X射线全身照射对小鼠脾细胞转铁蛋白受体表达的影响
作者：罗灿 苏旭 付士波 刘建香 鞠桂芝
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：转铁蛋白受体；脾细胞；X射线；全身照射
中华放射医学与防护杂志990214 摘要 目的 转铁蛋白受体(TfR)是T淋巴细胞受抗原或丝裂原刺激后表达在细胞表面的重要受体之一，与T细胞的活化和增殖有着密切关系。目前尚未见国内外有关TfR辐射效应研究的报道。研究大剂量电离辐射后TfR表达的变化及作用，对阐明辐射抑制机体免疫功能的机制有着重要意义。方法 本文采用流式细胞术的方法观察了不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达的影响以及4 Gy X射线全身照射后不同时间TfR表达的变化。结果 0.5～6 Gy X射线全身照射后24小时，脾脏TfR阳性细胞数从1 Gy开始随照射剂量的增加而下降，且呈明显的剂量依赖性。4 Gy X射线全身照射后12～72小时，脾脏TfR阳性细胞数于照后12小时开始下降，24、48小时降至最低值(P<0.05,P<0.01)，72小时开始回升。结论 大剂量电离辐射抑制小鼠脾细胞TfR的表达，并有明显剂量依赖性；TfR表达的下降可能与辐射抑制IL-2的分泌和IL-2受体的表达有关。
, http://www.100md.com
Effects of whole body irradiation with X-rays on expression of TfR in splenocytes of mice.
LUO Can, SU Xu, FU Shibo et al.
MH Radiobiology Research Unit, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun, 130021, China
Abstract Objective Transferrin receptor(TfR) is one of important membrane receptors expressed in T cells stimulated with antigens or mitogens and is closely related with the activation and proliferation of T lymphocytes. Researches on radiation effects of TfR expression have not been reported yet. Studying the change and function of TfR expression after high dose ionizing radiation is important for clarifying the mechanism of ionizing radiation inhibiting immune function. Methods TfR expressions in lymphocytes in mouse spleens in different doses and at different time after the whole body irradiation (WBI) with X-rays were examined using flow cytometry. Results At 24 hours after the WBI with 0.5-6 Gy X-rays, TfR positive splenocytes decreased with the increasing irradiation dose beginning at 1Gy and showed dose-dependent reduction. From 12 to 72 hours after WBI with 4 Gy X-rays TfR positive splenocytes started reducing at 12 hours after WBI and reached the nadir values at 24 hours and 48 hours (P<0.05,P<0.01), and began to recover from 72 hours after WBI. Conclusion High dose ionizing radiation inhibits the TfR expression in splenocytes of mice and there is an obvious dose-dependency. The decrease of TfR expression may be related to the inhibition of IL-2 production and IL-2 receptor expression in cells by radiation.
, 百拇医药
Key words Transferrin receptor Splenocytes X-rays Whole body irradiation
