不同温度诱导细菌L型的实验观察
作者：邓维秀 杨靖 裴德翠
单位：邓维秀 杨靖 裴德翠(郧阳医学院微生物学教研室 十堰 442000)
关键词：L型菌；温度；葡萄球菌，金黄色；苯唑西林；羧苄西林
郧阳医学院学报/990105摘要 目的：观察不同温度诱导细菌形成L型。方法：抗生素纸片诱导。以苯唑青霉素(每片40 μg)、羧苄青霉素(每片500 μg)在37 ℃、32 ℃及28 ℃分别诱导金黄色葡萄球菌和福氏痢疾杆菌L型。结果：三种不同温度诱导细菌形成L型，其菌落特征、形态及染色性等均无差别。结论：抗生素诱导L型除37 ℃外，32 ℃和28 ℃均可形成。为探讨L型可在自然界产生和存在是否与某些传染病流行和传播有关提供依据。
中国图书资料分类法分类号 R372
Experimental Observation of L-form Bacteria
, 百拇医药
Induced by Different Temperatures
Deng Weixiu,Yang Qing,Pei Decui
(Department of Microbiology,Yunyang Medical College,Shiyan 442000)
Abstract Obiective:To observe L-form induced under different temperature.Methods:Biotic paper string method.Using oxacillin(40 μg/per pill) and carbenicillin(500 μg/per pill) under the temperature of 37 ℃,32 ℃,and 28 ℃ to induce L-form bacteria of staphylococcus aureus and Flexner's bacillus.Results:The colonial characteristics,features and staining functions of L-form bacteria induced under the three kinds of temperatures show no significant difference.Conclusion:Besides 37 ℃,other temperature such 32 ℃ and 28 ℃ can also induce l-form bacteria by using biotics.Itprovides related basis for the study of L-form bacteria existing in the nature and their existence having connection with the spread and outburst of infectious diseases.
, 百拇医药
Key words L form; temperature; staphylococcus aureus; oxacillin; carbenicillin
细菌L型是由于细菌细胞壁出现不同程度的缺陷。细菌细胞壁的缺陷可以是自发的，也可以是人工诱导的。诱导细菌变为L型的因素很多，如抗生素诱导。该诱导基于细菌对药物敏感性试验选择亚致死剂量在37 ℃下进行。有报道[1]在32 ℃时细菌对药物的敏感性比37 ℃时高2～16倍，认为32 ℃培养更能反映细菌对药物的敏感性。但该温度下抗生素诱导细菌形成L型的情况如何，尚未见报道。本文采用苯唑青霉素和羧苄青霉素纸片法诱导金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)和福氏痢疾杆菌，分别置37 ℃、32 ℃和28 ℃培养，观察L型形成情况，并进行了结果比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 菌种：金黄色葡萄球菌CowanⅠ株(简称金葡菌)由蚌埠医学院微生物学教研室提供。福氏痢疾杆菌(十堰市卫生防疫站提供)。
1.1.2 培养基：L型固体培养基按文献[2]操作。
