IL1，TGF β和BMP在骨性关节炎的关节软骨中的表达*
作者：滕华建 曲绵域 林宗智 康 勇 张美荣 刘 燕
单位：滕华建 曲绵域 林宗智 康 勇 张美荣 刘 燕 (北京医科大学运动医学研究(100083))
关键词：骨性关节炎；软骨；细胞因子
IL1 提要 采用免疫组织化学染色技术，检测白细胞介素1(IL1)，转化生长因子β(TGF β)和骨形态发生蛋白(BMP)在骨性关节炎的关节软骨中的表达。结果显示：(1)IL1与TGF β在病损的关节软骨表浅层细胞中表达，TGF β还在病损的关节软骨中由发生簇集的软骨细胞表达。(2)在关节软骨病损达软骨下骨部位，BMP，TGF β和IL1在新生的软骨组织的一些细胞中表达。我们的结果提示，IL1，TGF β和BMP以自分泌和(或)旁分泌的形式，在骨性关节炎的病理过程中起重要作用，涉及关节软骨的病损及修复。
Expressions of IL1,TGF β and BMP in osteoarthritic cartilage
, http://www.100md.com
Teng Huajian,Qu Mianyu,Lin Zhongzi,et al.
Institute of Sports Medicine,Beijing Medical University,100083
The expressions of Interleukin-1(IL1),transfroming growth factor-β(TGF β)and bone morphogenetic protein (BMP) were examined in osteoarthritic cartilage by immunohisochemical staining technique.Results:(1)The expressions of IL1 and TGF β were shown in chondrocytes which presented in superficial layer of articular cartilage,TGF β was also found in chondrocytes which were as clusters in articular cartilage. (2) The expressions of BMP,TGF β and IL1 were observed in some cells of neoformative cartilage tissue where the articular cartilage presented a complete erosion. Our data indicated that IL1,TGF β and BMP played an important role in the pathologic process of osteoarthritis,involved in both repairing and damaging of cartilage by paracrine and/or autocrine mechanisms.
, 百拇医药
Key Words:osteoarthritic,cartilage
关节软骨病损是骨性关节炎的主要病理改变。成人的关节软骨无血管、淋巴和神经支配，且关节软骨细胞增殖能力很弱，一旦关节软骨发生病损，难以自身修复，这给临床对软骨病损的治疗带来很大的困难，因此，有关软骨病损机制的研究，一直是人们关注的焦点。
白细胞介素1(IL1)是一种重要的炎症调节因子，主要由淋巴细胞产生，软骨细胞也可分泌IL1，有证据表明，IL1与骨性关节炎、类风湿关节炎的关节软骨病损有关[1]。转化生长因子β(TGF β)能促进多种细胞增殖及细胞外基质成份的合成，包括软骨细胞。体内TGF β能刺激骨与软骨形成，软骨细胞、成骨细胞及骨膜细胞都可表达TGF β[5]。骨形态发生蛋白(BMP)是一种能体内异位诱导化骨与软骨的蛋白因子，免疫组化研究证明，BMP可由间充质细胞、软骨细胞和成骨细胞产生[2]。为探查BMP、TGF β和IL1在骨性关节炎的关节软骨中的表达，以探讨它们可能起的作用，进行了本项研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本的来源与制作
骨性关节炎病理标本来源于人工膝关节置换术及全髌骨切除术，共计9例。取正常关节软骨作对照。所有标本均经10%的中性福尔马林固定，含骨组织的标本，经10%的甲酸/0.05%氯化钠/10福尔马林溶液中脱钙，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，5μm切片以备染色。
1.2 方法
主要试剂：IL1 β兔抗人多克隆抗体，购自美国GIBCO公司。TGF β1兔抗人多克隆抗体，由美国NIH Kathy Flanders博士惠赠；牛BMP单克隆抗体购自第四军医大学；生物素化兔抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG和ABC液均为美国DAKO公司产品。
