冠心病患者载脂蛋白E增强子基因多态性及其与血清脂质的关系
作者：崔天盆 周新 郑芳 伍远雄 李景东
单位：崔天盆(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；周新(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；郑芳(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；伍远雄(湖北省人民医院心内科)；李景东(同济医科大学附属协和医院心内科)
关键词：载脂蛋白E；增强子；基因多态性；冠心病
中华医学杂志001111
【摘要】 目的 研究载脂蛋白E内含子1内增强子元件(IE1)基因多态性与人类冠心病(CHD)及其血脂水平的关系。方法 采用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态方法，分析了108例健康人及81例冠心病患者的IE1基因型。结果 CHD组apoE IE1 G/G基因型频率(0.605)和G等位基因频率(0.765)分别显著高于对照组(0.398, 0.644; P<0.05)；G/G基因型者血清总胆固醇高于C/C基因型者。结论 ApoE IE1 G/G 基因型是冠心病的危险因子之一。
, 百拇医药
Genetic polymorphism analysis of apoE intron 1 enhancer in patients with coronary heart disease and the association with serum lipid level
CUI Tianpen ZHOU Xin ZHENG Fang
(Department of Clinical Chemistry, Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
【Abstract】 Objective To investigate the association between the polymorphism of apolipoprotein E (apoE) intron 1 enhancer (IE1) and the level of serum lipid in patients with coronary heart disease (CHD). Methods ApoE IE1 genotypes of 81 patients with CHD and 108 healthy subjects were detected by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. Results The frequency of G/G genotype in patients with CHD was significantly higher than that in control group (P<0.05). The frequency of G allele was significantly higher in patients than in control group (P<0.05). The gene polymorphism of apoE IE1 obviously influenced the serum lipid levels. The concentrations of TC, and LDL-C among different genotype groups were significantly different, and the level in G/G group was higher than that in C/C group (P<0.05). Conclusion ApoE IE1 gene polymorphism is closely related to serum lipid, and G/G genotype of apoE IE1 may be a risk factor of coronary heart disease in Han Chinese.
, 百拇医药
【Key words】 Apolipoprotein E； Enhancer； Gene polymorphism； Coronary heart disease
有研究表明apoEε4/3基因型和ε4等位基因与冠心病(CHD)呈显著正相关，且ε4等位基因与血清总胆固醇，低密度脂蛋白(LDL-C)和apoB水平升高有关[1]。Mui等[2]发现apoE内含子1内增强子元件(IE1)存在多态性，且这种多态性可能影响增强子活性。因此，我们在汉族人群中采用聚合酶链反应结合限制酶切多态性分析(PCR-RFLP)对apoE IE1基因多态性进行分析，探讨该多态性对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响及在CHD发病中的作用。
对象和方法
1.对象：随机选择108例健康体检者为对照组，其中男53例，女55例，年龄63.2岁±12.4岁。CHD组81例，男40例，女41例，年龄63.5岁±13.7岁，均经冠状动脉造影证实患者存在单支、2支或2支以上冠状动脉病变，狭窄程度≥50%。
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2.方法：空腹12 h后静脉采血，分离血清用于血脂指标检测，血细胞用于提取DNA。用改良碘化钠法提取基因组DNA，参照文献[3]合成一对引物，序列为P1：5′-TGAGAAGCGCAGTCGGGGGCA-3′，P2：5′-AGGTCCAGTCCCCTGCTGCT-3′。在PE2400型PCR扩增仪中进行，反应条件为：预变性95℃ 3 min，然后按95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min进行35个循环，末次循环后72℃延伸5 min。取10 μl扩增产物，加入10×缓冲液2 μl,限制性内切酶BspLⅠ(识别序列GGN↓NCC)4 U，牛血清白蛋白2 μg，以蒸馏水补充体积至20 μl。混匀，置37℃消化4 h，酶切产物用10% PAGE电泳分析鉴定，与DNA片段长度标准物pGEM-7zf(+)/Hae Ⅲ Marker 比较，进行基因分型。