大剂量电离辐射抑制机体的免疫功能早已被研究所证实[1，2]，但其发生的机制尚未完全阐明。转铁蛋白受体(TfR)是T淋巴细胞受抗原或丝裂原刺激后，在细胞活化和增殖过程中表达在细胞表面的重要受体之一，与T细胞的活化和增殖有着密切关系。目前尚未见国内外有关TfR辐射效应研究的报道。研究辐射后TfR表达的变化及作用，对阐明辐射抑制机体免疫功能的机制有着重要意义。本文采用流式细胞术的方法观察了不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达的影响以及4 Gy X射线全身照射后不同时间TfR表达的变化，同时还检测了不同剂量X射线照射后小鼠脾细胞IL-2活性的变化，以探讨不同剂量X射线全身照后，TfR表达的变化及其在辐射免疫抑制效应中的作用。
材料和方法
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1.实验动物：健康雄性昆明小鼠，体重(20±2)g，购自白求恩医科大学实验动物部。动物随机分为对照组和不同剂量照射组或4 Gy照射后不同时间组，每组5只动物。
2.照射条件：Philips深部X射线治疗机，电压200 kV，电流10 mA，滤板0.5 mmCu和1.0 mmAl，照射组给予0.5～6 Gy全身照射，剂量率0.287 Gy/min，靶皮距50 cm；对照组给予假照射。
3.TfR表达的诱导：不同剂量照射动物，于照后24小时断头处死；不同时间组动物，于4 Gy照射后相应时间断头处死。在无菌条件下取出脾脏，放入盛有RPMI-1640培养液的平皿中，用毛玻片研磨制成单细胞悬液，离心1 000 r/min，4℃，5分钟，弃上清，Hanks液洗细胞两次。加5 ml Tris-NH4Cl，作用5分钟，裂解红细胞。Hanks 液洗细胞两次，将细胞重悬于含10%NBS的RPMI-1640培养液中，调细胞浓度为1×107个/ml。无菌24孔培养板，每孔加细胞100 μl，加850 μl含10%NBS的RPMI-1640培养液，加50 μl浓度为100 μg/ml的ConA(Sigma，美国)，37℃，5%CO2孵箱中培养48小时。
, 百拇医药
4.TfR表达的检测：采用直接免疫荧光流式细胞术，美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪进行检测。上述培养48小时的细胞，用0.01 mol/L PBS洗涤两次，离心1 500 r/min，4℃，5分钟，细胞重悬于150 μl 0.01 mol/L PBS中，加FITC-抗小鼠TfR单克隆抗体4 μl(Sigma,美国)，4℃，反应45分钟，0.01 mol/L PBS洗涤两次。用FACS软件收集细胞，Lysys软件分析处理数据，每个样品收集10 000个细胞，记录阳性细胞百分率。
5.IL-2样品的收集：用无菌青霉素小瓶，将在3.项中培养48小时的脾细胞培养上清收集起来作为检测IL-2的样品。
6.成淋巴细胞的诱生及IL-2活性测定：参见文献[3]。
7.统计学处理：采用Student's t检验
结果
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1.大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞TfR表达的变化：小鼠经0、0.5、1、2、4及6 Gy X射线全身照射后24小时，检测TfR表达变化的结果显示，大剂量照射从1 Gy开始，随照射剂量的增加脾脏细胞数及TfR阳性表达细胞数均显著减少，呈明显的剂量依赖性下降。6 Gy组TfR阳性细胞数仅为对照组的3.5%，见表1。
表1 大剂量X射线全身照射后24小时
小鼠脾细胞TfR表达的变化 剂量
(Gy)
脾细胞数
(×107细胞)
TfR+细胞数/脾
(×107细胞)
, 百拇医药
0
7.08±1.67
1.72±0.57
0.5
5.83±1.42
1.45±0.41
1.0
2.77±0.67**
0.53±0.14**
2.0
1.97±0.44**
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0.34±0.11**
4.0
1.01±0.26**
0.18±0.05**
6.0
0.46±0.04**
0.06±0.01**
注：n=5,与对照组比较， *P<0.05,**P<0.01(下同) 2.大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞IL-2活性的变化：检测不同大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞TfR表达变化的同时，脾脏T淋巴细胞产生的IL-2的活性变化见表2。从表中可以看到，随着照射剂量的增加脾淋巴细胞IL-2活性显著下降。4 Gy以上剂量的照射，脾细胞IL-2活性明显受抑，与对照组比差异具有显著性(P<0.05)。
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表2 不同剂量X射线全身照射后24小时
小鼠脾细胞IL-2活性变化 剂量(Gy)
脾细胞IL-2活性(*min-1)
0
23297±2172
0.5
