TGFα－PE40对人肺腺癌细胞生长的抑制作用
作者：王兵 徐永华 王杰军 黄渊 江万里 陆健 高勇
单位：王兵(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)；徐永华(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 2000313)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)；黄渊(上海市第一人民医院附属护校，上海 2000804)；江万里(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 2000313)；陆健(第二军医大学卫勤系医学统计学教研室，上海 200433)；高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)
关键词：TGFα-PE40；肺腺癌细胞；表皮生长因子受体；生长抑制剂
癌症000213
【摘 要】目的:探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40,简称TP40)对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。方法:用免疫组化LSAB法检测人肺腺癌SPC-A-1细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，用结晶紫染色法和3H-亮氨酸掺入法检测TP40对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成的抑制，用过量EGF竞争拮抗TP40的细胞毒作用。结果:SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色。TP40浓度为1～100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成呈剂量依赖性抑制。过量EGF能完全拮抗TP40的细胞毒作用。结论:人肺腺癌SPC-A-1细胞能高水平地表达EGFR，重组TP40对SPC-A-1细胞生长具有较强的抑制作用，作用部位为细胞的EGFR。
, http://www.100md.com
中图分类号：R734.2；R73-36 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0143-03
Growth inhibitory effect of TGFα-PE40 on human lung adenocarcinoma cells
WANG Bing XU Yong-hua WANG Jie-jun et al
(Department of Oncology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate growth inhibit effect of recombinant transforming growth factor α-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGFα-PE40;TP40) on cultured human lung adenocarcinoma cells. Methods: The expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in a human lung adenocarcinoma cell line SPC-A-1 was determined with immunohistochemistry. Inhibitory effects of TP40 on SPC-A-1 cell growth and protein synthesis were analyzed with crystal violet staining and 3H-leucine incorporation. Competitive assay was performed by the addition of excess of EGF. Results:The SPC-A-1 cells appeared large amount of brown immunoperoxidase reaction indicating EGFR positive. When the concentration of TP40 was in the range of 1～ 100 ng/ml, TP40 inhibited SPC-A-1 cell growth and protein synthesis in a dose-dependent manner. Excess EGF can completely block the inhibitory effects of TP40. Conclusions:The human lung adenocarcinoma SPC-A-1 cells express high level EGFR. TP40 can significantly inhibit SPC-A-1 cell growth. The cytotoxic effect of TP40 was specifically mediated by EGFR.
, 百拇医药
Key words：TGFα-PE40; Lung adenocarcinoma cells; Epidermal growth factor receptor; Growth inhibitor
肺癌是最常见的肺恶性肿瘤。近半个世纪来，世界各国的发病率和病死率急剧上升。肺癌目前的治疗是以手术、放疗、化疗和免疫治疗为主的综合治疗，平均5年生存率仅10%左右。本研究拟探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40，简称TP40)对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