1.1.3 抗生素纸片：用蒸馏水稀释苯唑青素(上海第二制药厂，批号880902-1)和羧苄青素(哈尔滨制药二厂，批号970064)，取直径6 mm滤纸片(新华牌，武汉产)，分别制成每片30、40和50 μg，分装小瓶，置冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 纸片法：(1)选择诱导L型剂量：金葡菌和福氏痢疾杆菌6～8 h培养物，以生理盐水稀释菌液为每ml 1000个菌，吸0.1 ml分别放入3只L型平板，L型玻棒均匀涂布(每片20、30和40)，分别帖于三只平板边缘；以同法取羧苄青霉素纸片(每片200、400和500 μg)贴于种有福氏痢疾杆菌L型平板，置37 ℃、32 ℃和28 ℃烛缸培养24 h，以抑菌圈直径最大，并在24～48 h后出现G型或L型菌落者为L型诱导剂量。(2)L型诱导：同前述方法准备平板，取苯唑青霉素每片40 μg和羧苄青霉素每片500 μg分别贴于金葡菌和福氏痢疾杆菌平板， 置37 ℃、32 ℃和28 ℃烛缸培养，每日在低倍镜下观察抑菌圈内有否G型和典型的L型菌落出现。涂片染色观察形态、染色性和缺壁情况及通过0.22 μm滤膜过滤鉴定为L型。
, 百拇医药
2 结果
2.1 选择诱导L型剂量结果
18～24 h观察37 ℃、32 ℃和28 ℃培养结果：苯唑青霉素每片40 μg 37 ℃对金葡蓖抑菌圈直径较大，24～48 h后见G型或L型菌落 。本结果与林特夫[2]报道相一致。32 ℃和28 ℃结果与37 ℃比较无差别，故选择该浓度为诱导剂量。羧苄青霉素每片500 μg对福氏痢疾杆菌抑菌圈最大，且三种不同温度的结果无区别，选择该剂量作诱导。
2.2 新青Ⅱ诱导金葡菌L型
37 ℃、32 ℃和28 ℃培养24 h均可在抑菌圈附近出现颗粒状菌落(G型)，涂片革兰氏染色见膨大圆球状、短棒状和粗丝状等明显多形性，见图1。细胞壁染色多为浓染，细胞壁不同程度缺陷。48～72 h后见L型菌落，涂片染色性和形态同前。0.22 μm滤膜过膜生长。结果三种不同温度诱导L型形成无区别。
, http://www.100md.com
2.3 羧苄青霉素诱导痢疾杆菌L型
培养24 h平板置光学显微镜下观察，抑菌圈较大，在其附近见G型菌落，涂片以圆球体、长丝体和巨形体较多见(图2)。48 h后见L型菌落，涂片结果与前述区别不大。过膜(孔径0.22 μm)生长。三种不同温度的结果基本相同。
3 讨论
有报道青霉素等β-内酰胺类抗生素具有与D-丙氨酰-D-丙氨酸相似的内酰胺环，故它可与D-丙氨酰-D-丙氨酸竞争结合转肽酶而干扰肽聚糖交联，影响整个糖肽的合成[3～5]。因此，各种细菌在体外受β-内酰胺类抗生素因素作用成为L型。通常诱导L型在最适温度37 ℃下进行。而我们经筛选诱导剂量结果，32 ℃和28 ℃诱导L型剂量与37 ℃相同，表明可直接在32 ℃和28 ℃诱导L型。本文在37 ℃、32 ℃和28 ℃以苯唑青霉素(每片40 μg)和羧苄青霉素(每片500 μg)分别诱导金葡菌和福氏痢疾杆菌L 型获成功。其结果无论在形态或染色性等方面三种不同温度均无差别，说明诱导L型除常规37 ℃外，32 ℃和28 ℃也可进行。林特夫[6]报导，曾以10株E1 Tor弧菌接种半固体培养基中，室温保菌。4月后有4株分离出L型。解桂如[7]将E1 Tor弧菌在室温保存，也多次分离出L型。这些也进一步证实了L型可在32 ℃和和28 ℃形成和存活。本文结果与之大致相符。然而，该温度诱导L型形成，为探讨L型可在自然界存在，成为某些传染病非流行期病原体保存方式，是否与该疾病的流行有关，提供了参考依据。
, 百拇医药
文献报道[1]，32 ℃时细菌对药物的敏感性比37 ℃时高2～16倍，认为更能反映细菌对药物的敏感性。本文32 ℃和28 ℃经两种抗生素分别诱导两种细菌形成L型。而且在G型和L型菌落形成时间与特征，形态改变出现时间与染色性，细胞壁缺陷程度及滤过性均无差别，从而证明该温度下诱导L型形成情况完全同37 ℃一样，无特殊变化。结果与文献报道不相致。一方面可能因菌种和抗生素不同而受温度影响不同；另一方面因诱导和药敏试验两者本身既存在对温度敏感性的差异，需进一步研究证实。
作者简介：邓维秀，女，1952年生，副教授
参考文献
1 尹晓萍，詹红英，邵启祥.不同温度下金黄色葡萄球菌对各种药物的耐药性.镇江医学院学报，1993，3(1)：12
2 林持夫，黄谷良，汤秀兰等.苯甲异恶唑青霉素诱导金黄色葡萄球菌形成L型的生态观察及培养基改良.中华微生物学和免疫学杂志，1981，1(5)：324
, 百拇医药
3 黄谷良，林特夫.医学微生物学.北京：人民出版社，1983.32～36
4 Milgrom F,Flanagan TD.Medical Microbiology.New York:Churchill Livingstone Inc,1982.54～56
5 江明性.药理学.北京：人民卫生出版社，1990.306～307
6 林特夫，黄谷良.体内、外因素与细菌L型的形成.中国微生态学杂志，1991，3(4)：89
7 解桂如.不同温度导致E1 Tor弧菌L型变异的实验观察.中国霍乱防治专辑，1986：294
