄素组相比，P<0.055 联用对HL-60细胞表达CyclinD3及P27kip1的影响 姜黄素同γ-IFN联用后，总CyclinD3表达几乎被完全抑制。与CyclinD3表达状况相反，姜黄素与γ-IFN联用后，P27kip1表达量增加7.49倍(表1)。
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讨论
姜黄素其药理作用广泛，主要特性为抗炎和抗氧化。本研究结果显示姜黄素能有效地抑制HL-60细胞的增殖，其抗增殖作用与时间、剂量呈依赖关系。
姜黄素和γ-IFN均属于低毒无诱变性类药物，可耐受剂量大，加上姜黄素本身又具有抗炎特性和γ-IFN的抗病毒特性，因而治疗后感染率低。同时，姜黄素来源广泛，价格低，小剂量γ-IFN亦易被患者的经济条件所承受，因而此联用方案更具临床选择优势，适于临床推广。
我们的研究显示在姜黄素作用下，总CyclinD3表达水平下降，这种调节呈全周期时相性。与γ-IFN联用后，CyclinD3表达几乎完全抑制；与此同时，姜黄素又增强了P27kip1的表达，联用使P27kip1表达增至对照组的7倍以上。CyclinD3低表达和P27kip1高表达必上调G1/S转换检测点的功能。使细胞由G1期进入S期的速度减缓。实验结果中姜黄素组与联用组的S期细胞减少，Brdu摄取率减低，G1/G0期细胞增多就恰好反映出细胞周期进程被阻滞G1/G0期。进而DNA组方图中亚G1峰的出现提示我们被阻滞的细胞有可能被诱导走向凋亡，为此采用TUNEL技术检测证实了推测，表明姜黄素同时具备诱导HL-60细胞凋亡的能力。此能力也在姜黄素作用于其他肿瘤细胞系的试验中得到证实[2]。
, 百拇医药
综上所述，姜黄素可有效地抑制HL-60细胞增殖，其机制为下调CyclinD3和上调P27kip1的表达，导致G1/S转换检测点功能的上调，进而减缓细胞周期进程并诱导细胞凋亡。γ-IFN与姜黄素联用，则进一步加强了这种潜能。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770934)
参 考 文 献
1，吴裕丹，陈燕，陈文娟，等.γ-干扰素对姜黄素抑制HL-60细胞增殖的影响. J Tongji Med Unver, 1999,19:344-346.
2，Jiang MC,Yang-Yen HF, Yen JJ， et al. Curcumin induces apoptosis in immortalized NIH3T and malignant cancer cell lines. Nutr Cancer,1996,26:111-120.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院、血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000918 姜黄素能有效地抑制HL-60细胞的增殖,其机制可涉及姜黄素干扰HL-60细胞周期、诱导细胞凋亡。进一步研究表明姜黄素与γ-干扰素(γ-IFN)联用有协同作用,其抑制效率远远超过单用其中的一种[1]。细胞增殖调节分子研究的最新成果显示，正性调控分子Cyclin D3和负性调控分子P27kip1的表达状态对肿瘤细胞的异常增殖可能起重要的作用。故我们联用姜黄素和γ-IFN对Cyclin D3和P27kipl在细胞增殖作用上的影响进行了研究。
材料和方法
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1 主要试剂 姜黄素和5-溴脲嘧啶(5-Brdu)及鼠抗人Brdu单抗购自Sigma公司。γ-IFN由上海克隆生物高技术有限公司惠赠,活性为1×104IU/mg蛋白。鼠抗人Cyclin D3单抗和鼠抗人P27kip1单抗购自Pharmagin公司。FITC标记的羊抗鼠二抗购自天津中国医学科学院血液学研究所科技公司。缺口末端标记TUNEL试剂盒购自宝灵曼公司。HL-60细胞系来自英国癌症协会保存中心。
2 细胞系的培养及处理 HL-60细胞用含体积分数为10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液常规传代培养,倍增时间约为24h,姜黄素用磷酸缓冲液配成浓度为5mmol/L溶液,-20℃保存,临用前解冻,处理细胞时终浓度为5，10，25μmol/L,γ-IFN的终浓度为100，1000，2000IU/L。
3 细胞增殖功能检测 对数生长的细胞以2×106/ml接种于培养瓶中,经不同浓度姜黄素和/或γ-IFN处理6～24h,锥虫蓝(台盼蓝)染色后计数,试验重复三次。
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两个单药合用后是否有效按下列公式计算q值：
q=E(A+B)/[EA+(1-EA)EB],E(A+B)为两药合用抑制率;EA和EB为各药单用的抑制率；q>1.15 表示两药作用协同，q<0.85表示两药作用拮抗。
4 细胞DNA合成率的检测 药物处理的HL-60细胞在收获前1h加入终浓度为50μmol/L 的Brdu，经洗涤后制片、固定、变性，加入抗Brdu(1∶300)抗体，用SABC法测定阳性细胞百分率。
5 CyclinD3和P27kip1表达量的检测 细胞固定于-20℃乙醇中24h，再用含2.5 g/L曲拉通的磷酸缓冲液在冰上处理7min，加入抗CyclinD3或抗P27kip1抗体于4℃过夜，再经FITC标记的羊抗小鼠二抗桥联60min，加入RNA酶和碘化丙锭染色液，用流式细胞术同时检测CyclinD3或抗P27kip1和DNA含量，同型IgG1抗体作平行对照。
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6 TUNEL检测 TUNEL检测按试剂盒说明书进行操作，即细胞涂片经固定后透化，加入50μlTUNEL反应液，经POD转化后，DAB显色，用甲基绿或苏木青反染，细胞核着棕色者为阳性细胞，计算阳性细胞百分率。
结果