基因重组TP40:中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授合成并提供。兔抗人表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体:Sigma公司产品。LSAB组合试剂盒，Dako公司产品。3H亮氨酸:Amersham公司产品。表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)与酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,aFGF):上海市第一人民医院心内科张建军博士惠赠。PRMI1640培养基:Gibco公司产品。
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1.2 人肺腺癌细胞株及培养
人肺腺癌SPC-A-1细胞株:购自中国科学院上海细胞生物学研究所。培养于含10%小牛血清的1640培养液中，培养液另含4mmol/L谷氨酰胺，青、链霉素(各为100IU/ml,100μg/ml),置于5%CO2孵箱内。
1.3 肺腺癌细胞EGFR的表达
用盖玻片培养SPC-A-1细胞，4%多聚甲醛固定后，按LSAB法进行[1]。
1.4 TP40对肺腺癌细胞生长的影响
SPC-A-1细胞以5×103/孔的密度接种96孔板，每组3孔，置37℃ CO2孵箱内温育24h后，加入不同浓度TP40(0.1，1，10，100ng/ml)，对照组加入不含TP40的培养液。继续温育24h后取出，在结晶紫固定液中浸染20min，然后用去离子水荡洗，浸泡15min，待自然晾干后，每孔加入100μl结晶紫提取液，于595nm处测定吸收度值(OD值)[2]。
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1.5 TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响
细胞接种及TP40加入浓度同上。细胞与TP40温育24h后，加入3H-亮氨酸1.85×104 Bq/孔，继续温育4h后，倾去培养液，D-Hanks液洗涤3次，用0.1%胰蛋白酶消化3min，然后用DYQ-Ⅲ型多头细胞收集仪(绍兴坡塘医疗仪器厂)将细胞收集在玻璃纤维纸上，晾干后80型液体闪烁计数仪(中国科学院上海原子核研究所)测其放射性强度。
1.6 EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用
SPC-A-1细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板，每组3孔，CO2孵箱内温育24h后取出，分别加入EGF及aFGF1μg/ml(剂量为TP40浓度的100倍)，37℃温育2h，然后加入TP40 10ng/ml。阳性对照组加仅含TP40的培养液，阴性对照组加不含TP40及其他生长因子的培养液。温育24h，加入3H亮氨酸1.85×104Bq/孔，37℃温育4h后倾去培养液，细胞收集及放射强度测定同上。
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1.7 统计学分析
各组间数据处理用t检验。
2 结果
2.1 肺腺癌细胞EGFR的表达
SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色，以细胞膜处最明显(图1)。
图1 培养肺腺癌SPC-A-1细胞EGFR表达的
免疫组化染色(LSAB法，×400)
2.2 TP40对肺腺癌细胞生长的影响
对照组SPC-A-1细胞生长的OD值为0.973±0.095;TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长的抑制作用不明显，OD值为0.965±0.080;浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，OD值为0.744±0.100;浓度为10及100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长具有很强的抑制作用，OD值分别为0.547±0.054和0.282±0.029。它们的变化趋势见(图2)，经统计分析(随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法)，0.1ng/ml时的OD值与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的OD值与对照组有差异，且随着浓度增加OD值下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞生长的抑制呈剂量依赖。
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图2 不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞生长的OD值
*P<0.05 **P<0.01
2.3 TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响
对照组SPC-A-1细胞3H-亮氨酸掺入量为66.16±7.11Bq；TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制作用不明显，3H-亮氨酸掺入量为65.13±7.23Bq；浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，3H亮氨酸掺入量为51.59±5.06Bq；浓度为10ng/ml及100ng/ml时,对SPC-A-1细胞蛋白质合成具有很强的抑制作，3H-亮氨酸掺入量分别为22.33±3.27Bq及11.08±1.74Bq。IC50为6.26ng/ml。它们的变化趋见(图3)，经统计分析(随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法)，0.1ng/ml时的3H-亮氨酸掺入量与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的3H亮氨酸掺入量与对照组有差异，且随着浓度增加3H-亮氨酸掺入量下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制呈剂量依赖。