25714±2335
1.0
24479±1978
2.0
24110±3573
, 百拇医药
4.0
18676±2290*
6.0
17757±3089*
注：n=5,与对照组比较， *P<0.05(下同)
3. 4 Gy照射后TfR表达的时程变化：4 Gy X射线全身照射后12、24、48、72小时，检测TfR表达的时程变化，结果见表3。脾脏TfR阳性细胞数于照后12小时开始下降，24、48小时降至最低值(P<0.05～P<0.01)，72小时开始回升。
表3 4 Gy X射线全射照射后小鼠
脾细胞TfR表达的时程变化 照射后时间
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(小时)
脾细胞数
(×107细胞)
TfR+细胞数/脾
(×107细胞)
0
7.65±0.72
1.62±0.41
12
3.19±0.92**
0.73±0.48*
, 百拇医药
24
1.09±0.28**
0.17±0.04**
48
0.67±0.15**
0.14±0.04**
72
3.55±0.82**
1.11±0.37
讨论 转铁蛋白受体(TfR)是细胞膜表面受体。静止的T淋巴细胞不表达TfR，当受到丝裂原刺激后，才表达TfR，TfR的表达与T细胞的活化和增殖有着密切关系。Neckers等[4]的研究表明，在丝裂原诱导的T细胞增殖过程中，IL-2受体表达后，TfR在IL-2的诱导下表达，细胞进入S期，启动DNA合成。抗TfR抗体可以抑制DNA的合成，消除IL-2的促分裂能力；IL-2刺激淋巴细胞增殖是通过诱导细胞表达TfR实现的。Pelosi等[5]的研究也证实主要是IL-2增加了TfR的表达。TfR的辐射效应研究目前尚未见有报道。从我们的研究结果看，大剂量X射线照射后，受ConA刺激的脾细胞TfR的表达明显下降，照射剂量与脾脏TfR阳性细胞数之间的相关系数为-0.82(P<0.05)，说明在大剂量(0.5～6 Gy)范围内，随着照射剂量的升高脾脏TfR阳性细胞数呈剂量依赖性下降。从前述IL-2及IL-2受体在TfR表达过程中的作用来看，大剂量电离辐射所致TfR表达下降应与辐射抑制IL-2的产生及IL-2受体表达有关。我们同时检测的脾细胞培养上清中IL-2的活性变化趋势与TfR表达的变化一致。已有研究显示，大剂量电离辐射可使淋巴细胞IL-2的产生和IL-2受体的表达下降[6]。大剂量电离辐射所致TfR表达下降的原因可能主要是电离辐射破坏了IL-2与IL-2受体相互作用诱导TfR表达的机制。近年有研究报道，TfR与TCRζ链以及ζ链结合的ZAP70酪氨酸激酶功能上有关[7]；亦有研究显示，大剂量电离辐射使TCR/CD3和CD2介导的T细胞激活增殖下降了45%[8]。因此，辐射损伤T细胞表面与T细胞激活有关的其他分子(TCR/CD3，CD2等)并破坏它们之间的协同效应，与TfR表达下降也可能有关。
, 百拇医药
4 Gy X射线照射后TfR表达的时间效应表明，照后12小时，脾细胞TfR的表达已明显下降，小鼠免疫功能已受到抑制；照后24小时这种抑制达到最大并持续到48小时，72小时后受到辐射损伤的脾细胞其功能开始恢复。
参考文献
1 刘树铮.辐射免疫学.北京：人民卫生出版社.1985.59.
2 耿勇志.电离辐射对淋巴细胞的效应.国外医学放射医学核医学分册，1990，14：108-110.
3 杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术.长春：吉林省科技出版社.1991.41.
4 Neckers LM,Cossman J.Transferrin receptor induction in mitogen-stimulated human T lymphocytes is required for DNA synthesis and cell division and is regulated by interleukin 2. Pro Natl Acad Sci USA, 1983, 80:3494-3496.
, 百拇医药
5 Pelosi E, Testa U,Louache F, et al. Expression of transferrin receptor in phytohemagglutinin-stimulated human T lymphocytes. J Biol Chem, 1986, 261:3036-3040.
6 闵锐，程天民，罗成基，等.电离辐射对T淋巴细胞IL-2分泌和细胞毒活性的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，14：314-317.
7 Salmeron A,Borroto A,Fresno M. et al. Transferrin receptor induces tyrosine phosphorylation in T cell and is physically associated with the TCRζ-chain. J Immunol, 1995,154:1675-1677.
8 闵锐，程天民，罗成基，等.电离辐射对T淋巴细胞激活增殖能力的影响。中华放射医学与防护杂志，1994，14：229-232.
