聚合酶链反应快速检测加德纳菌的方法和应用
作者：于文彬 苏明权 杨秀芝 马越云 王德堂 张建芳 陈必良 丁振若
单位：杨秀芝 王德堂 陈必良(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安，710033)；于文彬 苏明权 马越云 张建芳 丁振若(第四军医大学西京医院检验科)
关键词：加德纳；聚合酶链反应；细菌性阴道病
第四军医大学学报001023 摘 要： 目的 建立聚合酶链反应快速检测加德纳菌方法，用于细菌性阴道病的诊断和治疗. 方法 根据加德纳菌基因序列中IIS-23srRNA基因区设计并合成特异性引物,应用聚合酶链反应扩增阴道或宫颈分泌物中的加德纳菌，并与革兰染色和分离培养进行对照检测. 结果 经对阴道加德纳菌和5种常见的阴道感染病原体检测，证实所用引物具有较高的特异性；敏感性实验结果102可扩增出明显的区带；在50例宫颈分泌物标本中，革兰染色阳性检出率为18%(9/50)、分离培养阳性检出率为16%(8/50)，聚合酶链反应阳性率为28%(14/50). 结论 采用聚合酶链反应检测阴道分泌物中的加德纳菌，用于细菌性阴道病的快速诊断，有可能成为细菌性阴道病实验室诊断的主要检测方法.
, http://www.100md.com
中图号：R378.49 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1244-03
Rapid detection of Gv by polymerase chain reaction
YU Wen-Bin, SU Ming-Quan,MA Yue-Yun,ZHANG Jian-Fang,DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
YANG Xiu-Zhi,WANG De-Tang, CHEN Bi-Liang
, 百拇医药
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To establish PCR method to rapidly detect Gv and to apply it to diagnose and to treat bacterial vaginosis. METHODS A pair of specific primers were designed according to the IIS-23s rRNA gene of Gv and used PCR method to detect its specific gene fragment. Grams staining and bacterial culture were also used to detect its cells. RESULTS The primer was proved to be of hign specificity through detection of Gv and five other pathogens of viginosis; it can detect 100 cells sensitively. In 50 cervical secretion samples, positive detective rate of grams staining and PCR were 18%(9/50).16%(8/50) and 28% (14/50)respectively. CONCLUSION The PCR method can be used as a major laboratory method for Gv detection.
, 百拇医药
Keyword:Gardnerella Vaginalis(Gv);polymerase chain reaction(PCR);bacterial vaginosis
0 引言
细菌性阴道病是近年来被确定的与性传播有关的疾病，其病原体为阴道加德纳菌，随着性病原体感染谱的变化，发病率有逐年增高的趋势. 目前对加德纳菌的实验室诊断,主要以直接涂片找线索细胞、分离培养法及免疫荧光法等，直接涂片找线索细胞虽方法简单易行，但特异性不够理想；分离培养法是一种公认的金指标，但受诸多因素影响，需要特殊的营养才能生长，免疫荧光法非特异检出较高，达不到快速诊断的目的. 为此，我们根据加德纳菌基因序列中，位于IIS-23srRNA基因区，设计特异性引物，建立聚合酶链反应检测加德纳菌实验诊断方法，用于细菌性阴道病的实验快速诊断.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 阴道加德纳菌为本室经分离培养、生化鉴定而证实的临床分离株；淋病奈瑟球菌(29106)购自卫生部菌种保藏中心；沙眼衣原体感染的细胞株为本室分离；解脲支原体、白色念珠菌、大肠杆菌为本室保存菌株. 宫颈分泌物50例，取自西京医院妇产科门诊就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中. 引物的设计与合成根据Belkum等[1]报道，加德纳菌基因序列中的IIS-23srRNA区，设计特异性引物，经计算机模拟杂交符合实验要求，扩增片段：为433 bp. 引物1 ：5′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′；引物 2： 5′-TACAAGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成. Taq DNA聚合酶、4×dNTP、吐温-20,Triton X100,NP-40购自华美生物工程公司；PE480型PCR扩增仪为美国PE公司.