, 百拇医药
图3 不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞3H-亮氨酸掺入量
*P<0.05 **P<0.01
2.4 EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用
EGF竞争组3H-亮氨酸的掺入量(64.52±6.25Bq)显著高于aFGF竞争组(22.55±2.82Bq)及TP40组(22.13±3.17Bq)，P<0.01，接近未加TP40及其他生长因子的空白对照组(66.01±7.01Bq)，p>0.05。说明EGF能竞争性地拮抗TP40对SPC-A-1细胞的毒性作用，提示:TP40的作用部位在细胞的EGFR。
3 讨论
EGFR是广泛存在于哺乳类细胞表面的膜受体，它通过伸在细胞外的配体结合结构域可以和EGF或TGFα结合，传递生长因子的信号，影响细胞的生长或分化。EGFR的蛋白激酶结构域和癌基因v-erbB1高度同源，人EGFR基因定位在第7号染色体上。肿瘤细胞EGFR的高水平表达可能是EGFR基因扩增、重排或转录控制异常所致[3]。本研究结果表明，人肺腺癌SPC-A-1细胞能高水平地表达EGFR。肿瘤EGFR阳性表达已被认为是不良分化的重要标志,因而具有更大恶性潜能和生长优势，预后不良。肺腺癌细胞表面高水平表达的EGFR可以成为抑制其生长的导向攻击目标。
, 百拇医药
随着基因工程技术的日臻成熟，重组生长因子毒素融合蛋白对相应生长因子受体过度表达的肿瘤细胞生长的导向抑制已成为目前抗癌研究的热点之一。TGFα是一种转化细胞异常表达的多肽类生长因子，其结构与EGF有同源性，能与EGFR结合，介导细胞增殖效应或细胞表型可逆性转化[4]。绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas extoxinA，PE)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面PE受体的结合进入细胞，催化延伸因子2(elongation factor2)的ADP-核糖基化(ADP-ribosylation),阻止蛋白质合成而导致细胞死亡。PE分子由三部分组成，包括受体结合、转位和活性结构域。如果将PE分子中与受体结合的结构域去除，则剩余的部分PE40失去与PE受体结合进入细胞的能力[5]。利用基因工程手段将TGFαcDNA顺序与PE40片断cDNA顺序连接，并插入表达型载体，构建成可表达的重组质粒，转化大肠杆菌后表达出有生理活性的TGFα-PE40融合蛋白。TGFα-PE40具有和表达EGFR的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用，同时，携带PE40进入细胞，高效地阻断靶细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡[6]。研究表明，TP40对EGFR表达水平较高的膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌及脑胶质瘤等细胞的生长有较强的导向抑制作用[7～10]。
, 百拇医药
TP40对靶细胞蛋白质合成抑制作用的强度显然依赖细胞表面EGFR的分子数[6]。本研究将TP40加入人肺腺癌SPC-A-1细胞的培养液中，对细胞的蛋白质合成具有较强的抑制作用，从而抑制SPC-A-1细胞的生长。我们外加过量EGF能竞争拮抗TP40的细胞毒性，说明TP40是通过和EGFR的专一结合而起作用的。利用肺腺癌与正常肺组织EGFR表达水平的差异，可选择合适的TP40浓度，以达到对肺腺癌细胞有效杀伤，而对正常肺组织较小损害的目的。本研究为进一步的动物实验研究和临床研究奠定了基础。TP40对肺腺癌细胞增殖所具有的导向抑制作用，为临床肺腺癌的生物治疗研究开辟了一个新的领域。
通讯作者：徐永华：Tel：86-21-64711349
Fax：86-21-64331019
E-mail：yhxu@sunm.shcnc.ac.cn
, 百拇医药
[参考文献]
[1] 梁英杰，凌启波.一种快速高敏感免疫组织化学染色法-LSAB法[J].中华病理学杂志，1993，22(6)：369.
[2] Zeng GQ, Rui YC. Effects of aniodamine and dauricine on proliferation, DNA synthesis, and calcium influx in bovine arterior cerebral arterial smooth muscle cells in culture [J]. Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao, 1991, 12(4)： 308～311.
[3] 徐永华.细胞生长因子和受体[J]，生命的化学，1992,12(4)： 4～8.
[4] Wang Bing, Guan Zhanjun, Li Yuli,et al. Inhibitory effect of TGFα-PE40 on neointimal proliferation following injury to the rabbit common carotid artery [J]. J Med Coll PLA, 1998, 13(4)： 280～284.
, 百拇医药
[5] Fu YM, Mesri EA, Yu ZX ,et al. Cytotoxic effects of vascular smooth muscle cells of the chimeric toxin, heparin binding TGF alpha-Pseudomonas exotoxin [J]. Cardiovasc Res, 1993， 27(9)：1691～1697.