1 姜黄素对HL-60细胞增殖的影响 细胞经5，10，25μmol/L姜黄素处理18h，细胞增殖抑制率分别为(4.7±1.2)%，(18.0±2.0)%，(37.5±2.4)%；而处理24h后，增殖抑制率分别达到(6.3±1.9)%,(25.0±2.2)%,(43.8±2.0)%,分别增至1.39，1.38和1.16倍，在18h和24h两个时间点，10μmol/L组抑制率同25μmol/L 组的结果相比差异有显著性(t<0.05)，说明姜黄素以时间、计量依赖方式抑制细胞的增殖。
2 姜黄素与γ-IFN联用对HL-60细胞增殖的影响 在100，1000，2000IU γ-IFN处理细胞24h，增殖抑制率分别为(10.0±3.0)%，(21.3±2.4)%，(26.1±1.8)%,当不同浓度的γ-IFN与25μmol/L姜黄素联用后，抗增殖作用明显增强80%以上。q值分别为2.04，1.47，1.36。在所检测的γ-IFN浓度范围内，观察到联合增殖抑制率不依赖于γ-IFN浓度。
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3 联用对细胞周期及DNA合成率的影响 从DNA分布图中得知：单用姜黄素组的S期细胞百分率由(55.15±1.93)%降至(32.22±0.25)%,而G1期细胞百分率由(38.44±1.13)%增加到(47.55±2.89)%,γ-IFN组各期细胞百分率变化却不明显,联用组的DNA含量变化同姜黄素组的结果相近。γ-IFN以剂量依赖性方式轻度抑制Brdu摄取率,γ-IFN三个组其值分别为(39.66±2.13)%、(26.12±3.51)%，(21.30±2.89)%。姜黄素组的Brdu摄取率为(15.00±3.00)%,与对照组(50.00±1.00)%相比抑制率达90%,而联用组的摄取率均低于(3.00±0.53)%,与其他各组比较均有显著性差异(P<0.05)。
4 联用对凋亡的影响 姜黄素以时间依赖方式诱发细胞凋亡,γ-IFN促进了姜黄素诱导细胞凋亡的能力,凋亡率比单用姜黄素组增加了20%～50%(表1),而单用组凋亡率与空白对照组的自发凋亡率相似。
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表1 姜黄素和γ-IFN单独及联用时对HL-60细胞凋亡率和Cyclin D3和P27kip1表达的影响 组别
亚G1峰值
TUNEL阳性率(%)
Cyclin D3表达率(%)
P27kip1表达率(%)
对照组
1.95±0.11
1.00±0.57
44.09±4.42
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γ-IFN组(1000 IU)
3.26±1.44
1.87±0.99
40.11±4.32
36.05±2.19*
姜黄素组(25μmol/L)
14.09±1.39*
15.33±1.53*
25.97±2.71*
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29.96±2.19*
联用组
19.33±1.29*△
21.33±2.51*△
1.13±3.61*
60.53±1.18*
注：①作用时间为24h；②联用组姜黄素为25μmol/L、γ-IFN为1000U；③*与对照组相比，P<0.01； △与单用姜黄素组相比，P<0.055 联用对HL-60细胞表达CyclinD3及P27kip1的影响 姜黄素同γ-IFN联用后，总CyclinD3表达几乎被完全抑制。与CyclinD3表达状况相反，姜黄素与γ-IFN联用后，P27kip1表达量增加7.49倍(表1)。
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姜黄素其药理作用广泛，主要特性为抗炎和抗氧化。本研究结果显示姜黄素能有效地抑制HL-60细胞的增殖，其抗增殖作用与时间、剂量呈依赖关系。
姜黄素和γ-IFN均属于低毒无诱变性类药物，可耐受剂量大，加上姜黄素本身又具有抗炎特性和γ-IFN的抗病毒特性，因而治疗后感染率低。同时，姜黄素来源广泛，价格低，小剂量γ-IFN亦易被患者的经济条件所承受，因而此联用方案更具临床选择优势，适于临床推广。
我们的研究显示在姜黄素作用下，总CyclinD3表达水平下降，这种调节呈全周期时相性。与γ-IFN联用后，CyclinD3表达几乎完全抑制；与此同时，姜黄素又增强了P27kip1的表达，联用使P27kip1表达增至对照组的7倍以上。CyclinD3低表达和P27kip1高表达必上调G1/S转换检测点的功能。使细胞由G1期进入S期的速度减缓。实验结果中姜黄素组与联用组的S期细胞减少，Brdu摄取率减低，G1/G0期细胞增多就恰好反映出细胞周期进程被阻滞G1/G0期。进而DNA组方图中亚G1峰的出现提示我们被阻滞的细胞有可能被诱导走向凋亡，为此采用TUNEL技术检测证实了推测，表明姜黄素同时具备诱导HL-60细胞凋亡的能力。此能力也在姜黄素作用于其他肿瘤细胞系的试验中得到证实[2]。
, 百拇医药
综上所述，姜黄素可有效地抑制HL-60细胞增殖，其机制为下调CyclinD3和上调P27kip1的表达，导致G1/S转换检测点功能的上调，进而减缓细胞周期进程并诱导细胞凋亡。γ-IFN与姜黄素联用，则进一步加强了这种潜能。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770934)
参 考 文 献
1，吴裕丹，陈燕，陈文娟，等.γ-干扰素对姜黄素抑制HL-60细胞增殖的影响. J Tongji Med Unver, 1999,19:344-346.
2，Jiang MC,Yang-Yen HF, Yen JJ， et al. Curcumin induces apoptosis in immortalized NIH3T and malignant cancer cell lines. Nutr Cancer,1996,26:111-120.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com