单克隆抗体对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞分泌细胞因子的影响
作者：佟振月 赵亚滨 许丽彦 李艳玲 侯显明
单位：佟振月(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；赵亚滨(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；李艳玲(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；侯显明(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；许丽彦(辽宁省人民医院呼吸内科)
关键词：
中华医学杂志000629 我们试图采用CD11b、CD18、CD54单克隆抗体(单抗)调节博莱霉素(BLM)大鼠肺纤维化1周的肺泡巨噬细胞(AM)的靶位抗原表达，观察其分泌IL-8、血小板衍生生长因子(PDGF)、一氧化氮(NO)水平的变化，初步探讨其改善肺损伤以及抑制成纤维细胞增殖的机制，为通过抗粘附分子的抗炎治疗来防治肺纤维化的发生奠定实验依据。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.BLM肺纤维化大鼠模型的制备：用硫苯妥钠(2 mg/100 g)麻醉大鼠，固定，逐层暴露气管，将抽取含BLM-A5(天津河北制药厂)0.5 mg/100 g或单纯生理盐水(0.2～0.3 ml)1 ml经两气管软骨环间隙向心端刺入气管，将大鼠直立后将药液注入气管，旋转动物，使其均匀分布。
2.AM纯化及条件培养上清的留取：将纤维化1周的大鼠(5只)，处死，暴露心肺，行支气管肺泡灌洗(8 ml×10)，离心，将细胞团用含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI-1640悬浮，经37℃，体积分数0.05的CO2，100%饱和水蒸气，孵育2 h，将纯化后的AM用含0.2%的RPMI-1640调整细胞数为5.0×105/ml，将每只大鼠的AM分3组进行培养。空白对照组：纤维化1周的大鼠AM的培养。单抗组：纤维化1周的AM中分别加入不同种类及不同浓度的单抗(按1、5、25 μg/ml)，根据单抗的不同分为5组：(1)抗CD11b拮抗组；(2)抗CD18拮抗组；(3)抗CD54拮抗组；(4)抗CD11b+CD54组(各
, 百拇医药
25 μg/ml)；(5)抗CD18+CD54组(各25 μg/ml)。IgG对照组：纤维化1周的AM分别加入正常小鼠不同浓度的IgG代替单抗。行24孔培养板培养24 h。收集培养上清，-70℃冻存备用。
3.单抗来源：抗CD11b、CD18、CD54为英国Serotec公司。
4.NO的检测步骤：按试剂盒进行，NO试剂盒购自北京东亚所，采用Griess法[1]。
5.IL-8的检测：采用ELISA法，试剂盒购自美国Endogen公司。
6.PDGF检测：采用生物活性法[2]。
7.统计学方法：采用计量资料t检验。
二、结果
, 百拇医药
1.单抗对BLM大鼠1周AM分泌NO的影响：CD11b，CD54抗体拮抗AM后的培养上清NO含量减少，与单纯AM(空白对照组)差异有显著意义(P<0.05)，且随着抗体剂量的增加，NO分泌减少更明显。当CD11b、CD54为1 μg/ml时即能减少分泌，与对照组差异有显著意义(P<0.05)。CD18为25 μg/ml时，虽能减少其分泌，但与对照组差异无显著性意义。而CD18与CD54及CD11b与CD54的联合作用较单一抗体的拮抗作用强，与对照组差异有非常显著意义。
2.单抗对BLM大鼠1周AM分泌IL-8的影响：单抗CD11b、CD18、CD54能明显抑制AM分泌IL-8水平，与对照组差异有非常显著意义(表1)。
3.单抗对BLM大鼠1周AM释放PDGF水平的影响：CD11/CD18，CD54的单抗对AM分泌的PDGF无明显影响。
表1 CD11b，CD18，CD54单抗对AM分泌IL-8的影响(
±s) 分组
, http://www.100md.com
鼠数
IL-8水平(pg/ml)
不含抗体
加抗体
1 μg/ml
加抗体
5 μg/ml
加抗体
25 μg/ml
空白对照组
5
256±50
IgG对照组
, 百拇医药
5
234±11
220±13
210±12
抗CD11b组
42± 6*
48± 5*
36± 6*
抗CD18组
71±10*
39± 5*
, 百拇医药
75±12*
抗CD54组
23±11*
32±10*
47±12*
抗CD11b+
CD54
54± 3*
抗CD18+
CD54
33±12*
, 百拇医药