(收稿：1998-05-06 修回:1998-09-01), 百拇医药
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：转铁蛋白受体；脾细胞；X射线；全身照射
中华放射医学与防护杂志990214 摘要 目的 转铁蛋白受体(TfR)是T淋巴细胞受抗原或丝裂原刺激后表达在细胞表面的重要受体之一，与T细胞的活化和增殖有着密切关系。目前尚未见国内外有关TfR辐射效应研究的报道。研究大剂量电离辐射后TfR表达的变化及作用，对阐明辐射抑制机体免疫功能的机制有着重要意义。方法 本文采用流式细胞术的方法观察了不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达的影响以及4 Gy X射线全身照射后不同时间TfR表达的变化。结果 0.5～6 Gy X射线全身照射后24小时，脾脏TfR阳性细胞数从1 Gy开始随照射剂量的增加而下降，且呈明显的剂量依赖性。4 Gy X射线全身照射后12～72小时，脾脏TfR阳性细胞数于照后12小时开始下降，24、48小时降至最低值(P<0.05,P<0.01)，72小时开始回升。结论 大剂量电离辐射抑制小鼠脾细胞TfR的表达，并有明显剂量依赖性；TfR表达的下降可能与辐射抑制IL-2的分泌和IL-2受体的表达有关。
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Effects of whole body irradiation with X-rays on expression of TfR in splenocytes of mice.
LUO Can, SU Xu, FU Shibo et al.
MH Radiobiology Research Unit, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun, 130021, China
Abstract Objective Transferrin receptor(TfR) is one of important membrane receptors expressed in T cells stimulated with antigens or mitogens and is closely related with the activation and proliferation of T lymphocytes. Researches on radiation effects of TfR expression have not been reported yet. Studying the change and function of TfR expression after high dose ionizing radiation is important for clarifying the mechanism of ionizing radiation inhibiting immune function. Methods TfR expressions in lymphocytes in mouse spleens in different doses and at different time after the whole body irradiation (WBI) with X-rays were examined using flow cytometry. Results At 24 hours after the WBI with 0.5-6 Gy X-rays, TfR positive splenocytes decreased with the increasing irradiation dose beginning at 1Gy and showed dose-dependent reduction. From 12 to 72 hours after WBI with 4 Gy X-rays TfR positive splenocytes started reducing at 12 hours after WBI and reached the nadir values at 24 hours and 48 hours (P<0.05,P<0.01), and began to recover from 72 hours after WBI. Conclusion High dose ionizing radiation inhibits the TfR expression in splenocytes of mice and there is an obvious dose-dependency. The decrease of TfR expression may be related to the inhibition of IL-2 production and IL-2 receptor expression in cells by radiation.
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Key words Transferrin receptor Splenocytes X-rays Whole body irradiation