(1998-06-23 收稿), 百拇医药
单位：邓维秀 杨靖 裴德翠(郧阳医学院微生物学教研室 十堰 442000)
关键词：L型菌；温度；葡萄球菌，金黄色；苯唑西林；羧苄西林
郧阳医学院学报/990105摘要 目的：观察不同温度诱导细菌形成L型。方法：抗生素纸片诱导。以苯唑青霉素(每片40 μg)、羧苄青霉素(每片500 μg)在37 ℃、32 ℃及28 ℃分别诱导金黄色葡萄球菌和福氏痢疾杆菌L型。结果：三种不同温度诱导细菌形成L型，其菌落特征、形态及染色性等均无差别。结论：抗生素诱导L型除37 ℃外，32 ℃和28 ℃均可形成。为探讨L型可在自然界产生和存在是否与某些传染病流行和传播有关提供依据。
中国图书资料分类法分类号 R372
Experimental Observation of L-form Bacteria
, 百拇医药
Induced by Different Temperatures
Deng Weixiu,Yang Qing,Pei Decui
(Department of Microbiology,Yunyang Medical College,Shiyan 442000)
Abstract Obiective:To observe L-form induced under different temperature.Methods:Biotic paper string method.Using oxacillin(40 μg/per pill) and carbenicillin(500 μg/per pill) under the temperature of 37 ℃,32 ℃,and 28 ℃ to induce L-form bacteria of staphylococcus aureus and Flexner's bacillus.Results:The colonial characteristics,features and staining functions of L-form bacteria induced under the three kinds of temperatures show no significant difference.Conclusion:Besides 37 ℃,other temperature such 32 ℃ and 28 ℃ can also induce l-form bacteria by using biotics.Itprovides related basis for the study of L-form bacteria existing in the nature and their existence having connection with the spread and outburst of infectious diseases.
, 百拇医药
Key words L form; temperature; staphylococcus aureus; oxacillin; carbenicillin
细菌L型是由于细菌细胞壁出现不同程度的缺陷。细菌细胞壁的缺陷可以是自发的，也可以是人工诱导的。诱导细菌变为L型的因素很多，如抗生素诱导。该诱导基于细菌对药物敏感性试验选择亚致死剂量在37 ℃下进行。有报道[1]在32 ℃时细菌对药物的敏感性比37 ℃时高2～16倍，认为32 ℃培养更能反映细菌对药物的敏感性。但该温度下抗生素诱导细菌形成L型的情况如何，尚未见报道。本文采用苯唑青霉素和羧苄青霉素纸片法诱导金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)和福氏痢疾杆菌，分别置37 ℃、32 ℃和28 ℃培养，观察L型形成情况，并进行了结果比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 菌种：金黄色葡萄球菌CowanⅠ株(简称金葡菌)由蚌埠医学院微生物学教研室提供。福氏痢疾杆菌(十堰市卫生防疫站提供)。
1.1.2 培养基：L型固体培养基按文献[2]操作。