注：与空白对照组比较*t=4.655 P<0.01
图1 抗体对BLM大鼠1周AM释放PDGF的影响
各组与对照组比较差异无显著意义(图1)。
三、讨论
本结果表明，CD11b、CD54单抗可使致纤维化1周大鼠的AM培养上清NO水平明显下降，且与剂量有一定的关系。因此证明CD11/CD18相关的氧代谢产物对肺纤维化的发生可能发挥一定的作用。另外，CD11b、CD18、CD54单抗可明显降低IL-8的水平，抗体的联合作用也较强。而AM分泌IL-8水平增高，进一步趋化大量中性粒细胞聚集在肺内，具有放大炎症反应及促进肺成纤维细胞增殖的作用[3]。因此，白细胞粘附分子单抗CD11b、CD11a逆转肺纤维化形成，有可能通过AM活化下降，致炎性细胞因子的减少导致肺泡炎的活动下降。实验中单抗不影响血小板生长因子的分泌，说明其可能通过改变其它细胞因子(IL-1、TGF-β、TNF-α)的水平影响对成纤维细胞的增殖反应。已经证明，CD54的反义寡核苷酸以及基因剔除可改善炎症性肺损伤的发生[4]。通过阻滞炎性细胞的激活以及细胞因子的释放，粘附分子的阻滞治疗肺间质纤维化已显示出一定的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
1，佟振月，赵亚滨，侯显明.白细胞粘附分子单抗对成纤维细胞增殖作用的影响.中华结核和呼吸杂志，1999，22：48-51.
2，Allam M, Martinet N, Gallati M, et al. Platlet-derived growth factor AA and dimers are present in normal human epithelial lining fluid. Eur Respir J, 1993,6:1162-1168.
3，石井芳树，北村喻.Acute lung injury と接着分子.呼吸，1993，12：144-154.
4，Kumasaka T, Quinlan WM, Doyle NA, et al. Role of the intercellular adhesion olecule-1 in endotoxin-induced pneumonia evaluated using ICAM-1 mutant mice. J Clin Invest, 1996,97:2362-2369.
(收稿日期：1999-07-28), http://www.100md.com
单位：佟振月(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；赵亚滨(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；李艳玲(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；侯显明(沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所 110001)；许丽彦(辽宁省人民医院呼吸内科)
关键词：
中华医学杂志000629 我们试图采用CD11b、CD18、CD54单克隆抗体(单抗)调节博莱霉素(BLM)大鼠肺纤维化1周的肺泡巨噬细胞(AM)的靶位抗原表达，观察其分泌IL-8、血小板衍生生长因子(PDGF)、一氧化氮(NO)水平的变化，初步探讨其改善肺损伤以及抑制成纤维细胞增殖的机制，为通过抗粘附分子的抗炎治疗来防治肺纤维化的发生奠定实验依据。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.BLM肺纤维化大鼠模型的制备：用硫苯妥钠(2 mg/100 g)麻醉大鼠，固定，逐层暴露气管，将抽取含BLM-A5(天津河北制药厂)0.5 mg/100 g或单纯生理盐水(0.2～0.3 ml)1 ml经两气管软骨环间隙向心端刺入气管，将大鼠直立后将药液注入气管，旋转动物，使其均匀分布。
2.AM纯化及条件培养上清的留取：将纤维化1周的大鼠(5只)，处死，暴露心肺，行支气管肺泡灌洗(8 ml×10)，离心，将细胞团用含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI-1640悬浮，经37℃，体积分数0.05的CO2，100%饱和水蒸气，孵育2 h，将纯化后的AM用含0.2%的RPMI-1640调整细胞数为5.0×105/ml，将每只大鼠的AM分3组进行培养。空白对照组：纤维化1周的大鼠AM的培养。单抗组：纤维化1周的AM中分别加入不同种类及不同浓度的单抗(按1、5、25 μg/ml)，根据单抗的不同分为5组：(1)抗CD11b拮抗组；(2)抗CD18拮抗组；(3)抗CD54拮抗组；(4)抗CD11b+CD54组(各