表2 CHD患者与对照组血脂和脂蛋白比较(
±s) 组别
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例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
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CHD
81
5.77±1.18
1.89±1.31
1.17±0.38
3.47±0.95
1.16±0.20
0.96±0.30
对照组
108
4.39±0.75
, 百拇医药
1.37±0.83
1.23±0.32
2.56±0.60
1.19±0.15
0.93±0.16
注：与对照组比较*P<0.01表3 两组不同IE1基因型间血脂水平比较(±s) 组别
例数
TC(mmol/L)
TG
(mmol/L)
, 百拇医药
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
对照组
G/G
43
4.60±0.77**
, http://www.100md.com
1.58±1.05
1.19±0.33
2.69±0.63
1.20±0.13
0.96±0.15
G/C
53
4.30±0.71
1.26±0.63
1.28±0.31
2.51±0.59
1.19±0.17
, 百拇医药
0.90±0.16
C/C
12
4.03±0.66
1.09±0.53
1.17±0.33
2.33±0.49
1.12±0.12
0.90±0.17
CHD组
G/G
49
, 百拇医药
5.91±1.21*
2.03±1.32
1.13±0.39
3.72±1.13△
1.16±0.21
0.98±0.33
G/C
26
5.62±0.98*
1.72±1.35
1.20±0.37
, 百拇医药
3.31±0.66△
1.17±0.19
0.95±0.26
C/C
6
5.32±1.01
1.43±0.67
1.33±0.32
2.17±0.43
1.13±0.16
0.89±0.20
注：与C/C组比较：F=8.01,P<0.01;F=3.65,P<0.05;△F=5.38,P<0.01 3.统计学处理：基因频率采用基因计数法计算；采用方差分析和卡方检验的方法进行组间基因频率和血清脂质的比较。
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结果
1.apoE IE1 PCR-RFLP：apoE内含子1内增强子元件C/C基因型有三个BspLⅠ酶切位点，故产生95、38、21、9 bp四种片段，10% PAGE分析仅95 bp清晰可见；G/G基因型因核苷酸序列969处C变为G，不能被BspL I 识别，只有两个酶切位点，仅产生104、38和21 bp三种片段，仅104 bp片段清晰可见；G/C基因型则可见104、95 bp两种片段(图1)。
2.ApoE IE1基因型与等位基因频率分布：两组人群IE1基因型频率均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性。两组人群男、女间基因型分布没有显著性差异，但两组人群间apoE IE1 基因型与等位基因频率具有显著性意义。CHD组G/G基因型频率(0.605)显著高于对照组(0.398, P<0.05),CHD组G等位基因频率高于对照组(P<0.05)见表1。
3.CHD患者与对照组血脂和脂蛋白比较：CHD组血清总胆固醇、甘油三酯、LDL-C水平显著高于对照组。HDL-C、apoAI、apoB两组间差异无显著意义(表2)。
, 百拇医药
4.不同IE1基因型间血脂水平比较：正常对照组apoE内含子1内增强子基因多态性对血脂、脂蛋白的影响大多没有统计学意义，只有总胆固醇水平G/G基因型个体比C/C高(F=3.65，P<0.05，表3)。CHD组血脂TC、LDL-C的均值在G/G、G/C及C/C基因型个体中存在渐降的趋势，且G/G与G/C、G/G与C/C、G/C与C/C相比差异均有显著意义(表3)。
M：pGEM 7zf(+) DNA/HaeⅢ，1～4：分别为G/G、G/C、C/C基因型
图1 apoE内含子1内增强子元件聚合酶链反应结合限制酶切多态性分析
表1 两组apoE IE1基因型与等位基因频率分布 组别
例数
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基因型频率
等位基因频率
G/G
G/C
C/C
G
C
CHD
81
0.605
0.321
0.074
0.765△
, http://www.100md.com
0.235
对照组
108
0.398
0.491
0.111
0.644
0.356
注：χ2=7.92，P<0.05，△χ2=6.50，P<0.05
讨论
许多研究表明apoE外显子4基因多态性与血脂、脂蛋白及AS间关系密切，有研究发现携ε2等位基因者血浆TC可减少0.52 mmol/L,而携ε4者可增加0.26 mmol/L。国内外研究亦表明CHD人群ε4/4基因型频率和ε4等位基因频率均显著高于相应对照组。关于ε4与高TC、LDL-C及CHD相关的机理以前研究认为ε4编码的E4异构体LDL受体(LDL-R)结合活性明显高于E3，故机体的肝脏能通过LDL-R摄取较多的含apoE4的脂蛋白，使肝内胆固醇含量增加，通过反馈调节，使肝细胞LDL-R数目减少，降低肝细胞对LDL的摄取，最终使LDL水平升高，同样可解释ε2等位基因与低TC相关。
