宽口径毛细管柱GC测定鸡粪中T-2毒素代谢产物的方法
作者：周宏博 李德安 李群伟 杨秋慧
单位：哈尔滨医科大学 大骨节病研究所，黑龙江 哈尔滨 150001
关键词：气相色谱；T-2毒素代谢物；鸡粪
中国地方病学杂志000224 摘要 目的 测定鸡粪中T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素、HT-2毒素的含量。方法 人工染毒，化学提取，TBT衍生，宽口径毛细管柱GC测定，投予剂量不同回收率略有差异。结果 该方法的回收率200ngT-2四醇83.1%～92.8%;T-2三醇 83.6%～90.6%;T-2毒素、HT-2毒素79.6%～90.6%。结论 方法的回收率高，操作简单，可供研究T-2毒素代谢机制应用。
中图分类号 TH833
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0142-03
, 百拇医药
Using the wide caliber gas-chromatography to detect the content
of T-2 toxin metabloites in chicken excreta
ZHOU Hong-bo,LI De-an,LI Qun-wei,et al
(Kaschin-Beck Disease Institute,Harbin Medical University,Harbin 150001,China)
Abstract Objective Detect the content of T-2tetraol,T-2 triol,T-2 txoin and HT-2 toxin in chicken excreta.Methods Chickens are feed with T-2 toxin by intraperitoneal injection.The metabolites are extracted by acetonitrile and derivated by TBT,then detected with the wide caliber GC.Results The average recoveries are 83.1%～92.8% for T-2 tetraol;83.6%～90.6% for T-2 triol and 79.6%～90.6% for T-2 toxin and HT-2 toxin.Conclusions The method is simple.The average recoveries are high.The method provides a good tool for detection of T-2 toxin metablolites in bio-excreta.
, 百拇医药
Key words Gas chromatography;Metabolites of T-2 toxin;Chicken excrement▲
文献报告大骨节病病因物质是T-2毒素[1]。T-2毒素属于单端孢霉烯族毒素，毒性强，自然界中广泛存在。人畜摄入污染粮食则引起急性和慢性中毒[2]。T-2毒素在人体中经肝脏酶系作用下生成T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素、3-OH-HT-2-毒素、3-OH-T-2毒素等代谢产物，这些产物及原形物质主要由尿和粪中排出[3]，测定粪尿中T-2毒素代谢产物的量可为进一步认识T-2毒素代谢机制以及大骨节病发病机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器 岛津GC-9A SE-54宽口径毛细管柱30m×0.54mm(大连化学物理研究所)。气相色谱条件为：载气压力3.0kg/cm2，载气流速30ml/min,进样口温度260℃，柱温210～260℃，升温速率1.5℃/min,FID检测器，无分流，H2压力0.6kg/cm2，空气压力0.5kg/cm2。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素均购自Sigma公司；3-OH-HT-2、3-OH-T-2由日本学者Yoshizawa惠赠；T-2毒素购自军事医学科学院；三甲基硅基咪唑(T)、三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自Sigma公司；其余为国产分析醇。
1.3 T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素、3-OH-HT-2、3-OH-T-2标准溶液 均用丙酮配制成1mg/ml标准工作液，冰冻保存。