兔疫组化染色流程：切片脱蜡水化；0.6%甲醇/双氧水中30min；0.025%胰蛋白消化30min；正常牛血清封闭30min后倾去；分别滴加兔抗人IL1 β多克隆抗体(1：50)或兔抗人TGF β1多克隆抗体(6μm/ml)或鼠抗牛单克隆抗体(1：50)室温2小时；生物素化羊抗兔IgG(1:400)或生物素化兔抗鼠IgG(1:400)室温1小时；ABC液室温1小时；0.05%DAB-H2O2液显色，洗涤，脱水，透明，封片；每步后用PBS洗5min×3，用PBS取代第1抗体作用为阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 IL1和TGF β在病损的关节软骨表浅层一些细胞中表达。TGF β还示在病损的关节软骨中，由发生簇集的软骨细胞表达(图1，2，3)。未观察到IL1、TGF β和BMP在正常成人关节软骨中表达。
图1.病损软骨表浅层，示IL1表达的阳染细胞
Fig1.IL1 expression in chondrocytes of superficial layer of osteoarthritic cartilage
, http://www.100md.com
图2.病损软骨表浅层，示TGF β表达的阳染细胞
Fig2.TGF β expression in chondrocytes of superficial layer of osteoarthritic cartilage
图3.发生簇集变的软骨细胞示TGF β表达
Fig3.TGF β expression in clustered chondrocytes of osteoarthritic cartilage
2.2 在关节软骨严重病损达软骨下骨的部位，BMP、TGF β和IL1在髓腔内新生的软骨组织的一些细胞中表达。呈阳性表达的细胞散布在新生的软骨组织中，形态较大、呈圆形，为软骨细胞；分布于新生软骨组织的外围的阳性表达细胞，形态较小、多细长形，推测 是间充质祖细胞。组化染色的强弱显示，BMP与TGF β较IL1明显高表达(图4，5，6)。
, http://www.100md.com
图4.新生软骨组织中，示BMP表达的阳染细胞
Fig4.BMP expression inthe cells of neoformatire cartilage tissue
图5.新生软骨组织中，示TGF β表达的阳染细胞
Fig5.TGF βexpression in the cells of neoformatire cartilage tissue
, 百拇医药
图6.新生软骨组织中，示IL1表达的阳染细胞
Fig6.IL1 expression inthe cells of neoformatire cartilage tissue
3 讨论
IL1抑制关节软骨细胞合成特征性的基质成份II型胶原和蛋白多糖，而诱导关节软骨细胞表达Ⅰ、Ⅲ型胶原，促关节软骨细胞发生反分化。IL1还能刺激关节软骨细胞分泌降解软骨基质成份的蛋白酶。因此，IL1被认为对骨性关节炎、类风湿关节炎关节软骨的变性、破坏负有责任。作者观察到IL1在骨性关节炎病损的关节软骨表浅层细胞中表达，结果与以往的研究报道相似[1]。我们的结果显示，TGF β也在病损的关节软骨表浅层细胞中表达。TGF β还在病损的关节软骨中，由发生簇集的软骨细胞表达。在发生病损的关节软骨中，常可观察到软骨细胞的簇集现象，形成所谓的cluster,形成cluster的软骨细胞多增强合成蛋白多糖。业已证明，TGF β能促关节软骨细胞合成蛋白多糖[4]，TGF β还可能通过下调IL1受体在软骨细胞表达，对抗IL1对软骨细胞的作用[3]。我们的结果提示，TGF β在软骨细胞中表达，刺激软骨细胞进行修复活动，抗 IL1对软骨的损害作用。
, http://www.100md.com
已知当关节软骨发生严重病损，软骨破坏达软骨下骨，髓腔内的细胞能增殖、分化，最终在损伤区形成新生的软骨。我们的结果显示BMP、TGF β和IL1，在新生的软骨组织的一些细胞中表达，组化染色的强弱显示，BMP与TGF β较IL1明显高表达。BMP与TGF β能诱导间充质祖细胞增殖、分化成软骨细胞，促软骨细胞合成细胞外基质成份[5、6]。骨髓腔中含有丰富的可被诱导的间充质祖细胞。我们的结果提示，BMP与TGF β表达与新生软骨的形成有关，BMP与TGF β可能在关节软骨的修复治疗上有应用价值。
免疫组化染色，本研究观察到BMP，TGF β和IL1在骨性关节炎病损的软骨及新生的软骨组织中表达，显示与相应的形态学事件有关。结果提示，BMP，TGF β和IL1三种细胞因子，以自分泌和(或)旁分泌的形式在关节软骨的病损和修复过程中起调节作用。进一步研究，需简明不同细胞因子间的协同作用，有可能为今后关节软骨病损的临床防治，提供新的途径。
*国家自然科学基金资助课题
, http://www.100md.com
参考文献
1.Pelletier JP,Martel-Pelletier J. Evidence for the involvement ofinterleukin-1 in human osteoarthritic cartilage degradation:protective effect of NSAID. J Rheumatology,1989,(supplement 18) 15:19.