1.2 方法 取在加德纳菌分离培养基[2]上生长的的菌落，置于TNE缓冲液中，以2000 r*min-1离心10 min. 弃上清，加100 μL蛋白酶K裂解液55℃ 60 min，再98℃ 10 min灭活蛋白酶K. 经酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提2次提取加德纳菌DNA，冷乙醇沉淀、TE溶解备用. 将宫颈分泌物加于500 μL生理盐水中，1000 g离心10 min. 弃上清，加碱性裂解液(2 mmol*L-1 NaOH,1 g*L-1吐温-20，1 g*L-1 Triton X-100及1 g*L-1 NP-40) 98℃ 10 min,1000 g离心5 min，取上清作为DNA模板. PCR扩增反应总体积为25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物1.2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板10 μL,Taq DNA聚合酶1 U*μL-1,以无菌石蜡油30 μL覆盖,进行PCR循环,参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃延伸5 min. 取扩增产物15 μL,做20 g*L-1琼脂糖(含EB液)凝胶电泳(100 V，30 min),于紫外光下观察结果,出现433 bp扩增带者为阳性.
, 百拇医药
2 结果
2.1 特异性敏感性试验 分别提取阴道加德纳菌、淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体感染细胞株、解脲支原体、白色念珠菌和大肠杆菌的DNA作为PCR模板进行扩增. 结果只有加德纳菌出现433 bp的特异性扩增区带，证实所用引物具有较高的特异性(Fig 1).
图 1 PCR检测的特异性
Fig 1 Spesificity of detection by PCR with Gv as template DNA
1:PCR marker; 2:Gv; 3:N.Gonorrhoeae;4:Chlamydia;5:U.Urealyticum;6:C.albicans;7:E.coli.
将加德纳菌分别制备成：10-9,10-8,10-7,10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2,10-1菌细胞液提取DNA，进行PCR扩增，结果102可扩增出明显的区带(Fig 2).
, 百拇医药
2.2 临床标本的检测 将50例宫颈分泌物标本及加德纳菌培养物用革兰染色、分离培养、PCR 3种方法进行检测，其中，革兰染色阳性9例，(检出率18%)；分离培养阳性8例(检出率16%)；PCR阳性14例(阳性率28%). 14例PCR检测阳性的标本中，有9例被革兰染色，8例被分离培养所证实. 6例PCR检测阳性而分离培养呈阴性的患者，经临床调查患者在取标本前曾用过抗生素治疗.
图 2 PCR法检测加德纳菌的敏感性
Fig 2 Senstivity of detection G.Vaginalis different specimens by PCR
1:PCR Markers; 2:10-9;3:10-8;4:10-7;5:10-6; 6:10-5; 7:10-4; 8:10-3;9:10-2;20:10-1.
, 百拇医药
3 讨论
细菌性阴道病的主要病原体为阴道加德纳菌(Gv)，以往称此病为非特异性阴道炎. 1984年在斯德哥尔摩关于非特异性阴道炎的国际会议上正式定名为细菌性阴道病. 由于阴道加德纳菌的感染与传播和性活动有关，故此将细菌性阴道病列入第三代性传播疾病. 在健康妇女中，阴道由于组织解剖和生物化学以及生理方面的特点，对于外界病原体的侵入有着相当强的防御能力. 使病原体难以侵犯阴道，保持阴道的正常结构和生理功能. 如果阴道的自然防御屏障作用破坏，导致病原体在阴道中生长繁殖，引起阴道炎症. 目前，已确认的阴道炎特异性病原体有：白色念珠菌、阴道滴虫、淋病双球菌. 此外，病原引起的阴道炎称为非特异性阴道炎(NSV)，在性传播疾病中，发现高达20%的女性患者有NSV. 研究结果表明[3]，NSV是Gv和一些厌氧菌共存相互作用的结果. Gv可通过性交传染，患病妇女的性伙伴约有90%尿道可检出Gv，因此尿道培养的阳性率高达80%. 在患病妇女中，重复感染率高. 近年来，细菌性阴道病的发病率呈增高趋势，由于临床症状不明显，得不到及时诊断和治疗. 阐明Gv的生物学性状和基因序列并建立基因诊断方法，对于NSV的诊断及治疗，防止性病的传播，保护妇女的健康，具有十分重大的意义.
