富集孕妇外周血中胎儿细胞行胎儿性别诊断
作者：宋杰 李守柔 张爱臣 黄冰玉 何为公 庞传超
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院妇产科
关键词：性决定；产前诊断；聚合酶链反应
中华妇产科杂志980203 【摘要】 目的 探讨对孕妇外周血中胎儿细胞进行非侵入性产前诊断的可行性。方法 对64例孕8～40周孕妇外周血进行密度梯度离心法，富集胎儿细胞，并经显微镜下观察计数各种细胞所占百分比。同时，对所富集细胞经提取DNA进行人Y染色体特异DNA扩增，判定胎儿性别并与新生儿性别进行对照。结果 64例孕妇外周血中，25例观察到有核红细胞，占39.06%。64例孕妇分娩33例男性婴儿，其中28例扩增出Y特异带；另外31例分娩女性婴儿，除1例出现Y特异带，其余未见特异带。诊断的灵敏度为84.85%，特异度为96.77%，总符合率为90.63%。结论 密度梯度离心法可从孕妇血中富集胎儿细胞，且所获得细胞已基本满足体外扩增Y染色体基因所需要的模板量。
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Detection and Enrichment of Fetal Cells in Maternal Circulation for Prenatal Diagnosis of Fetal Sex Song Jie, Li Shourou, Zhang Aichen, et al. Second Clinical Hospital, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study fetal cells from maternal peripheral blood for prenatal diagnosis of fetal sex. Methods Samples of peripheral blood in 64 women of 8～40 gestational weeks were collected to enrich the fetal nucleated red blood cells by density gradient centrifugation. DNA was extracted from each samples of enriched fetal cell for PCR amplification of Y chromosome specific DNA to determine fetal sex. Results Fetal nucleated red cells were found in 25 out of 64 maternal samples (39.06%). Y chromosome 149 bp was found in 28 cases of the 33 mothers given birth to male babies. One Y specific DNA sequence was detected in 31 women had female babies. The sensitivity was 84.85% and specificity 96.77%. The overall agreement of the diagnosis was 90.63%. Conclusion Density gradient centrifugation can enrich fetal nucleated red blood cells from maternal peripheral blood. Fetal sex can be determined by PCR amplification of Y chromosome specific DNA with these fetal cells.
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【Key words】 Sex determination Prenatal diagnosis Polymerase chain reaction
胎儿细胞存在于孕妇血循环内已被许多学者证实[1～3]，但数量极少且在不同孕周及不同个体之间存在很大差异。胎儿细胞包括胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞。如何对上述细胞加以富集、分离并进行胎儿基因诊断，是目前产前诊断研究的一个热点。国外学者大多利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞[4，5]，但价格昂贵，技术复杂，不适合临床一般实验条件下开展此项研究工作。为了探讨利用孕妇血中胎儿细胞进行产前诊断的可能性，建立无创伤性且准确可靠的产前诊断新途径，我们设计了密度梯度离心法富集孕妇血中胎儿细胞，并经显微镜下观察，证实了孕妇血中胎儿细胞的存在，用聚合酶链反应(PCR)扩增Y染色体特异DNA序列进行胎儿性别判定。现将结果报道如下。
, http://www.100md.com 资料与方法
一、标本来源
外周血采自孕龄为8～40周的妊娠妇女，共64例，均为第一次妊娠，无贫血等合并症。每次采血为10 ml，放入盛有2 ml 0.1%肝素的无菌瓶中，并用磷酸盐缓冲液(PBS)行1∶1稀释后混合备用。
二、方法