[6] 徐永华，彭素芬，江万里，等.TGFα-PE40的基因克隆、表达和对人癌细胞生长的抑制作用[J].实验生物学报，1993，26(3)：289～295.
[7] Kameyama S, Kawamata H, Pastan I,et al. Cytotoxic effect of a fusion protein frome transforming growth factor alpha and Pseudomonas exotoxin on rat and human bladder carcinoma cells in vitro [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1994, 120(9)：507～512.
, 百拇医药
[8] Berger DP,Herbstritt L,Hellerich U,et al. Cytotoxicity of TGFα-PE40 and correlation to expression of epidermal growth factor receptor [J]. Eur J Cancer, 1995, 31A(12)：2067～2072.
[9] Balduwin RL,Kobrin MS,Tran T,et al. Cytotoxic effects of TGFα-Pseudomonas exotoxin A protein in human pancreatic carcinoma cells [J]. Pancreas, 1996, 13(1)： 16～21.
[10] 王兵，陈志坚，王杰军，等.TGFα-PE40对胶质瘤细胞生长抑制的实验研究[J].肿瘤，1998，18(1)：1～4.
收稿日期:1999-04-28;修回日期:1999-05-21, 百拇医药
单位：王兵(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)；徐永华(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 2000313)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)；黄渊(上海市第一人民医院附属护校，上海 2000804)；江万里(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 2000313)；陆健(第二军医大学卫勤系医学统计学教研室，上海 200433)；高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 2000032)
关键词：TGFα-PE40；肺腺癌细胞；表皮生长因子受体；生长抑制剂
癌症000213
【摘 要】目的:探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40,简称TP40)对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。方法:用免疫组化LSAB法检测人肺腺癌SPC-A-1细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，用结晶紫染色法和3H-亮氨酸掺入法检测TP40对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成的抑制，用过量EGF竞争拮抗TP40的细胞毒作用。结果:SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色。TP40浓度为1～100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成呈剂量依赖性抑制。过量EGF能完全拮抗TP40的细胞毒作用。结论:人肺腺癌SPC-A-1细胞能高水平地表达EGFR，重组TP40对SPC-A-1细胞生长具有较强的抑制作用，作用部位为细胞的EGFR。
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中图分类号：R734.2；R73-36 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0143-03
Growth inhibitory effect of TGFα-PE40 on human lung adenocarcinoma cells
WANG Bing XU Yong-hua WANG Jie-jun et al
(Department of Oncology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate growth inhibit effect of recombinant transforming growth factor α-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGFα-PE40;TP40) on cultured human lung adenocarcinoma cells. Methods: The expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in a human lung adenocarcinoma cell line SPC-A-1 was determined with immunohistochemistry. Inhibitory effects of TP40 on SPC-A-1 cell growth and protein synthesis were analyzed with crystal violet staining and 3H-leucine incorporation. Competitive assay was performed by the addition of excess of EGF. Results:The SPC-A-1 cells appeared large amount of brown immunoperoxidase reaction indicating EGFR positive. When the concentration of TP40 was in the range of 1～ 100 ng/ml, TP40 inhibited SPC-A-1 cell growth and protein synthesis in a dose-dependent manner. Excess EGF can completely block the inhibitory effects of TP40. Conclusions:The human lung adenocarcinoma SPC-A-1 cells express high level EGFR. TP40 can significantly inhibit SPC-A-1 cell growth. The cytotoxic effect of TP40 was specifically mediated by EGFR.