2.Yang LT,Jin Y.Immunohistochemical observation on bone morphogenetic protein in normal and abnormal condition.Clin Orthp,1990,257:249.
3.Redini F,Mauviel A,Pronost S,et al. Transforming growth factor-β exerts opposite effects from interleuken-1 β on cultured rabbit articular chondrocytes through reduction of interleukin-1 receptor expression.Arthritis and Rheumatism,1993,36(8):44.
, 百拇医药
4.Van der Kraan P,Vitters E,van den Berg W.Differential effect of transforming growth factor-β on freshly isolated and cultrued aritcualar chondrocytes.J Rheumatology,1992,19:140.
5.Centrella M,Mccarthy TL,Canalis E,et al.Transforming growth factor-beta and remodeling of bone.The Journal Bone Joint Surgery,1991,9:1418.
6.Vukicevic S,Luyten,FP,Reddi AH.Simulation of the expression of osteogenic and chondrogenic phenotypes in vitro by osteogenin.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:8793.
(1997.06.10收稿), 百拇医药
单位：滕华建 曲绵域 林宗智 康 勇 张美荣 刘 燕 (北京医科大学运动医学研究(100083))
关键词：骨性关节炎；软骨；细胞因子
IL1 提要 采用免疫组织化学染色技术，检测白细胞介素1(IL1)，转化生长因子β(TGF β)和骨形态发生蛋白(BMP)在骨性关节炎的关节软骨中的表达。结果显示：(1)IL1与TGF β在病损的关节软骨表浅层细胞中表达，TGF β还在病损的关节软骨中由发生簇集的软骨细胞表达。(2)在关节软骨病损达软骨下骨部位，BMP，TGF β和IL1在新生的软骨组织的一些细胞中表达。我们的结果提示，IL1，TGF β和BMP以自分泌和(或)旁分泌的形式，在骨性关节炎的病理过程中起重要作用，涉及关节软骨的病损及修复。
Expressions of IL1,TGF β and BMP in osteoarthritic cartilage
, http://www.100md.com
Teng Huajian,Qu Mianyu,Lin Zhongzi,et al.
Institute of Sports Medicine,Beijing Medical University,100083
The expressions of Interleukin-1(IL1),transfroming growth factor-β(TGF β)and bone morphogenetic protein (BMP) were examined in osteoarthritic cartilage by immunohisochemical staining technique.Results:(1)The expressions of IL1 and TGF β were shown in chondrocytes which presented in superficial layer of articular cartilage,TGF β was also found in chondrocytes which were as clusters in articular cartilage. (2) The expressions of BMP,TGF β and IL1 were observed in some cells of neoformative cartilage tissue where the articular cartilage presented a complete erosion. Our data indicated that IL1,TGF β and BMP played an important role in the pathologic process of osteoarthritis,involved in both repairing and damaging of cartilage by paracrine and/or autocrine mechanisms.