1.密度梯度离心法富集胎儿细胞：采用改良一步法[6]富集胎儿细胞。所用分离介质为Sigma公司生产的聚蔗糖与泛影酸钠混合物(histopaque)。具体方法为：将2 ml分离液histopaque 1109 (由histo- paque 1119与histopaque 1077按3∶1比例混合而成)及2 ml分离液histopaque 1077，分别轻轻加入10 ml离心管内，使之不混合。然后将已稀释好的孕妇血6 ml缓慢铺于分离液界面上。室温下以2 000 r/min离心20分钟。见离心管内出现上下两个界面层，而最底层为成熟红细胞。用吸管分别取上下两层界面细胞，经PBS洗涤两次后各取10 μl，经涂片、瑞氏染色，普通光学显微镜下观察，高倍镜下记数200个细胞，记录各种细胞出现的百分比并计算平均值。细胞类型有成熟红细胞、有核红细胞、单核淋巴细胞及多核细胞。
, 百拇医药
2.PCR扩增人Y染色体特异序列：将经密度梯度离心的下层细胞用十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提蛋白质，乙醇沉液DNA。以人Y染色体长臂特异的3.4 kb重复序列为扩增对象，扩增产物为149 bp的DNA片段。引物序列为Y1.1(5′-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3′)，Y1.2(5′-TTGAATGGAATGGGAACGAATGG-3′)。引物由391型DNA/RNA合成仪合成。PCR反应在50 μl反应系统中进行。含模板DNA 10 μl，脱氧核糖核酸各200 μmol/L、引物0.5 μmol/L, Taq DNA酶2.5 U(华美公司)、buffer缓冲液10 μl。以30 μl液体石蜡覆盖反应液表面。短暂离心后开始热循环周期。变性94℃60秒，退火57℃90秒，延伸70℃120秒，共35周期。最后取扩增产物10 μl，在含溴化乙啶(EB)的2%琼脂糖凝胶上点样电泳检测。以pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ为分子标尺，紫外透射反射分析仪下观察照相。每次扩增均以1例未婚且无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
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结果
一、外周血中各细胞比率
离心后获上、下两层界面细胞，上层细胞主要为单核淋巴细胞，占95.00%；多核细胞占5.00%。而成熟红细胞及有核红细胞为0.00%。而下层细胞主要为成熟红细胞，占78.00%；多核细胞占20.00%。其中25例发现1～2个有核红细胞，占总例数的39.06%(25/64)。
二、PCR扩增Y染色体特异序列
64例孕妇共分娩33例男性婴儿，其中28例扩增出Y特异带，灵敏度为84.85%(28/33)；假阴性5例，假阴性率15.15%(5/33)。另外31例分娩女性婴儿，除1例出现特异带外其余未见特异带。故特异度为96.77%(30/31)；假阳性率为3.23%(1/31)。诊断的总符合率为90.63%(28+30/64)。
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一、孕妇外周血胎儿细胞的富集
由于孕妇血中胎儿细胞稀少，故对其进行富集、纯化是进行胎儿性别和疾病诊断的先决条件。1989年Lo等[7]首次应用孕妇外周血直接提取DNA进行Y染色体特异序列扩增，成功预测了部分胎儿性别，但出现了假阳性及假阴性结果。探讨其原因，除各种情况导致污染、方法条件不当外，母血中胎儿细胞DNA含量达不到一般扩增条件所要求的最低模板量也是重要原因。因此，我们选择Sigma公司histopaque为离心介质，通过配制适合富集胎儿细胞的梯度，参考国外学者的双重密度一步离心法富集胎儿细胞，经瑞氏染色后在下层细胞中可见少数有核红细胞。因在正常成年人外周血中不应出现有核红细胞，故推测其可能来源于胎儿[8]。有核红细胞检出的时间集中于孕28周之前，以12～16周检出的百分比最高，与Simpson等[5]研究结果近似。
, http://www.100md.com 二、PCR扩增技术在胎儿性别判定中的应用
PCR技术是一种极为敏感的检测方法，能使特定的DNA片段甚至单一细胞DNA在几个小时内迅速扩增百万倍。我们选择的扩增对象是Y染色体长臂特异序列，具有扩增相对容易且特异性高的优点[9]。经Y1.1、Y1.2引物介导，通过35个循环后正常男性有149 bp特异扩增带，而女性则无。出现5例假阴性，估计是由于孕妇的个体差异使体内胎儿细胞数极少或胎儿细胞富集不理想所致，也可能是孕妇和胎儿血型不相容，导致孕妇免疫系统对体内的胎儿细胞溶解所致。1例假阳性可能是男性DNA交叉污染的结果。从PCR扩增结果与孕周的关系分析，从孕8周至孕40周，PCR均能较准确地判定胎儿性别，表明此阶段母体血循环内均可能存在胎儿细胞。
总之，我们认为密度梯度离心法可从孕妇血中富集到胎儿细胞，且所获细胞已基本满足PCR扩增Y染色体基因所需的模板量。这为进一步利用胎儿细胞进行其它遗传病的产前诊断奠定了基础。
, 百拇医药
参考文献
1Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, et al. Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescence activated cell sorting. Proc Notl Acad USA, 1979, 76:1453-1455.