, http://www.100md.com
本研究发现CHD组G/G基因型和G等位基因频率显著高于对照组，且G/G基因型无论在对照组还是在CHD其TC均高于对照组，而且CHD组G等位基因同样与高LDL-C相联。故我们认为G等位基因可能具有较强增加子活性，从而影响TC和LDL-C，当然这有待于使用报告基因研究这两种增强活性后才能得到证实，当然我们也不排除因IE1 G等位基因与ε4等位基因相关或连锁致使有统计意义[2]。总之，apoE IE1 G/G基因型使个体冠心病发病风险增加。
基金项目：湖北省科技攻关重点课题基金资助(961P2002)
参考文献
1，王克勤.脂蛋白与动脉粥样硬化.北京：人民卫生出版社，1995.137-168.
2，Mui S, Briggs M, Chung H. et al. A newly identified polymorphism in the apolipoprtein E enhancer gene region is associated with Alzheimer's disease and strongly with the ε4 allele. Neurology, 1996,47:196-201.
3，Tianpen C, Xin Z, Wenhua J, et al. Gene polymorphism in apolipoprotein E and presenilin-1 in patients with late-onset Alzheimer's disease. Chin Med J,2000,113:340-344.
(收稿日期：2000-01-16), http://www.100md.com
单位：崔天盆(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；周新(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；郑芳(湖北医科大学第二临床学院检验系 武汉430071)；伍远雄(湖北省人民医院心内科)；李景东(同济医科大学附属协和医院心内科)
关键词：载脂蛋白E；增强子；基因多态性；冠心病
中华医学杂志001111
【摘要】 目的 研究载脂蛋白E内含子1内增强子元件(IE1)基因多态性与人类冠心病(CHD)及其血脂水平的关系。方法 采用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态方法，分析了108例健康人及81例冠心病患者的IE1基因型。结果 CHD组apoE IE1 G/G基因型频率(0.605)和G等位基因频率(0.765)分别显著高于对照组(0.398, 0.644; P<0.05)；G/G基因型者血清总胆固醇高于C/C基因型者。结论 ApoE IE1 G/G 基因型是冠心病的危险因子之一。
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Genetic polymorphism analysis of apoE intron 1 enhancer in patients with coronary heart disease and the association with serum lipid level
CUI Tianpen ZHOU Xin ZHENG Fang
(Department of Clinical Chemistry, Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
【Abstract】 Objective To investigate the association between the polymorphism of apolipoprotein E (apoE) intron 1 enhancer (IE1) and the level of serum lipid in patients with coronary heart disease (CHD). Methods ApoE IE1 genotypes of 81 patients with CHD and 108 healthy subjects were detected by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. Results The frequency of G/G genotype in patients with CHD was significantly higher than that in control group (P<0.05). The frequency of G allele was significantly higher in patients than in control group (P<0.05). The gene polymorphism of apoE IE1 obviously influenced the serum lipid levels. The concentrations of TC, and LDL-C among different genotype groups were significantly different, and the level in G/G group was higher than that in C/C group (P<0.05). Conclusion ApoE IE1 gene polymorphism is closely related to serum lipid, and G/G genotype of apoE IE1 may be a risk factor of coronary heart disease in Han Chinese.