, 百拇医药
Key Words:osteoarthritic,cartilage
关节软骨病损是骨性关节炎的主要病理改变。成人的关节软骨无血管、淋巴和神经支配，且关节软骨细胞增殖能力很弱，一旦关节软骨发生病损，难以自身修复，这给临床对软骨病损的治疗带来很大的困难，因此，有关软骨病损机制的研究，一直是人们关注的焦点。
白细胞介素1(IL1)是一种重要的炎症调节因子，主要由淋巴细胞产生，软骨细胞也可分泌IL1，有证据表明，IL1与骨性关节炎、类风湿关节炎的关节软骨病损有关[1]。转化生长因子β(TGF β)能促进多种细胞增殖及细胞外基质成份的合成，包括软骨细胞。体内TGF β能刺激骨与软骨形成，软骨细胞、成骨细胞及骨膜细胞都可表达TGF β[5]。骨形态发生蛋白(BMP)是一种能体内异位诱导化骨与软骨的蛋白因子，免疫组化研究证明，BMP可由间充质细胞、软骨细胞和成骨细胞产生[2]。为探查BMP、TGF β和IL1在骨性关节炎的关节软骨中的表达，以探讨它们可能起的作用，进行了本项研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本的来源与制作
骨性关节炎病理标本来源于人工膝关节置换术及全髌骨切除术，共计9例。取正常关节软骨作对照。所有标本均经10%的中性福尔马林固定，含骨组织的标本，经10%的甲酸/0.05%氯化钠/10福尔马林溶液中脱钙，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，5μm切片以备染色。
1.2 方法
主要试剂：IL1 β兔抗人多克隆抗体，购自美国GIBCO公司。TGF β1兔抗人多克隆抗体，由美国NIH Kathy Flanders博士惠赠；牛BMP单克隆抗体购自第四军医大学；生物素化兔抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG和ABC液均为美国DAKO公司产品。
兔疫组化染色流程：切片脱蜡水化；0.6%甲醇/双氧水中30min；0.025%胰蛋白消化30min；正常牛血清封闭30min后倾去；分别滴加兔抗人IL1 β多克隆抗体(1：50)或兔抗人TGF β1多克隆抗体(6μm/ml)或鼠抗牛单克隆抗体(1：50)室温2小时；生物素化羊抗兔IgG(1:400)或生物素化兔抗鼠IgG(1:400)室温1小时；ABC液室温1小时；0.05%DAB-H2O2液显色，洗涤，脱水，透明，封片；每步后用PBS洗5min×3，用PBS取代第1抗体作用为阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 IL1和TGF β在病损的关节软骨表浅层一些细胞中表达。TGF β还示在病损的关节软骨中，由发生簇集的软骨细胞表达(图1，2，3)。未观察到IL1、TGF β和BMP在正常成人关节软骨中表达。
图1.病损软骨表浅层，示IL1表达的阳染细胞
Fig1.IL1 expression in chondrocytes of superficial layer of osteoarthritic cartilage
, http://www.100md.com
图2.病损软骨表浅层，示TGF β表达的阳染细胞
Fig2.TGF β expression in chondrocytes of superficial layer of osteoarthritic cartilage
图3.发生簇集变的软骨细胞示TGF β表达
Fig3.TGF β expression in clustered chondrocytes of osteoarthritic cartilage
2.2 在关节软骨严重病损达软骨下骨的部位，BMP、TGF β和IL1在髓腔内新生的软骨组织的一些细胞中表达。呈阳性表达的细胞散布在新生的软骨组织中，形态较大、呈圆形，为软骨细胞；分布于新生软骨组织的外围的阳性表达细胞，形态较小、多细长形，推测 是间充质祖细胞。组化染色的强弱显示，BMP与TGF β较IL1明显高表达(图4，5，6)。
, http://www.100md.com
图4.新生软骨组织中，示BMP表达的阳染细胞
Fig4.BMP expression inthe cells of neoformatire cartilage tissue
图5.新生软骨组织中，示TGF β表达的阳染细胞
Fig5.TGF βexpression in the cells of neoformatire cartilage tissue
, 百拇医药
图6.新生软骨组织中，示IL1表达的阳染细胞
Fig6.IL1 expression inthe cells of neoformatire cartilage tissue