, 百拇医药
在细菌性阴道感染者中，尤其是非淋菌性的病原体感染，有部分女性患者感染后得不到及时治疗，或经过不正规的治疗后，转为慢性感染或带菌者，当机体受外来及生理因素影响时，病原体可再次复活而侵袭传播，使病情总是反复发作不能痊愈，此时病原体又不易查出，给患者带来极大的苦恼. 阴道加德纳菌做为一种条件致病菌，在临床上，由于大量抗生素的应用使加德纳菌的感染率在不断的增高，再与性传播有关，正逐步引起临床的高度重视. 近来研究证实[4，5]，加德纳菌的致病性与生物分型有关，IIS区基因的多态性是导致加德纳菌发生不同生物型的原因之一. 我们根据加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区序列作为特异性引物，建立快速的基因扩增方法，证明该引物序列具有较强的特异性和较高的敏感性；可用于对阴道炎宫颈分泌物中加德纳菌的快速检测. 检测结果表明，在50例宫颈分泌物标本，用革兰染色、分离培养，聚合酶链反应同时对加德纳菌进行检测，革兰染色阳性检出率为18%；分离培养阳性检出率为16%；PCR法的阳性率为28%. 在14例PCR检测阳性的标本中，其中有8例被革兰染色和分离培养所证实，对6例PCR检测阳性而分离培养阴性的患者，经临床调查为取标本前曾用抗生素治疗，可能是分离培养结果阴性的原因. PCR法检测的是病原体的遗传物质DNA，不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义. 由于聚合酶链反应技术方法本身所具有的高特异性和敏感性，采用聚合酶链反应检测阴道分泌物中的加德纳菌，用于细菌性阴道病的快速诊断，有可能成为今后细菌性阴道病实验室诊断的主要快速检测方法之一.
, http://www.100md.com
作者简介：于文彬(1944-),男(汉族)，山东省潍坊市人. 1969年上海医科大学医学系毕业，检验科主任、教授，硕士研究生导师，陕西省检验学会副主任委员，发表论文30篇. Tel.(029)3375572
参考文献:
[1] Belkum AV, Koeken A, Vandmme P et al. Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for gardnerella vaginalis[J]. Mol Cell Probes, 1995;9:167-169.
[2] 谭巨莲, 吴宝印, 李仕英 et al. 阴道加德纳尔菌的分离鉴定[J].中华医学检验杂志，1991；14(2):107-108.
[3] 丁振若,于文彬. 现代性病实验诊断学[M]. 西安：世界图书出版公司，1999：4.
, http://www.100md.com
[4] Pedraza Aviles AG, Inzunza Montiel AE, Ortiz Zaragoza MC et al. Gardnerella vaginalis biotypes; modification of a proposed system[J]. Rev Latinoam Microbiol, 1995;37:19-21.
[5] Ingianni A, Petruzzelli S, Morandotti G et al. Genotypic differentiation of gardnerella vaginalis amplified ribosomal DNA restriction analysis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,1997;18:61-63.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药
单位：杨秀芝 王德堂 陈必良(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安，710033)；于文彬 苏明权 马越云 张建芳 丁振若(第四军医大学西京医院检验科)
关键词：加德纳；聚合酶链反应；细菌性阴道病
第四军医大学学报001023 摘 要： 目的 建立聚合酶链反应快速检测加德纳菌方法，用于细菌性阴道病的诊断和治疗. 方法 根据加德纳菌基因序列中IIS-23srRNA基因区设计并合成特异性引物,应用聚合酶链反应扩增阴道或宫颈分泌物中的加德纳菌，并与革兰染色和分离培养进行对照检测. 结果 经对阴道加德纳菌和5种常见的阴道感染病原体检测，证实所用引物具有较高的特异性；敏感性实验结果102可扩增出明显的区带；在50例宫颈分泌物标本中，革兰染色阳性检出率为18%(9/50)、分离培养阳性检出率为16%(8/50)，聚合酶链反应阳性率为28%(14/50). 结论 采用聚合酶链反应检测阴道分泌物中的加德纳菌，用于细菌性阴道病的快速诊断，有可能成为细菌性阴道病实验室诊断的主要检测方法.
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中图号：R378.49 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1244-03
Rapid detection of Gv by polymerase chain reaction
YU Wen-Bin, SU Ming-Quan,MA Yue-Yun,ZHANG Jian-Fang,DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
YANG Xiu-Zhi,WANG De-Tang, CHEN Bi-Liang
, 百拇医药
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To establish PCR method to rapidly detect Gv and to apply it to diagnose and to treat bacterial vaginosis. METHODS A pair of specific primers were designed according to the IIS-23s rRNA gene of Gv and used PCR method to detect its specific gene fragment. Grams staining and bacterial culture were also used to detect its cells. RESULTS The primer was proved to be of hign specificity through detection of Gv and five other pathogens of viginosis; it can detect 100 cells sensitively. In 50 cervical secretion samples, positive detective rate of grams staining and PCR were 18%(9/50).16%(8/50) and 28% (14/50)respectively. CONCLUSION The PCR method can be used as a major laboratory method for Gv detection.