2Corone AE, Johnson PM, Hutton D, et al. Trophoblast cell in peripheral blood from pregant women. Lancet, 1984, 75:2102-2106.
3Simpson JL, Eliase S. Isoating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 1994, 14:1229-1242.
, http://www.100md.com
4Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, et al. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:3279-3283.
5Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA, 1993, 270:2357-2361.
6Bhat NM, Bieber MM, Teng NN, et al. One-step enrichment of nucleated red blood cells: a potential application in prenatal diagnosis. J Immunol Methods, 1993, 158:277-280.
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7Lo YMD, Waiscoat JS, Gillmer MDG, et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet, 1989, 2:1365-1369.
8Bianchi DW, Zickwolf GK, Yih MC, et al. Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn, 1993, 13:293-300.
9Suzumori K, Adach R, Okada S, et al. Fetal cells in the maternal circulation: detection of Y-sequence by gene amplification. Obstet Gynecol, 1992, 80:150-154.
(收稿：1996-10-21 修回：1997-07-14)
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单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院妇产科
关键词：性决定；产前诊断；聚合酶链反应
中华妇产科杂志980203 【摘要】 目的 探讨对孕妇外周血中胎儿细胞进行非侵入性产前诊断的可行性。方法 对64例孕8～40周孕妇外周血进行密度梯度离心法，富集胎儿细胞，并经显微镜下观察计数各种细胞所占百分比。同时，对所富集细胞经提取DNA进行人Y染色体特异DNA扩增，判定胎儿性别并与新生儿性别进行对照。结果 64例孕妇外周血中，25例观察到有核红细胞，占39.06%。64例孕妇分娩33例男性婴儿，其中28例扩增出Y特异带；另外31例分娩女性婴儿，除1例出现Y特异带，其余未见特异带。诊断的灵敏度为84.85%，特异度为96.77%，总符合率为90.63%。结论 密度梯度离心法可从孕妇血中富集胎儿细胞，且所获得细胞已基本满足体外扩增Y染色体基因所需要的模板量。
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Detection and Enrichment of Fetal Cells in Maternal Circulation for Prenatal Diagnosis of Fetal Sex Song Jie, Li Shourou, Zhang Aichen, et al. Second Clinical Hospital, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study fetal cells from maternal peripheral blood for prenatal diagnosis of fetal sex. Methods Samples of peripheral blood in 64 women of 8～40 gestational weeks were collected to enrich the fetal nucleated red blood cells by density gradient centrifugation. DNA was extracted from each samples of enriched fetal cell for PCR amplification of Y chromosome specific DNA to determine fetal sex. Results Fetal nucleated red cells were found in 25 out of 64 maternal samples (39.06%). Y chromosome 149 bp was found in 28 cases of the 33 mothers given birth to male babies. One Y specific DNA sequence was detected in 31 women had female babies. The sensitivity was 84.85% and specificity 96.77%. The overall agreement of the diagnosis was 90.63%. Conclusion Density gradient centrifugation can enrich fetal nucleated red blood cells from maternal peripheral blood. Fetal sex can be determined by PCR amplification of Y chromosome specific DNA with these fetal cells.