1.4 样品提取步骤[4] 取染毒后18h鸡粪12g放置于带盖的三角烧瓶中，倒入100ml乙腈溶液，振荡1h，过滤，滤液倒入蒸发皿中，70℃水浴，待快干时，用甲醇水(4∶1)和石油醚反复洗蒸发皿，将其倒入分液漏斗中，振荡，静止，甲醇水过净化柱(1.0g中性氧化铝，2.0g活性炭)，用25ml无水甲醇洗脱，再用9∶1甲醇水洗脱，最后用25ml去离子水洗脱，洗脱液收集于蒸发皿中，先50℃水浴，后用80℃水浴，干燥。蒸发皿用甲醇丙酮(2∶1)交替洗涤，放入衍生安瓶中，50℃ N2吹干，加入100μl T.B.T衍生剂，90℃衍生30min，加入正己烷20μl，去离子水20μl，振荡，分层取上清，50℃ N2吹干，加入正己烷定容，取1μl上机分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 T-2毒素代谢物标准品图谱(图1) T-2四醇250ng、T-2三醇550ng、T-2毒素和HT-2毒素500ng、3-OH-T-2毒素和3-OH-HT-2毒素500ng。T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素和HT-2毒素标准曲线(图2，图3，图4)，线性范围均在50～2000ng，最低检出限量50ng。鸡粪中T-2毒素代谢产物测定图谱(图5)，T-2四醇检出量甚微，说明绝大部分已经在肝脏中降解。T-2三醇明显分离出独立的峰。T-2、HT-2两个峰顶融在一起但尚清晰可见。3-OH-T-2毒素、3-OH-HT-2毒素未能分离，与标准品图谱所见一致。
图1 T-2毒素代谢物标准品图谱
, 百拇医药 图2 T-2四醇标准曲线
图3 T-2三醇标准曲线
图4 T-2、HT-2毒素标准曲线
图5 鸡粪中T-2毒素代谢产物测定图
2.2 回收率测定试验 采用加样回收法和提取回收法测定T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素和HT-2毒素回收率，200ng T-2四醇回收率为83.1%～92.8%;T-2三醇83.6%～90.6%;T-2毒素和HT-2毒素79.6%～90.6%;3-OH-T-2、3-OH-HT-2因标准品较少故未做回收率和标准曲线。
, http://www.100md.com
2.3 精密度试验 以200、500ng的T-2四醇、T-2毒素、HT-2毒素和100、500ng的T-2三醇做日内变异和日间变异(结果见表1，表2，表3)。
表1 T-2四醇日内变异与日间变异(n=5) 变异
200ng
500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
CV(%)
日间
, 百拇医药
日内
23689.8±2170.9
24408.4±1538.8
9.16
6.30
66605.9±4404.3
66898.1±2044.2
6.61
3.06
表2 T-2三醇日内变异与日间变异(n=5) 变异
100ng
, 百拇医药 500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
CV(%)
日间
日内
3903.0±349.2
3516.8±236.0
8.95
6.71
, http://www.100md.com
25353.6±1982.0
26351.0±1277.7
7.82
4.85
表3 T-2毒素HT-2毒素日内变异与日间变异(n=5) 变异
200ng
500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
, 百拇医药
CV(%)
日内
日间
5165.0±487.1
4976.25±345.1
9.43
6.94
23418.8±1930.6
22288.4±1105.6
8.24
4.96
3 讨论
, http://www.100md.com
T-2毒素代谢研究国内尚未深入开展，国外这方面工作也不多。作者的工作是初步的，为今后的研究打下了基础。代谢物研究的关键是提取，色谱分析中杂质的混杂很难剔除，许多有待改进。另一个困难是标准品的缺欠，市场上买不到，有生产制品的实验室也不多。今后应加强自己合成标准品这方面的探索，当然困难是很大的。T-2毒素代谢物研究的重要意义，有助于寻找代谢性生物标志，有助于探讨体内阻断措施，有助于研究中毒病病理机制。所以，尽管困难也必须予以突破。■
作者简介：周宏博，女，1967年生，博士
参考文献
[1] 杨建伯.大骨节病病因研究报告[J].中国地方病学杂志，1995，14(4)：201-205.
[2] 罗海波，杨景云，鲍行豪.细菌毒素(第二辑)[M].北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1993.
, 百拇医药
[3] Yoshizawa T.Sakamot T,Ayano Y,and Mirocha CJ.3'-hydroxy T-2 and 3'-hydroxy HT-2 toxins:new metabolites of T-2 toxin,a trichothecene mycotoxin,in animals[J].Agric Biol Chem,1982,45:2613-2615.
[4] Angelo V and chestor J.Identification of Various T-2 Toxin Metabolites in Chicken Excreta and Tissues[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,49(5):1246-1250.