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Keyword:Gardnerella Vaginalis(Gv);polymerase chain reaction(PCR);bacterial vaginosis
0 引言
细菌性阴道病是近年来被确定的与性传播有关的疾病，其病原体为阴道加德纳菌，随着性病原体感染谱的变化，发病率有逐年增高的趋势. 目前对加德纳菌的实验室诊断,主要以直接涂片找线索细胞、分离培养法及免疫荧光法等，直接涂片找线索细胞虽方法简单易行，但特异性不够理想；分离培养法是一种公认的金指标，但受诸多因素影响，需要特殊的营养才能生长，免疫荧光法非特异检出较高，达不到快速诊断的目的. 为此，我们根据加德纳菌基因序列中，位于IIS-23srRNA基因区，设计特异性引物，建立聚合酶链反应检测加德纳菌实验诊断方法，用于细菌性阴道病的实验快速诊断.
1 材料和方法
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1.1 材料 阴道加德纳菌为本室经分离培养、生化鉴定而证实的临床分离株；淋病奈瑟球菌(29106)购自卫生部菌种保藏中心；沙眼衣原体感染的细胞株为本室分离；解脲支原体、白色念珠菌、大肠杆菌为本室保存菌株. 宫颈分泌物50例，取自西京医院妇产科门诊就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中. 引物的设计与合成根据Belkum等[1]报道，加德纳菌基因序列中的IIS-23srRNA区，设计特异性引物，经计算机模拟杂交符合实验要求，扩增片段：为433 bp. 引物1 ：5′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′；引物 2： 5′-TACAAGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成. Taq DNA聚合酶、4×dNTP、吐温-20,Triton X100,NP-40购自华美生物工程公司；PE480型PCR扩增仪为美国PE公司.
1.2 方法 取在加德纳菌分离培养基[2]上生长的的菌落，置于TNE缓冲液中，以2000 r*min-1离心10 min. 弃上清，加100 μL蛋白酶K裂解液55℃ 60 min，再98℃ 10 min灭活蛋白酶K. 经酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提2次提取加德纳菌DNA，冷乙醇沉淀、TE溶解备用. 将宫颈分泌物加于500 μL生理盐水中，1000 g离心10 min. 弃上清，加碱性裂解液(2 mmol*L-1 NaOH,1 g*L-1吐温-20，1 g*L-1 Triton X-100及1 g*L-1 NP-40) 98℃ 10 min,1000 g离心5 min，取上清作为DNA模板. PCR扩增反应总体积为25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物1.2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板10 μL,Taq DNA聚合酶1 U*μL-1,以无菌石蜡油30 μL覆盖,进行PCR循环,参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃延伸5 min. 取扩增产物15 μL,做20 g*L-1琼脂糖(含EB液)凝胶电泳(100 V，30 min),于紫外光下观察结果,出现433 bp扩增带者为阳性.
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2 结果
2.1 特异性敏感性试验 分别提取阴道加德纳菌、淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体感染细胞株、解脲支原体、白色念珠菌和大肠杆菌的DNA作为PCR模板进行扩增. 结果只有加德纳菌出现433 bp的特异性扩增区带，证实所用引物具有较高的特异性(Fig 1).
图 1 PCR检测的特异性
Fig 1 Spesificity of detection by PCR with Gv as template DNA
1:PCR marker; 2:Gv; 3:N.Gonorrhoeae;4:Chlamydia;5:U.Urealyticum;6:C.albicans;7:E.coli.
将加德纳菌分别制备成：10-9,10-8,10-7,10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2,10-1菌细胞液提取DNA，进行PCR扩增，结果102可扩增出明显的区带(Fig 2).
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2.2 临床标本的检测 将50例宫颈分泌物标本及加德纳菌培养物用革兰染色、分离培养、PCR 3种方法进行检测，其中，革兰染色阳性9例，(检出率18%)；分离培养阳性8例(检出率16%)；PCR阳性14例(阳性率28%). 14例PCR检测阳性的标本中，有9例被革兰染色，8例被分离培养所证实. 6例PCR检测阳性而分离培养呈阴性的患者，经临床调查患者在取标本前曾用过抗生素治疗.
图 2 PCR法检测加德纳菌的敏感性
Fig 2 Senstivity of detection G.Vaginalis different specimens by PCR
1:PCR Markers; 2:10-9;3:10-8;4:10-7;5:10-6; 6:10-5; 7:10-4; 8:10-3;9:10-2;20:10-1.