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【Key words】 Sex determination Prenatal diagnosis Polymerase chain reaction
胎儿细胞存在于孕妇血循环内已被许多学者证实[1～3]，但数量极少且在不同孕周及不同个体之间存在很大差异。胎儿细胞包括胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞。如何对上述细胞加以富集、分离并进行胎儿基因诊断，是目前产前诊断研究的一个热点。国外学者大多利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞[4，5]，但价格昂贵，技术复杂，不适合临床一般实验条件下开展此项研究工作。为了探讨利用孕妇血中胎儿细胞进行产前诊断的可能性，建立无创伤性且准确可靠的产前诊断新途径，我们设计了密度梯度离心法富集孕妇血中胎儿细胞，并经显微镜下观察，证实了孕妇血中胎儿细胞的存在，用聚合酶链反应(PCR)扩增Y染色体特异DNA序列进行胎儿性别判定。现将结果报道如下。
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一、标本来源
外周血采自孕龄为8～40周的妊娠妇女，共64例，均为第一次妊娠，无贫血等合并症。每次采血为10 ml，放入盛有2 ml 0.1%肝素的无菌瓶中，并用磷酸盐缓冲液(PBS)行1∶1稀释后混合备用。
二、方法
1.密度梯度离心法富集胎儿细胞：采用改良一步法[6]富集胎儿细胞。所用分离介质为Sigma公司生产的聚蔗糖与泛影酸钠混合物(histopaque)。具体方法为：将2 ml分离液histopaque 1109 (由histo- paque 1119与histopaque 1077按3∶1比例混合而成)及2 ml分离液histopaque 1077，分别轻轻加入10 ml离心管内，使之不混合。然后将已稀释好的孕妇血6 ml缓慢铺于分离液界面上。室温下以2 000 r/min离心20分钟。见离心管内出现上下两个界面层，而最底层为成熟红细胞。用吸管分别取上下两层界面细胞，经PBS洗涤两次后各取10 μl，经涂片、瑞氏染色，普通光学显微镜下观察，高倍镜下记数200个细胞，记录各种细胞出现的百分比并计算平均值。细胞类型有成熟红细胞、有核红细胞、单核淋巴细胞及多核细胞。
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2.PCR扩增人Y染色体特异序列：将经密度梯度离心的下层细胞用十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提蛋白质，乙醇沉液DNA。以人Y染色体长臂特异的3.4 kb重复序列为扩增对象，扩增产物为149 bp的DNA片段。引物序列为Y1.1(5′-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3′)，Y1.2(5′-TTGAATGGAATGGGAACGAATGG-3′)。引物由391型DNA/RNA合成仪合成。PCR反应在50 μl反应系统中进行。含模板DNA 10 μl，脱氧核糖核酸各200 μmol/L、引物0.5 μmol/L, Taq DNA酶2.5 U(华美公司)、buffer缓冲液10 μl。以30 μl液体石蜡覆盖反应液表面。短暂离心后开始热循环周期。变性94℃60秒，退火57℃90秒，延伸70℃120秒，共35周期。最后取扩增产物10 μl，在含溴化乙啶(EB)的2%琼脂糖凝胶上点样电泳检测。以pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ为分子标尺，紫外透射反射分析仪下观察照相。每次扩增均以1例未婚且无妊娠史的女性及1例男性外周血DNA作阴性和阳性对照。
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结果
一、外周血中各细胞比率
离心后获上、下两层界面细胞，上层细胞主要为单核淋巴细胞，占95.00%；多核细胞占5.00%。而成熟红细胞及有核红细胞为0.00%。而下层细胞主要为成熟红细胞，占78.00%；多核细胞占20.00%。其中25例发现1～2个有核红细胞，占总例数的39.06%(25/64)。
二、PCR扩增Y染色体特异序列
64例孕妇共分娩33例男性婴儿，其中28例扩增出Y特异带，灵敏度为84.85%(28/33)；假阴性5例，假阴性率15.15%(5/33)。另外31例分娩女性婴儿，除1例出现特异带外其余未见特异带。故特异度为96.77%(30/31)；假阳性率为3.23%(1/31)。诊断的总符合率为90.63%(28+30/64)。
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一、孕妇外周血胎儿细胞的富集