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Key words：TGFα-PE40; Lung adenocarcinoma cells; Epidermal growth factor receptor; Growth inhibitor
肺癌是最常见的肺恶性肿瘤。近半个世纪来，世界各国的发病率和病死率急剧上升。肺癌目前的治疗是以手术、放疗、化疗和免疫治疗为主的综合治疗，平均5年生存率仅10%左右。本研究拟探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40，简称TP40)对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
基因重组TP40:中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授合成并提供。兔抗人表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体:Sigma公司产品。LSAB组合试剂盒，Dako公司产品。3H亮氨酸:Amersham公司产品。表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)与酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,aFGF):上海市第一人民医院心内科张建军博士惠赠。PRMI1640培养基:Gibco公司产品。
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1.2 人肺腺癌细胞株及培养
人肺腺癌SPC-A-1细胞株:购自中国科学院上海细胞生物学研究所。培养于含10%小牛血清的1640培养液中，培养液另含4mmol/L谷氨酰胺，青、链霉素(各为100IU/ml,100μg/ml),置于5%CO2孵箱内。
1.3 肺腺癌细胞EGFR的表达
用盖玻片培养SPC-A-1细胞，4%多聚甲醛固定后，按LSAB法进行[1]。
1.4 TP40对肺腺癌细胞生长的影响
SPC-A-1细胞以5×103/孔的密度接种96孔板，每组3孔，置37℃ CO2孵箱内温育24h后，加入不同浓度TP40(0.1，1，10，100ng/ml)，对照组加入不含TP40的培养液。继续温育24h后取出，在结晶紫固定液中浸染20min，然后用去离子水荡洗，浸泡15min，待自然晾干后，每孔加入100μl结晶紫提取液，于595nm处测定吸收度值(OD值)[2]。
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1.5 TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响
细胞接种及TP40加入浓度同上。细胞与TP40温育24h后，加入3H-亮氨酸1.85×104 Bq/孔，继续温育4h后，倾去培养液，D-Hanks液洗涤3次，用0.1%胰蛋白酶消化3min，然后用DYQ-Ⅲ型多头细胞收集仪(绍兴坡塘医疗仪器厂)将细胞收集在玻璃纤维纸上，晾干后80型液体闪烁计数仪(中国科学院上海原子核研究所)测其放射性强度。
1.6 EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用
SPC-A-1细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板，每组3孔，CO2孵箱内温育24h后取出，分别加入EGF及aFGF1μg/ml(剂量为TP40浓度的100倍)，37℃温育2h，然后加入TP40 10ng/ml。阳性对照组加仅含TP40的培养液，阴性对照组加不含TP40及其他生长因子的培养液。温育24h，加入3H亮氨酸1.85×104Bq/孔，37℃温育4h后倾去培养液，细胞收集及放射强度测定同上。
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1.7 统计学分析
各组间数据处理用t检验。
2 结果
2.1 肺腺癌细胞EGFR的表达
SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色，以细胞膜处最明显(图1)。
图1 培养肺腺癌SPC-A-1细胞EGFR表达的
免疫组化染色(LSAB法，×400)
2.2 TP40对肺腺癌细胞生长的影响
对照组SPC-A-1细胞生长的OD值为0.973±0.095;TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长的抑制作用不明显，OD值为0.965±0.080;浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，OD值为0.744±0.100;浓度为10及100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长具有很强的抑制作用，OD值分别为0.547±0.054和0.282±0.029。它们的变化趋势见(图2)，经统计分析(随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法)，0.1ng/ml时的OD值与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的OD值与对照组有差异，且随着浓度增加OD值下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞生长的抑制呈剂量依赖。
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图2 不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞生长的OD值