大剂量电离辐射抑制机体的免疫功能早已被研究所证实[1，2]，但其发生的机制尚未完全阐明。转铁蛋白受体(TfR)是T淋巴细胞受抗原或丝裂原刺激后，在细胞活化和增殖过程中表达在细胞表面的重要受体之一，与T细胞的活化和增殖有着密切关系。目前尚未见国内外有关TfR辐射效应研究的报道。研究辐射后TfR表达的变化及作用，对阐明辐射抑制机体免疫功能的机制有着重要意义。本文采用流式细胞术的方法观察了不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达的影响以及4 Gy X射线全身照射后不同时间TfR表达的变化，同时还检测了不同剂量X射线照射后小鼠脾细胞IL-2活性的变化，以探讨不同剂量X射线全身照后，TfR表达的变化及其在辐射免疫抑制效应中的作用。
材料和方法
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1.实验动物：健康雄性昆明小鼠，体重(20±2)g，购自白求恩医科大学实验动物部。动物随机分为对照组和不同剂量照射组或4 Gy照射后不同时间组，每组5只动物。
2.照射条件：Philips深部X射线治疗机，电压200 kV，电流10 mA，滤板0.5 mmCu和1.0 mmAl，照射组给予0.5～6 Gy全身照射，剂量率0.287 Gy/min，靶皮距50 cm；对照组给予假照射。
3.TfR表达的诱导：不同剂量照射动物，于照后24小时断头处死；不同时间组动物，于4 Gy照射后相应时间断头处死。在无菌条件下取出脾脏，放入盛有RPMI-1640培养液的平皿中，用毛玻片研磨制成单细胞悬液，离心1 000 r/min，4℃，5分钟，弃上清，Hanks液洗细胞两次。加5 ml Tris-NH4Cl，作用5分钟，裂解红细胞。Hanks 液洗细胞两次，将细胞重悬于含10%NBS的RPMI-1640培养液中，调细胞浓度为1×107个/ml。无菌24孔培养板，每孔加细胞100 μl，加850 μl含10%NBS的RPMI-1640培养液，加50 μl浓度为100 μg/ml的ConA(Sigma，美国)，37℃，5%CO2孵箱中培养48小时。
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4.TfR表达的检测：采用直接免疫荧光流式细胞术，美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪进行检测。上述培养48小时的细胞，用0.01 mol/L PBS洗涤两次，离心1 500 r/min，4℃，5分钟，细胞重悬于150 μl 0.01 mol/L PBS中，加FITC-抗小鼠TfR单克隆抗体4 μl(Sigma,美国)，4℃，反应45分钟，0.01 mol/L PBS洗涤两次。用FACS软件收集细胞，Lysys软件分析处理数据，每个样品收集10 000个细胞，记录阳性细胞百分率。
5.IL-2样品的收集：用无菌青霉素小瓶，将在3.项中培养48小时的脾细胞培养上清收集起来作为检测IL-2的样品。
6.成淋巴细胞的诱生及IL-2活性测定：参见文献[3]。
7.统计学处理：采用Student's t检验
结果
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1.大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞TfR表达的变化：小鼠经0、0.5、1、2、4及6 Gy X射线全身照射后24小时，检测TfR表达变化的结果显示，大剂量照射从1 Gy开始，随照射剂量的增加脾脏细胞数及TfR阳性表达细胞数均显著减少，呈明显的剂量依赖性下降。6 Gy组TfR阳性细胞数仅为对照组的3.5%，见表1。
表1 大剂量X射线全身照射后24小时
小鼠脾细胞TfR表达的变化 剂量
(Gy)
脾细胞数
(×107细胞)
TfR+细胞数/脾
(×107细胞)
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0
7.08±1.67
1.72±0.57
0.5
5.83±1.42
1.45±0.41
1.0
2.77±0.67**
0.53±0.14**
2.0
1.97±0.44**
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0.34±0.11**
4.0
1.01±0.26**
0.18±0.05**
6.0
0.46±0.04**
0.06±0.01**
注：n=5,与对照组比较， *P<0.05,**P<0.01(下同) 2.大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞IL-2活性的变化：检测不同大剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞TfR表达变化的同时，脾脏T淋巴细胞产生的IL-2的活性变化见表2。从表中可以看到，随着照射剂量的增加脾淋巴细胞IL-2活性显著下降。4 Gy以上剂量的照射，脾细胞IL-2活性明显受抑，与对照组比差异具有显著性(P<0.05)。
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表2 不同剂量X射线全身照射后24小时
小鼠脾细胞IL-2活性变化 剂量(Gy)
脾细胞IL-2活性(*min-1)
0
23297±2172
0.5
25714±2335
1.0
24479±1978
2.0
24110±3573