由于孕妇血中胎儿细胞稀少，故对其进行富集、纯化是进行胎儿性别和疾病诊断的先决条件。1989年Lo等[7]首次应用孕妇外周血直接提取DNA进行Y染色体特异序列扩增，成功预测了部分胎儿性别，但出现了假阳性及假阴性结果。探讨其原因，除各种情况导致污染、方法条件不当外，母血中胎儿细胞DNA含量达不到一般扩增条件所要求的最低模板量也是重要原因。因此，我们选择Sigma公司histopaque为离心介质，通过配制适合富集胎儿细胞的梯度，参考国外学者的双重密度一步离心法富集胎儿细胞，经瑞氏染色后在下层细胞中可见少数有核红细胞。因在正常成年人外周血中不应出现有核红细胞，故推测其可能来源于胎儿[8]。有核红细胞检出的时间集中于孕28周之前，以12～16周检出的百分比最高，与Simpson等[5]研究结果近似。
, http://www.100md.com 二、PCR扩增技术在胎儿性别判定中的应用
PCR技术是一种极为敏感的检测方法，能使特定的DNA片段甚至单一细胞DNA在几个小时内迅速扩增百万倍。我们选择的扩增对象是Y染色体长臂特异序列，具有扩增相对容易且特异性高的优点[9]。经Y1.1、Y1.2引物介导，通过35个循环后正常男性有149 bp特异扩增带，而女性则无。出现5例假阴性，估计是由于孕妇的个体差异使体内胎儿细胞数极少或胎儿细胞富集不理想所致，也可能是孕妇和胎儿血型不相容，导致孕妇免疫系统对体内的胎儿细胞溶解所致。1例假阳性可能是男性DNA交叉污染的结果。从PCR扩增结果与孕周的关系分析，从孕8周至孕40周，PCR均能较准确地判定胎儿性别，表明此阶段母体血循环内均可能存在胎儿细胞。
总之，我们认为密度梯度离心法可从孕妇血中富集到胎儿细胞，且所获细胞已基本满足PCR扩增Y染色体基因所需的模板量。这为进一步利用胎儿细胞进行其它遗传病的产前诊断奠定了基础。
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参考文献
1Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, et al. Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescence activated cell sorting. Proc Notl Acad USA, 1979, 76:1453-1455.
2Corone AE, Johnson PM, Hutton D, et al. Trophoblast cell in peripheral blood from pregant women. Lancet, 1984, 75:2102-2106.
3Simpson JL, Eliase S. Isoating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 1994, 14:1229-1242.
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4Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, et al. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:3279-3283.
5Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA, 1993, 270:2357-2361.
6Bhat NM, Bieber MM, Teng NN, et al. One-step enrichment of nucleated red blood cells: a potential application in prenatal diagnosis. J Immunol Methods, 1993, 158:277-280.
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7Lo YMD, Waiscoat JS, Gillmer MDG, et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet, 1989, 2:1365-1369.
8Bianchi DW, Zickwolf GK, Yih MC, et al. Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn, 1993, 13:293-300.
9Suzumori K, Adach R, Okada S, et al. Fetal cells in the maternal circulation: detection of Y-sequence by gene amplification. Obstet Gynecol, 1992, 80:150-154.
(收稿：1996-10-21 修回：1997-07-14)
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