收稿日期：1999-11-20, 百拇医药
单位：哈尔滨医科大学 大骨节病研究所，黑龙江 哈尔滨 150001
关键词：气相色谱；T-2毒素代谢物；鸡粪
中国地方病学杂志000224 摘要 目的 测定鸡粪中T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素、HT-2毒素的含量。方法 人工染毒，化学提取，TBT衍生，宽口径毛细管柱GC测定，投予剂量不同回收率略有差异。结果 该方法的回收率200ngT-2四醇83.1%～92.8%;T-2三醇 83.6%～90.6%;T-2毒素、HT-2毒素79.6%～90.6%。结论 方法的回收率高，操作简单，可供研究T-2毒素代谢机制应用。
中图分类号 TH833
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0142-03
, 百拇医药
Using the wide caliber gas-chromatography to detect the content
of T-2 toxin metabloites in chicken excreta
ZHOU Hong-bo,LI De-an,LI Qun-wei,et al
(Kaschin-Beck Disease Institute,Harbin Medical University,Harbin 150001,China)
Abstract Objective Detect the content of T-2tetraol,T-2 triol,T-2 txoin and HT-2 toxin in chicken excreta.Methods Chickens are feed with T-2 toxin by intraperitoneal injection.The metabolites are extracted by acetonitrile and derivated by TBT,then detected with the wide caliber GC.Results The average recoveries are 83.1%～92.8% for T-2 tetraol;83.6%～90.6% for T-2 triol and 79.6%～90.6% for T-2 toxin and HT-2 toxin.Conclusions The method is simple.The average recoveries are high.The method provides a good tool for detection of T-2 toxin metablolites in bio-excreta.
, 百拇医药
Key words Gas chromatography;Metabolites of T-2 toxin;Chicken excrement▲
文献报告大骨节病病因物质是T-2毒素[1]。T-2毒素属于单端孢霉烯族毒素，毒性强，自然界中广泛存在。人畜摄入污染粮食则引起急性和慢性中毒[2]。T-2毒素在人体中经肝脏酶系作用下生成T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素、3-OH-HT-2-毒素、3-OH-T-2毒素等代谢产物，这些产物及原形物质主要由尿和粪中排出[3]，测定粪尿中T-2毒素代谢产物的量可为进一步认识T-2毒素代谢机制以及大骨节病发病机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器 岛津GC-9A SE-54宽口径毛细管柱30m×0.54mm(大连化学物理研究所)。气相色谱条件为：载气压力3.0kg/cm2，载气流速30ml/min,进样口温度260℃，柱温210～260℃，升温速率1.5℃/min,FID检测器，无分流，H2压力0.6kg/cm2，空气压力0.5kg/cm2。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素均购自Sigma公司；3-OH-HT-2、3-OH-T-2由日本学者Yoshizawa惠赠；T-2毒素购自军事医学科学院；三甲基硅基咪唑(T)、三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自Sigma公司；其余为国产分析醇。
1.3 T-2四醇、T-2三醇、HT-2毒素、3-OH-HT-2、3-OH-T-2标准溶液 均用丙酮配制成1mg/ml标准工作液，冰冻保存。