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4.0
18676±2290*
6.0
17757±3089*
注：n=5,与对照组比较， *P<0.05(下同)
3. 4 Gy照射后TfR表达的时程变化：4 Gy X射线全身照射后12、24、48、72小时，检测TfR表达的时程变化，结果见表3。脾脏TfR阳性细胞数于照后12小时开始下降，24、48小时降至最低值(P<0.05～P<0.01)，72小时开始回升。
表3 4 Gy X射线全射照射后小鼠
脾细胞TfR表达的时程变化 照射后时间
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(小时)
脾细胞数
(×107细胞)
TfR+细胞数/脾
(×107细胞)
0
7.65±0.72
1.62±0.41
12
3.19±0.92**
0.73±0.48*
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24
1.09±0.28**
0.17±0.04**
48
0.67±0.15**
0.14±0.04**
72
3.55±0.82**
1.11±0.37
讨论 转铁蛋白受体(TfR)是细胞膜表面受体。静止的T淋巴细胞不表达TfR，当受到丝裂原刺激后，才表达TfR，TfR的表达与T细胞的活化和增殖有着密切关系。Neckers等[4]的研究表明，在丝裂原诱导的T细胞增殖过程中，IL-2受体表达后，TfR在IL-2的诱导下表达，细胞进入S期，启动DNA合成。抗TfR抗体可以抑制DNA的合成，消除IL-2的促分裂能力；IL-2刺激淋巴细胞增殖是通过诱导细胞表达TfR实现的。Pelosi等[5]的研究也证实主要是IL-2增加了TfR的表达。TfR的辐射效应研究目前尚未见有报道。从我们的研究结果看，大剂量X射线照射后，受ConA刺激的脾细胞TfR的表达明显下降，照射剂量与脾脏TfR阳性细胞数之间的相关系数为-0.82(P<0.05)，说明在大剂量(0.5～6 Gy)范围内，随着照射剂量的升高脾脏TfR阳性细胞数呈剂量依赖性下降。从前述IL-2及IL-2受体在TfR表达过程中的作用来看，大剂量电离辐射所致TfR表达下降应与辐射抑制IL-2的产生及IL-2受体表达有关。我们同时检测的脾细胞培养上清中IL-2的活性变化趋势与TfR表达的变化一致。已有研究显示，大剂量电离辐射可使淋巴细胞IL-2的产生和IL-2受体的表达下降[6]。大剂量电离辐射所致TfR表达下降的原因可能主要是电离辐射破坏了IL-2与IL-2受体相互作用诱导TfR表达的机制。近年有研究报道，TfR与TCRζ链以及ζ链结合的ZAP70酪氨酸激酶功能上有关[7]；亦有研究显示，大剂量电离辐射使TCR/CD3和CD2介导的T细胞激活增殖下降了45%[8]。因此，辐射损伤T细胞表面与T细胞激活有关的其他分子(TCR/CD3，CD2等)并破坏它们之间的协同效应，与TfR表达下降也可能有关。
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4 Gy X射线照射后TfR表达的时间效应表明，照后12小时，脾细胞TfR的表达已明显下降，小鼠免疫功能已受到抑制；照后24小时这种抑制达到最大并持续到48小时，72小时后受到辐射损伤的脾细胞其功能开始恢复。
参考文献
1 刘树铮.辐射免疫学.北京：人民卫生出版社.1985.59.
2 耿勇志.电离辐射对淋巴细胞的效应.国外医学放射医学核医学分册，1990，14：108-110.
3 杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术.长春：吉林省科技出版社.1991.41.
4 Neckers LM,Cossman J.Transferrin receptor induction in mitogen-stimulated human T lymphocytes is required for DNA synthesis and cell division and is regulated by interleukin 2. Pro Natl Acad Sci USA, 1983, 80:3494-3496.
, 百拇医药
5 Pelosi E, Testa U,Louache F, et al. Expression of transferrin receptor in phytohemagglutinin-stimulated human T lymphocytes. J Biol Chem, 1986, 261:3036-3040.
6 闵锐，程天民，罗成基，等.电离辐射对T淋巴细胞IL-2分泌和细胞毒活性的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，14：314-317.
7 Salmeron A,Borroto A,Fresno M. et al. Transferrin receptor induces tyrosine phosphorylation in T cell and is physically associated with the TCRζ-chain. J Immunol, 1995,154:1675-1677.
8 闵锐，程天民，罗成基，等.电离辐射对T淋巴细胞激活增殖能力的影响。中华放射医学与防护杂志，1994，14：229-232.
(收稿：1998-05-06 修回:1998-09-01), 百拇医药