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3 讨论
细菌性阴道病的主要病原体为阴道加德纳菌(Gv)，以往称此病为非特异性阴道炎. 1984年在斯德哥尔摩关于非特异性阴道炎的国际会议上正式定名为细菌性阴道病. 由于阴道加德纳菌的感染与传播和性活动有关，故此将细菌性阴道病列入第三代性传播疾病. 在健康妇女中，阴道由于组织解剖和生物化学以及生理方面的特点，对于外界病原体的侵入有着相当强的防御能力. 使病原体难以侵犯阴道，保持阴道的正常结构和生理功能. 如果阴道的自然防御屏障作用破坏，导致病原体在阴道中生长繁殖，引起阴道炎症. 目前，已确认的阴道炎特异性病原体有：白色念珠菌、阴道滴虫、淋病双球菌. 此外，病原引起的阴道炎称为非特异性阴道炎(NSV)，在性传播疾病中，发现高达20%的女性患者有NSV. 研究结果表明[3]，NSV是Gv和一些厌氧菌共存相互作用的结果. Gv可通过性交传染，患病妇女的性伙伴约有90%尿道可检出Gv，因此尿道培养的阳性率高达80%. 在患病妇女中，重复感染率高. 近年来，细菌性阴道病的发病率呈增高趋势，由于临床症状不明显，得不到及时诊断和治疗. 阐明Gv的生物学性状和基因序列并建立基因诊断方法，对于NSV的诊断及治疗，防止性病的传播，保护妇女的健康，具有十分重大的意义.
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在细菌性阴道感染者中，尤其是非淋菌性的病原体感染，有部分女性患者感染后得不到及时治疗，或经过不正规的治疗后，转为慢性感染或带菌者，当机体受外来及生理因素影响时，病原体可再次复活而侵袭传播，使病情总是反复发作不能痊愈，此时病原体又不易查出，给患者带来极大的苦恼. 阴道加德纳菌做为一种条件致病菌，在临床上，由于大量抗生素的应用使加德纳菌的感染率在不断的增高，再与性传播有关，正逐步引起临床的高度重视. 近来研究证实[4，5]，加德纳菌的致病性与生物分型有关，IIS区基因的多态性是导致加德纳菌发生不同生物型的原因之一. 我们根据加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区序列作为特异性引物，建立快速的基因扩增方法，证明该引物序列具有较强的特异性和较高的敏感性；可用于对阴道炎宫颈分泌物中加德纳菌的快速检测. 检测结果表明，在50例宫颈分泌物标本，用革兰染色、分离培养，聚合酶链反应同时对加德纳菌进行检测，革兰染色阳性检出率为18%；分离培养阳性检出率为16%；PCR法的阳性率为28%. 在14例PCR检测阳性的标本中，其中有8例被革兰染色和分离培养所证实，对6例PCR检测阳性而分离培养阴性的患者，经临床调查为取标本前曾用抗生素治疗，可能是分离培养结果阴性的原因. PCR法检测的是病原体的遗传物质DNA，不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义. 由于聚合酶链反应技术方法本身所具有的高特异性和敏感性，采用聚合酶链反应检测阴道分泌物中的加德纳菌，用于细菌性阴道病的快速诊断，有可能成为今后细菌性阴道病实验室诊断的主要快速检测方法之一.
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作者简介：于文彬(1944-),男(汉族)，山东省潍坊市人. 1969年上海医科大学医学系毕业，检验科主任、教授，硕士研究生导师，陕西省检验学会副主任委员，发表论文30篇. Tel.(029)3375572
参考文献:
[1] Belkum AV, Koeken A, Vandmme P et al. Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for gardnerella vaginalis[J]. Mol Cell Probes, 1995;9:167-169.
[2] 谭巨莲, 吴宝印, 李仕英 et al. 阴道加德纳尔菌的分离鉴定[J].中华医学检验杂志，1991；14(2):107-108.
[3] 丁振若,于文彬. 现代性病实验诊断学[M]. 西安：世界图书出版公司，1999：4.
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[4] Pedraza Aviles AG, Inzunza Montiel AE, Ortiz Zaragoza MC et al. Gardnerella vaginalis biotypes; modification of a proposed system[J]. Rev Latinoam Microbiol, 1995;37:19-21.
[5] Ingianni A, Petruzzelli S, Morandotti G et al. Genotypic differentiation of gardnerella vaginalis amplified ribosomal DNA restriction analysis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,1997;18:61-63.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药