, 百拇医药
【Key words】 Apolipoprotein E； Enhancer； Gene polymorphism； Coronary heart disease
有研究表明apoEε4/3基因型和ε4等位基因与冠心病(CHD)呈显著正相关，且ε4等位基因与血清总胆固醇，低密度脂蛋白(LDL-C)和apoB水平升高有关[1]。Mui等[2]发现apoE内含子1内增强子元件(IE1)存在多态性，且这种多态性可能影响增强子活性。因此，我们在汉族人群中采用聚合酶链反应结合限制酶切多态性分析(PCR-RFLP)对apoE IE1基因多态性进行分析，探讨该多态性对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响及在CHD发病中的作用。
对象和方法
1.对象：随机选择108例健康体检者为对照组，其中男53例，女55例，年龄63.2岁±12.4岁。CHD组81例，男40例，女41例，年龄63.5岁±13.7岁，均经冠状动脉造影证实患者存在单支、2支或2支以上冠状动脉病变，狭窄程度≥50%。
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2.方法：空腹12 h后静脉采血，分离血清用于血脂指标检测，血细胞用于提取DNA。用改良碘化钠法提取基因组DNA，参照文献[3]合成一对引物，序列为P1：5′-TGAGAAGCGCAGTCGGGGGCA-3′，P2：5′-AGGTCCAGTCCCCTGCTGCT-3′。在PE2400型PCR扩增仪中进行，反应条件为：预变性95℃ 3 min，然后按95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min进行35个循环，末次循环后72℃延伸5 min。取10 μl扩增产物，加入10×缓冲液2 μl,限制性内切酶BspLⅠ(识别序列GGN↓NCC)4 U，牛血清白蛋白2 μg，以蒸馏水补充体积至20 μl。混匀，置37℃消化4 h，酶切产物用10% PAGE电泳分析鉴定，与DNA片段长度标准物pGEM-7zf(+)/Hae Ⅲ Marker 比较，进行基因分型。
表2 CHD患者与对照组血脂和脂蛋白比较(
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
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CHD
81
5.77±1.18
1.89±1.31
1.17±0.38
3.47±0.95
1.16±0.20
0.96±0.30
对照组
108
4.39±0.75
, 百拇医药
1.37±0.83
1.23±0.32
2.56±0.60
1.19±0.15
0.93±0.16
注：与对照组比较*P<0.01表3 两组不同IE1基因型间血脂水平比较(
±s) 组别例数
TC(mmol/L)
TG
(mmol/L)
, 百拇医药
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
对照组
G/G
43
4.60±0.77**
, http://www.100md.com
1.58±1.05
1.19±0.33
2.69±0.63
1.20±0.13
0.96±0.15
G/C
53
4.30±0.71
1.26±0.63
1.28±0.31
2.51±0.59
1.19±0.17
, 百拇医药
0.90±0.16
C/C
12
4.03±0.66
1.09±0.53
1.17±0.33
2.33±0.49
1.12±0.12
0.90±0.17
CHD组
G/G
49
, 百拇医药
5.91±1.21*
2.03±1.32
1.13±0.39
3.72±1.13△
1.16±0.21
0.98±0.33
G/C
26
5.62±0.98*
1.72±1.35
1.20±0.37
, 百拇医药
3.31±0.66△
1.17±0.19
0.95±0.26
C/C
6
5.32±1.01
1.43±0.67
1.33±0.32
2.17±0.43
1.13±0.16
0.89±0.20
注：与C/C组比较：F=8.01,P<0.01;F=3.65,P<0.05;△F=5.38,P<0.01 3.统计学处理：基因频率采用基因计数法计算；采用方差分析和卡方检验的方法进行组间基因频率和血清脂质的比较。
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结果