1.4 样品提取步骤[4] 取染毒后18h鸡粪12g放置于带盖的三角烧瓶中，倒入100ml乙腈溶液，振荡1h，过滤，滤液倒入蒸发皿中，70℃水浴，待快干时，用甲醇水(4∶1)和石油醚反复洗蒸发皿，将其倒入分液漏斗中，振荡，静止，甲醇水过净化柱(1.0g中性氧化铝，2.0g活性炭)，用25ml无水甲醇洗脱，再用9∶1甲醇水洗脱，最后用25ml去离子水洗脱，洗脱液收集于蒸发皿中，先50℃水浴，后用80℃水浴，干燥。蒸发皿用甲醇丙酮(2∶1)交替洗涤，放入衍生安瓶中，50℃ N2吹干，加入100μl T.B.T衍生剂，90℃衍生30min，加入正己烷20μl，去离子水20μl，振荡，分层取上清，50℃ N2吹干，加入正己烷定容，取1μl上机分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 T-2毒素代谢物标准品图谱(图1) T-2四醇250ng、T-2三醇550ng、T-2毒素和HT-2毒素500ng、3-OH-T-2毒素和3-OH-HT-2毒素500ng。T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素和HT-2毒素标准曲线(图2，图3，图4)，线性范围均在50～2000ng，最低检出限量50ng。鸡粪中T-2毒素代谢产物测定图谱(图5)，T-2四醇检出量甚微，说明绝大部分已经在肝脏中降解。T-2三醇明显分离出独立的峰。T-2、HT-2两个峰顶融在一起但尚清晰可见。3-OH-T-2毒素、3-OH-HT-2毒素未能分离，与标准品图谱所见一致。
图1 T-2毒素代谢物标准品图谱
, 百拇医药 图2 T-2四醇标准曲线
图3 T-2三醇标准曲线
图4 T-2、HT-2毒素标准曲线
图5 鸡粪中T-2毒素代谢产物测定图
2.2 回收率测定试验 采用加样回收法和提取回收法测定T-2四醇、T-2三醇、T-2毒素和HT-2毒素回收率，200ng T-2四醇回收率为83.1%～92.8%;T-2三醇83.6%～90.6%;T-2毒素和HT-2毒素79.6%～90.6%;3-OH-T-2、3-OH-HT-2因标准品较少故未做回收率和标准曲线。
, http://www.100md.com
2.3 精密度试验 以200、500ng的T-2四醇、T-2毒素、HT-2毒素和100、500ng的T-2三醇做日内变异和日间变异(结果见表1，表2，表3)。
表1 T-2四醇日内变异与日间变异(n=5) 变异
200ng
500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
CV(%)
日间
, 百拇医药
日内
23689.8±2170.9
24408.4±1538.8
9.16
6.30
66605.9±4404.3
66898.1±2044.2
6.61
3.06
表2 T-2三醇日内变异与日间变异(n=5) 变异
100ng
, 百拇医药 500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
CV(%)
日间
日内
3903.0±349.2
3516.8±236.0
8.95
6.71
, http://www.100md.com
25353.6±1982.0
26351.0±1277.7
7.82
4.85
表3 T-2毒素HT-2毒素日内变异与日间变异(n=5) 变异
200ng
500ng
峰面积(μV.sec)
CV(%)
峰面积(μV.sec)
, 百拇医药
CV(%)
日内
日间
5165.0±487.1
4976.25±345.1
9.43
6.94
23418.8±1930.6
22288.4±1105.6
8.24
4.96
3 讨论
, http://www.100md.com
T-2毒素代谢研究国内尚未深入开展，国外这方面工作也不多。作者的工作是初步的，为今后的研究打下了基础。代谢物研究的关键是提取，色谱分析中杂质的混杂很难剔除，许多有待改进。另一个困难是标准品的缺欠，市场上买不到，有生产制品的实验室也不多。今后应加强自己合成标准品这方面的探索，当然困难是很大的。T-2毒素代谢物研究的重要意义，有助于寻找代谢性生物标志，有助于探讨体内阻断措施，有助于研究中毒病病理机制。所以，尽管困难也必须予以突破。■
作者简介：周宏博，女，1967年生，博士
参考文献
[1] 杨建伯.大骨节病病因研究报告[J].中国地方病学杂志，1995，14(4)：201-205.
[2] 罗海波，杨景云，鲍行豪.细菌毒素(第二辑)[M].北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1993.
, 百拇医药
[3] Yoshizawa T.Sakamot T,Ayano Y,and Mirocha CJ.3'-hydroxy T-2 and 3'-hydroxy HT-2 toxins:new metabolites of T-2 toxin,a trichothecene mycotoxin,in animals[J].Agric Biol Chem,1982,45:2613-2615.
[4] Angelo V and chestor J.Identification of Various T-2 Toxin Metabolites in Chicken Excreta and Tissues[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,49(5):1246-1250.
收稿日期：1999-11-20, 百拇医药