1.1.3 抗生素纸片：用蒸馏水稀释苯唑青素(上海第二制药厂，批号880902-1)和羧苄青素(哈尔滨制药二厂，批号970064)，取直径6 mm滤纸片(新华牌，武汉产)，分别制成每片30、40和50 μg，分装小瓶，置冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 纸片法：(1)选择诱导L型剂量：金葡菌和福氏痢疾杆菌6～8 h培养物，以生理盐水稀释菌液为每ml 1000个菌，吸0.1 ml分别放入3只L型平板，L型玻棒均匀涂布(每片20、30和40)，分别帖于三只平板边缘；以同法取羧苄青霉素纸片(每片200、400和500 μg)贴于种有福氏痢疾杆菌L型平板，置37 ℃、32 ℃和28 ℃烛缸培养24 h，以抑菌圈直径最大，并在24～48 h后出现G型或L型菌落者为L型诱导剂量。(2)L型诱导：同前述方法准备平板，取苯唑青霉素每片40 μg和羧苄青霉素每片500 μg分别贴于金葡菌和福氏痢疾杆菌平板， 置37 ℃、32 ℃和28 ℃烛缸培养，每日在低倍镜下观察抑菌圈内有否G型和典型的L型菌落出现。涂片染色观察形态、染色性和缺壁情况及通过0.22 μm滤膜过滤鉴定为L型。
, 百拇医药
2 结果
2.1 选择诱导L型剂量结果
18～24 h观察37 ℃、32 ℃和28 ℃培养结果：苯唑青霉素每片40 μg 37 ℃对金葡蓖抑菌圈直径较大，24～48 h后见G型或L型菌落 。本结果与林特夫[2]报道相一致。32 ℃和28 ℃结果与37 ℃比较无差别，故选择该浓度为诱导剂量。羧苄青霉素每片500 μg对福氏痢疾杆菌抑菌圈最大，且三种不同温度的结果无区别，选择该剂量作诱导。
2.2 新青Ⅱ诱导金葡菌L型
37 ℃、32 ℃和28 ℃培养24 h均可在抑菌圈附近出现颗粒状菌落(G型)，涂片革兰氏染色见膨大圆球状、短棒状和粗丝状等明显多形性，见图1。细胞壁染色多为浓染，细胞壁不同程度缺陷。48～72 h后见L型菌落，涂片染色性和形态同前。0.22 μm滤膜过膜生长。结果三种不同温度诱导L型形成无区别。
, http://www.100md.com
2.3 羧苄青霉素诱导痢疾杆菌L型
培养24 h平板置光学显微镜下观察，抑菌圈较大，在其附近见G型菌落，涂片以圆球体、长丝体和巨形体较多见(图2)。48 h后见L型菌落，涂片结果与前述区别不大。过膜(孔径0.22 μm)生长。三种不同温度的结果基本相同。
3 讨论
有报道青霉素等β-内酰胺类抗生素具有与D-丙氨酰-D-丙氨酸相似的内酰胺环，故它可与D-丙氨酰-D-丙氨酸竞争结合转肽酶而干扰肽聚糖交联，影响整个糖肽的合成[3～5]。因此，各种细菌在体外受β-内酰胺类抗生素因素作用成为L型。通常诱导L型在最适温度37 ℃下进行。而我们经筛选诱导剂量结果，32 ℃和28 ℃诱导L型剂量与37 ℃相同，表明可直接在32 ℃和28 ℃诱导L型。本文在37 ℃、32 ℃和28 ℃以苯唑青霉素(每片40 μg)和羧苄青霉素(每片500 μg)分别诱导金葡菌和福氏痢疾杆菌L 型获成功。其结果无论在形态或染色性等方面三种不同温度均无差别，说明诱导L型除常规37 ℃外，32 ℃和28 ℃也可进行。林特夫[6]报导，曾以10株E1 Tor弧菌接种半固体培养基中，室温保菌。4月后有4株分离出L型。解桂如[7]将E1 Tor弧菌在室温保存，也多次分离出L型。这些也进一步证实了L型可在32 ℃和和28 ℃形成和存活。本文结果与之大致相符。然而，该温度诱导L型形成，为探讨L型可在自然界存在，成为某些传染病非流行期病原体保存方式，是否与该疾病的流行有关，提供了参考依据。
, 百拇医药
文献报道[1]，32 ℃时细菌对药物的敏感性比37 ℃时高2～16倍，认为更能反映细菌对药物的敏感性。本文32 ℃和28 ℃经两种抗生素分别诱导两种细菌形成L型。而且在G型和L型菌落形成时间与特征，形态改变出现时间与染色性，细胞壁缺陷程度及滤过性均无差别，从而证明该温度下诱导L型形成情况完全同37 ℃一样，无特殊变化。结果与文献报道不相致。一方面可能因菌种和抗生素不同而受温度影响不同；另一方面因诱导和药敏试验两者本身既存在对温度敏感性的差异，需进一步研究证实。
作者简介：邓维秀，女，1952年生，副教授
参考文献
1 尹晓萍，詹红英，邵启祥.不同温度下金黄色葡萄球菌对各种药物的耐药性.镇江医学院学报，1993，3(1)：12
2 林持夫，黄谷良，汤秀兰等.苯甲异恶唑青霉素诱导金黄色葡萄球菌形成L型的生态观察及培养基改良.中华微生物学和免疫学杂志，1981，1(5)：324
, 百拇医药
3 黄谷良，林特夫.医学微生物学.北京：人民出版社，1983.32～36
4 Milgrom F,Flanagan TD.Medical Microbiology.New York:Churchill Livingstone Inc,1982.54～56
5 江明性.药理学.北京：人民卫生出版社，1990.306～307
6 林特夫，黄谷良.体内、外因素与细菌L型的形成.中国微生态学杂志，1991，3(4)：89
7 解桂如.不同温度导致E1 Tor弧菌L型变异的实验观察.中国霍乱防治专辑，1986：294
(1998-06-23 收稿), 百拇医药