*P<0.05 **P<0.01
2.3 TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响
对照组SPC-A-1细胞3H-亮氨酸掺入量为66.16±7.11Bq；TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制作用不明显，3H-亮氨酸掺入量为65.13±7.23Bq；浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，3H亮氨酸掺入量为51.59±5.06Bq；浓度为10ng/ml及100ng/ml时,对SPC-A-1细胞蛋白质合成具有很强的抑制作，3H-亮氨酸掺入量分别为22.33±3.27Bq及11.08±1.74Bq。IC50为6.26ng/ml。它们的变化趋见(图3)，经统计分析(随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法)，0.1ng/ml时的3H-亮氨酸掺入量与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的3H亮氨酸掺入量与对照组有差异，且随着浓度增加3H-亮氨酸掺入量下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制呈剂量依赖。
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图3 不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞3H-亮氨酸掺入量
*P<0.05 **P<0.01
2.4 EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用
EGF竞争组3H-亮氨酸的掺入量(64.52±6.25Bq)显著高于aFGF竞争组(22.55±2.82Bq)及TP40组(22.13±3.17Bq)，P<0.01，接近未加TP40及其他生长因子的空白对照组(66.01±7.01Bq)，p>0.05。说明EGF能竞争性地拮抗TP40对SPC-A-1细胞的毒性作用，提示:TP40的作用部位在细胞的EGFR。
3 讨论
EGFR是广泛存在于哺乳类细胞表面的膜受体，它通过伸在细胞外的配体结合结构域可以和EGF或TGFα结合，传递生长因子的信号，影响细胞的生长或分化。EGFR的蛋白激酶结构域和癌基因v-erbB1高度同源，人EGFR基因定位在第7号染色体上。肿瘤细胞EGFR的高水平表达可能是EGFR基因扩增、重排或转录控制异常所致[3]。本研究结果表明，人肺腺癌SPC-A-1细胞能高水平地表达EGFR。肿瘤EGFR阳性表达已被认为是不良分化的重要标志,因而具有更大恶性潜能和生长优势，预后不良。肺腺癌细胞表面高水平表达的EGFR可以成为抑制其生长的导向攻击目标。
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随着基因工程技术的日臻成熟，重组生长因子毒素融合蛋白对相应生长因子受体过度表达的肿瘤细胞生长的导向抑制已成为目前抗癌研究的热点之一。TGFα是一种转化细胞异常表达的多肽类生长因子，其结构与EGF有同源性，能与EGFR结合，介导细胞增殖效应或细胞表型可逆性转化[4]。绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas extoxinA，PE)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面PE受体的结合进入细胞，催化延伸因子2(elongation factor2)的ADP-核糖基化(ADP-ribosylation),阻止蛋白质合成而导致细胞死亡。PE分子由三部分组成，包括受体结合、转位和活性结构域。如果将PE分子中与受体结合的结构域去除，则剩余的部分PE40失去与PE受体结合进入细胞的能力[5]。利用基因工程手段将TGFαcDNA顺序与PE40片断cDNA顺序连接，并插入表达型载体，构建成可表达的重组质粒，转化大肠杆菌后表达出有生理活性的TGFα-PE40融合蛋白。TGFα-PE40具有和表达EGFR的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用，同时，携带PE40进入细胞，高效地阻断靶细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡[6]。研究表明，TP40对EGFR表达水平较高的膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌及脑胶质瘤等细胞的生长有较强的导向抑制作用[7～10]。
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TP40对靶细胞蛋白质合成抑制作用的强度显然依赖细胞表面EGFR的分子数[6]。本研究将TP40加入人肺腺癌SPC-A-1细胞的培养液中，对细胞的蛋白质合成具有较强的抑制作用，从而抑制SPC-A-1细胞的生长。我们外加过量EGF能竞争拮抗TP40的细胞毒性，说明TP40是通过和EGFR的专一结合而起作用的。利用肺腺癌与正常肺组织EGFR表达水平的差异，可选择合适的TP40浓度，以达到对肺腺癌细胞有效杀伤，而对正常肺组织较小损害的目的。本研究为进一步的动物实验研究和临床研究奠定了基础。TP40对肺腺癌细胞增殖所具有的导向抑制作用，为临床肺腺癌的生物治疗研究开辟了一个新的领域。
通讯作者：徐永华：Tel：86-21-64711349
Fax：86-21-64331019
E-mail：yhxu@sunm.shcnc.ac.cn
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收稿日期:1999-04-28;修回日期:1999-05-21, 百拇医药