, 百拇医药
25 μg/ml)；(5)抗CD18+CD54组(各25 μg/ml)。IgG对照组：纤维化1周的AM分别加入正常小鼠不同浓度的IgG代替单抗。行24孔培养板培养24 h。收集培养上清，-70℃冻存备用。
3.单抗来源：抗CD11b、CD18、CD54为英国Serotec公司。
4.NO的检测步骤：按试剂盒进行，NO试剂盒购自北京东亚所，采用Griess法[1]。
5.IL-8的检测：采用ELISA法，试剂盒购自美国Endogen公司。
6.PDGF检测：采用生物活性法[2]。
7.统计学方法：采用计量资料t检验。
二、结果
, 百拇医药
1.单抗对BLM大鼠1周AM分泌NO的影响：CD11b，CD54抗体拮抗AM后的培养上清NO含量减少，与单纯AM(空白对照组)差异有显著意义(P<0.05)，且随着抗体剂量的增加，NO分泌减少更明显。当CD11b、CD54为1 μg/ml时即能减少分泌，与对照组差异有显著意义(P<0.05)。CD18为25 μg/ml时，虽能减少其分泌，但与对照组差异无显著性意义。而CD18与CD54及CD11b与CD54的联合作用较单一抗体的拮抗作用强，与对照组差异有非常显著意义。
2.单抗对BLM大鼠1周AM分泌IL-8的影响：单抗CD11b、CD18、CD54能明显抑制AM分泌IL-8水平，与对照组差异有非常显著意义(表1)。
3.单抗对BLM大鼠1周AM释放PDGF水平的影响：CD11/CD18，CD54的单抗对AM分泌的PDGF无明显影响。
表1 CD11b，CD18，CD54单抗对AM分泌IL-8的影响(
±s) 分组, http://www.100md.com
鼠数
IL-8水平(pg/ml)
不含抗体
加抗体
1 μg/ml
加抗体
5 μg/ml
加抗体
25 μg/ml
空白对照组
5
256±50
IgG对照组
, 百拇医药
5
234±11
220±13
210±12
抗CD11b组
42± 6*
48± 5*
36± 6*
抗CD18组
71±10*
39± 5*
, 百拇医药
75±12*
抗CD54组
23±11*
32±10*
47±12*
抗CD11b+
CD54
54± 3*
抗CD18+
CD54
33±12*
, 百拇医药
注：与空白对照组比较*t=4.655 P<0.01
图1 抗体对BLM大鼠1周AM释放PDGF的影响
各组与对照组比较差异无显著意义(图1)。
三、讨论
本结果表明，CD11b、CD54单抗可使致纤维化1周大鼠的AM培养上清NO水平明显下降，且与剂量有一定的关系。因此证明CD11/CD18相关的氧代谢产物对肺纤维化的发生可能发挥一定的作用。另外，CD11b、CD18、CD54单抗可明显降低IL-8的水平，抗体的联合作用也较强。而AM分泌IL-8水平增高，进一步趋化大量中性粒细胞聚集在肺内，具有放大炎症反应及促进肺成纤维细胞增殖的作用[3]。因此，白细胞粘附分子单抗CD11b、CD11a逆转肺纤维化形成，有可能通过AM活化下降，致炎性细胞因子的减少导致肺泡炎的活动下降。实验中单抗不影响血小板生长因子的分泌，说明其可能通过改变其它细胞因子(IL-1、TGF-β、TNF-α)的水平影响对成纤维细胞的增殖反应。已经证明，CD54的反义寡核苷酸以及基因剔除可改善炎症性肺损伤的发生[4]。通过阻滞炎性细胞的激活以及细胞因子的释放，粘附分子的阻滞治疗肺间质纤维化已显示出一定的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
1，佟振月，赵亚滨，侯显明.白细胞粘附分子单抗对成纤维细胞增殖作用的影响.中华结核和呼吸杂志，1999，22：48-51.
2，Allam M, Martinet N, Gallati M, et al. Platlet-derived growth factor AA and dimers are present in normal human epithelial lining fluid. Eur Respir J, 1993,6:1162-1168.
3，石井芳树，北村喻.Acute lung injury と接着分子.呼吸，1993，12：144-154.
4，Kumasaka T, Quinlan WM, Doyle NA, et al. Role of the intercellular adhesion olecule-1 in endotoxin-induced pneumonia evaluated using ICAM-1 mutant mice. J Clin Invest, 1996,97:2362-2369.
(收稿日期：1999-07-28), http://www.100md.com