以孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞进行苯丙酮尿症的非损伤性产前基因诊断
作者：蔡胜和 刘国仰 袁丽芳 丁立 王晓斌 郎铁明 张秀清 吴敏 孙敏 高春生 刘德培 杨焕明
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学遗传室，北京100005
关键词：孕为外周血；苯丙酮尿症；胎儿有核红细胞；非损伤性产前诊断
中国医学科学院学报990422 中图号 R714.55 R696
从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行非损伤性产前基因诊断，对胎儿和孕妇均无损伤，易于被接受与推广，是遗传病产前诊断的发展方向。但是这一领域的研究一直因材料与技术的限制而发展较缓慢。本组采用从孕妇外周血中分离的单个胎儿有核红细胞，对两例苯丙酮尿症(PKU)风险胎儿进行产前基因诊断。
方法 两例PKU携带者孕妇外周血各10 ml,用三密度梯度离心方法分离获得的有核红细胞，经磁性激活的细胞分离(MACS)法富集CD71+细胞。后者经免疫组化染色，鉴别出胎儿血红蛋白阳性(Hb F+)细胞。用显微操作仪控制的玻璃针挑取单个Hb F+细胞，分别置于0.5 ml薄壁PCR管中。采用引物延伸预扩增(primer extension pre-amplification,PEP)法进行单个细胞基因组DNA总扩增，以PEP产物作为随后基因分析的模板。扩增ZFX/ZFY位点，用于确定胎儿性别。采用苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内含子3中四核苷酸重复的多态性遗传标记(STR)和D5S637分析父、母与所挑取的Hb F+细胞的基因型。用连锁分析方法对PKU风险胎儿进行诊断，并且用单链构象多态性(SSCP)检测PAH基因的特异突变。
结果 在病例1中得到6个、在病例2中得到3个Hb F+细胞。对单个细胞分别进行性别鉴定和基因型分析，结果均表明所挑取的细胞为胎儿细胞，无母体或其它来源的污染。连锁分析表明，第1例胎儿的基因型与先症者一样，同时遗传有父源和母源的致病等位基因；并且在胎儿细胞PAH外显子11中检测到特定的基因突变。因此，此例胎儿为PKU患者。第2例胎儿的基因型与母亲相同，而与先症者不同。因此，此例胎儿不是PKU患者。上述结果与采用胎儿绒毛独立进行的诊断结论相同。
讨论 本实验以免疫组化染色鉴定和显微操作挑取细胞为基础，对每一个挑取的Hb F+细胞单独进行遗传分析，将胎儿细胞的鉴别从形态学、组织化学水平深入到分子遗传学水平。通过性别分析、多态性遗传标记孟德尔遗传规律分析，可以完全确定所挑取的细胞是否确实是真正的胎儿细胞，并能识别有无母体细胞或其它来源的污染，从而获得纯胎儿DNA。由于预先进行了PEP，单个细胞基因组可扩大50倍以上，足够用于进行20次以上PCR扩增，为随后的遗传分析提供了充足的模板。虽然在PEP过程中可能会发生等位基因丢失，但这种现象出现的机率很小，并可以通过比较多个细胞的PCR扩增结果进行识别与排除。以单个细胞的PEP产物为模板，可以用连锁分析或直接检测特异基因突变两种方法进行基因诊断。
△中华医学基金会(CMB)(95-617)基金，国家杰出青年科学基金(39425011)资助；*中国科学院遗传研究所人类基因组中心，北京100810；#通讯作者
(1999-05-27收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学遗传室，北京100005
关键词：孕为外周血；苯丙酮尿症；胎儿有核红细胞；非损伤性产前诊断
中国医学科学院学报990422 中图号 R714.55 R696
从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行非损伤性产前基因诊断，对胎儿和孕妇均无损伤，易于被接受与推广，是遗传病产前诊断的发展方向。但是这一领域的研究一直因材料与技术的限制而发展较缓慢。本组采用从孕妇外周血中分离的单个胎儿有核红细胞，对两例苯丙酮尿症(PKU)风险胎儿进行产前基因诊断。
方法 两例PKU携带者孕妇外周血各10 ml,用三密度梯度离心方法分离获得的有核红细胞，经磁性激活的细胞分离(MACS)法富集CD71+细胞。后者经免疫组化染色，鉴别出胎儿血红蛋白阳性(Hb F+)细胞。用显微操作仪控制的玻璃针挑取单个Hb F+细胞，分别置于0.5 ml薄壁PCR管中。采用引物延伸预扩增(primer extension pre-amplification,PEP)法进行单个细胞基因组DNA总扩增，以PEP产物作为随后基因分析的模板。扩增ZFX/ZFY位点，用于确定胎儿性别。采用苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内含子3中四核苷酸重复的多态性遗传标记(STR)和D5S637分析父、母与所挑取的Hb F+细胞的基因型。用连锁分析方法对PKU风险胎儿进行诊断，并且用单链构象多态性(SSCP)检测PAH基因的特异突变。
结果 在病例1中得到6个、在病例2中得到3个Hb F+细胞。对单个细胞分别进行性别鉴定和基因型分析，结果均表明所挑取的细胞为胎儿细胞，无母体或其它来源的污染。连锁分析表明，第1例胎儿的基因型与先症者一样，同时遗传有父源和母源的致病等位基因；并且在胎儿细胞PAH外显子11中检测到特定的基因突变。因此，此例胎儿为PKU患者。第2例胎儿的基因型与母亲相同，而与先症者不同。因此，此例胎儿不是PKU患者。上述结果与采用胎儿绒毛独立进行的诊断结论相同。
讨论 本实验以免疫组化染色鉴定和显微操作挑取细胞为基础，对每一个挑取的Hb F+细胞单独进行遗传分析，将胎儿细胞的鉴别从形态学、组织化学水平深入到分子遗传学水平。通过性别分析、多态性遗传标记孟德尔遗传规律分析，可以完全确定所挑取的细胞是否确实是真正的胎儿细胞，并能识别有无母体细胞或其它来源的污染，从而获得纯胎儿DNA。由于预先进行了PEP，单个细胞基因组可扩大50倍以上，足够用于进行20次以上PCR扩增，为随后的遗传分析提供了充足的模板。虽然在PEP过程中可能会发生等位基因丢失，但这种现象出现的机率很小，并可以通过比较多个细胞的PCR扩增结果进行识别与排除。以单个细胞的PEP产物为模板，可以用连锁分析或直接检测特异基因突变两种方法进行基因诊断。
△中华医学基金会(CMB)(95-617)基金，国家杰出青年科学基金(39425011)资助；*中国科学院遗传研究所人类基因组中心，北京100810；#通讯作者
(1999-05-27收稿), http://www.100md.com