3 讨论
IL1抑制关节软骨细胞合成特征性的基质成份II型胶原和蛋白多糖，而诱导关节软骨细胞表达Ⅰ、Ⅲ型胶原，促关节软骨细胞发生反分化。IL1还能刺激关节软骨细胞分泌降解软骨基质成份的蛋白酶。因此，IL1被认为对骨性关节炎、类风湿关节炎关节软骨的变性、破坏负有责任。作者观察到IL1在骨性关节炎病损的关节软骨表浅层细胞中表达，结果与以往的研究报道相似[1]。我们的结果显示，TGF β也在病损的关节软骨表浅层细胞中表达。TGF β还在病损的关节软骨中，由发生簇集的软骨细胞表达。在发生病损的关节软骨中，常可观察到软骨细胞的簇集现象，形成所谓的cluster,形成cluster的软骨细胞多增强合成蛋白多糖。业已证明，TGF β能促关节软骨细胞合成蛋白多糖[4]，TGF β还可能通过下调IL1受体在软骨细胞表达，对抗IL1对软骨细胞的作用[3]。我们的结果提示，TGF β在软骨细胞中表达，刺激软骨细胞进行修复活动，抗 IL1对软骨的损害作用。
, http://www.100md.com
已知当关节软骨发生严重病损，软骨破坏达软骨下骨，髓腔内的细胞能增殖、分化，最终在损伤区形成新生的软骨。我们的结果显示BMP、TGF β和IL1，在新生的软骨组织的一些细胞中表达，组化染色的强弱显示，BMP与TGF β较IL1明显高表达。BMP与TGF β能诱导间充质祖细胞增殖、分化成软骨细胞，促软骨细胞合成细胞外基质成份[5、6]。骨髓腔中含有丰富的可被诱导的间充质祖细胞。我们的结果提示，BMP与TGF β表达与新生软骨的形成有关，BMP与TGF β可能在关节软骨的修复治疗上有应用价值。
免疫组化染色，本研究观察到BMP，TGF β和IL1在骨性关节炎病损的软骨及新生的软骨组织中表达，显示与相应的形态学事件有关。结果提示，BMP，TGF β和IL1三种细胞因子，以自分泌和(或)旁分泌的形式在关节软骨的病损和修复过程中起调节作用。进一步研究，需简明不同细胞因子间的协同作用，有可能为今后关节软骨病损的临床防治，提供新的途径。
*国家自然科学基金资助课题
, http://www.100md.com
参考文献
1.Pelletier JP,Martel-Pelletier J. Evidence for the involvement ofinterleukin-1 in human osteoarthritic cartilage degradation:protective effect of NSAID. J Rheumatology,1989,(supplement 18) 15:19.
2.Yang LT,Jin Y.Immunohistochemical observation on bone morphogenetic protein in normal and abnormal condition.Clin Orthp,1990,257:249.
3.Redini F,Mauviel A,Pronost S,et al. Transforming growth factor-β exerts opposite effects from interleuken-1 β on cultured rabbit articular chondrocytes through reduction of interleukin-1 receptor expression.Arthritis and Rheumatism,1993,36(8):44.
, 百拇医药
4.Van der Kraan P,Vitters E,van den Berg W.Differential effect of transforming growth factor-β on freshly isolated and cultrued aritcualar chondrocytes.J Rheumatology,1992,19:140.
5.Centrella M,Mccarthy TL,Canalis E,et al.Transforming growth factor-beta and remodeling of bone.The Journal Bone Joint Surgery,1991,9:1418.
6.Vukicevic S,Luyten,FP,Reddi AH.Simulation of the expression of osteogenic and chondrogenic phenotypes in vitro by osteogenin.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:8793.
(1997.06.10收稿), 百拇医药