1.apoE IE1 PCR-RFLP：apoE内含子1内增强子元件C/C基因型有三个BspLⅠ酶切位点，故产生95、38、21、9 bp四种片段，10% PAGE分析仅95 bp清晰可见；G/G基因型因核苷酸序列969处C变为G，不能被BspL I 识别，只有两个酶切位点，仅产生104、38和21 bp三种片段，仅104 bp片段清晰可见；G/C基因型则可见104、95 bp两种片段(图1)。
2.ApoE IE1基因型与等位基因频率分布：两组人群IE1基因型频率均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性。两组人群男、女间基因型分布没有显著性差异，但两组人群间apoE IE1 基因型与等位基因频率具有显著性意义。CHD组G/G基因型频率(0.605)显著高于对照组(0.398, P<0.05),CHD组G等位基因频率高于对照组(P<0.05)见表1。
3.CHD患者与对照组血脂和脂蛋白比较：CHD组血清总胆固醇、甘油三酯、LDL-C水平显著高于对照组。HDL-C、apoAI、apoB两组间差异无显著意义(表2)。
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4.不同IE1基因型间血脂水平比较：正常对照组apoE内含子1内增强子基因多态性对血脂、脂蛋白的影响大多没有统计学意义，只有总胆固醇水平G/G基因型个体比C/C高(F=3.65，P<0.05，表3)。CHD组血脂TC、LDL-C的均值在G/G、G/C及C/C基因型个体中存在渐降的趋势，且G/G与G/C、G/G与C/C、G/C与C/C相比差异均有显著意义(表3)。
M：pGEM 7zf(+) DNA/HaeⅢ，1～4：分别为G/G、G/C、C/C基因型
图1 apoE内含子1内增强子元件聚合酶链反应结合限制酶切多态性分析
表1 两组apoE IE1基因型与等位基因频率分布 组别
例数
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基因型频率
等位基因频率
G/G
G/C
C/C
G
C
CHD
81
0.605
0.321
0.074
0.765△
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0.235
对照组
108
0.398
0.491
0.111
0.644
0.356
注：χ2=7.92，P<0.05，△χ2=6.50，P<0.05
讨论
许多研究表明apoE外显子4基因多态性与血脂、脂蛋白及AS间关系密切，有研究发现携ε2等位基因者血浆TC可减少0.52 mmol/L,而携ε4者可增加0.26 mmol/L。国内外研究亦表明CHD人群ε4/4基因型频率和ε4等位基因频率均显著高于相应对照组。关于ε4与高TC、LDL-C及CHD相关的机理以前研究认为ε4编码的E4异构体LDL受体(LDL-R)结合活性明显高于E3，故机体的肝脏能通过LDL-R摄取较多的含apoE4的脂蛋白，使肝内胆固醇含量增加，通过反馈调节，使肝细胞LDL-R数目减少，降低肝细胞对LDL的摄取，最终使LDL水平升高，同样可解释ε2等位基因与低TC相关。
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本研究发现CHD组G/G基因型和G等位基因频率显著高于对照组，且G/G基因型无论在对照组还是在CHD其TC均高于对照组，而且CHD组G等位基因同样与高LDL-C相联。故我们认为G等位基因可能具有较强增加子活性，从而影响TC和LDL-C，当然这有待于使用报告基因研究这两种增强活性后才能得到证实，当然我们也不排除因IE1 G等位基因与ε4等位基因相关或连锁致使有统计意义[2]。总之，apoE IE1 G/G基因型使个体冠心病发病风险增加。
基金项目：湖北省科技攻关重点课题基金资助(961P2002)
参考文献
1，王克勤.脂蛋白与动脉粥样硬化.北京：人民卫生出版社，1995.137-168.
2，Mui S, Briggs M, Chung H. et al. A newly identified polymorphism in the apolipoprtein E enhancer gene region is associated with Alzheimer's disease and strongly with the ε4 allele. Neurology, 1996,47:196-201.
3，Tianpen C, Xin Z, Wenhua J, et al. Gene polymorphism in apolipoprotein E and presenilin-1 in patients with late-onset Alzheimer's disease. Chin Med J,2000,113:340-344.
(收稿日期：2000-01-16), http://www.100md.com