补锌对衰老大鼠睾丸细胞凋亡和一氧化氮合酶的影响
作者：李积胜 汪超 王静 王鹏 贺智
单位：武警医学院神经研究室，天津 300162
关键词：补锌；衰老；睾丸；细胞凋亡；一氧化氮合酶
中国老年学杂志000217摘 要 目的 探讨补锌对衰老过程睾丸细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 选用24月龄Wistar雄性大鼠16只，均分为实验组和对照组，实验(补锌)组和对照组分别喂养补锌和常锌饲料。喂养4 w后，采用原子吸收分光光度法测定血清锌含量；采用放射免疫分析法测定血清睾丸酮含量；采用NADPH-d组织化学法显示睾丸细胞一氧化氮合酶(NOS)活性；采用原位缺口平移技术(INST法)显示睾丸凋亡细胞数目。结果 与对照组相比，老年大鼠补锌4 w后，血清锌含量明显升高(P<0.05)；血清睾丸酮水平明显升高(P<0.05)；睾丸间质细胞NOS阳性细胞数目明显减少(P<0.01)，NOS阳性细胞反应强度明显减低；睾丸生精细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。结论 锌是睾丸发育必需的营养素，补锌可使老年大鼠睾丸细胞凋亡数目减少，这种变化可能与补锌对衰老大鼠睾丸细胞NOS活性和睾丸酮水平的调节有关。
, 百拇医药
The influence of zinc supplementation on apoptosis of old rats' testicular cells its nitric oxide synthase activity
Li Jisheng,Wang Chao,Wang Jing et al
(Dept.of Neurobiology,Chinese People's Armed Police Force Medical College,Tianjin 300162)
Abstract：Objective To study the effective mechanism of zinc supplement on testis apoptosis.Methods 16 wistar male rats(24 months) were evenly divided into zinc supplement and control groups after 4 weeks,and the serum zinc levels and testosterone contents were measured.The apoptosis of spermatogenic cells were studied in situ with nick translation(ISNT) technique.Results As compared with the control group,the serum zinc and testostrone contents were obviously increased(P<0.05)，NOS positive cell in testis was significantly decreased(P<0.01) and apoptosis number was obviously decreased in zinc supplement group.Conclusions Adequate amouunt of zinc supplement can decreased testis apoptosis of aging rats,but the serum testostrone increased and NOS positive cell with decreased activity might be one of the importent mechanism of zinc supplement which can inhibit testis apoptosis of the aging rats.
, 百拇医药
Key words Zinc supplement Aging Testis Apoptosis Nitric oxide synthase
近50年来的研究表明〔1〕，全球范围男性生育能力明显下降。其中环境污染、性病蔓延、吸毒、酗酒、过度吸烟等生物、物理和化学因素致男性生殖器官睾丸损害，是导致男性生育能力降低的最常见原因。根据WHO全球政策委员会1994提出的生殖健康定义，为提高我国人民的生活质量，我国已提出了适合我国国情的生殖健康规划。鉴于我国人口老龄化日趋明显，因此，老年男性生殖健康已倍受关注。为揭示补锌对衰老大鼠睾丸细胞凋亡的保护作用及其可能机制，本研究在证明缺锌可诱导睾丸生精细胞发生凋亡的基础上〔2〕，对补锌衰老大鼠睾丸细胞凋亡数目、睾丸酮水平和NOS阳性细胞数目和活性变化进行了研究，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 动物分组和用药 选用健康24月龄Wistar雄性大鼠16只，均分为实验(补锌)组和对照组。两组大鼠在相同环境中分别喂养含锌量为100和45 mg/kg固体饲料，4 w后进行实验。
, 百拇医药
1.2 样品制备 二组大鼠在相同条件下麻醉，开胸，经心脏穿刺取血3 ml，分离血清，同时快速经心脏灌注生理盐水150 ml，再用500 ml含4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注固定。取右侧睾丸入上述固定液后固定6 h(4 ℃)，再移入含20%蔗糖的磷酸盐缓冲液中至沉底(4 ℃)。冰冻切片机冠状位切片，片厚30 μm，贴于涂有铬明胶的载玻片上，37 ℃烘箱烘烤过夜。
1.3 血清锌含量测定 采用火焰原子吸收分光光度法，所用仪器为IL-AA951型。
1.4 血清睾丸酮含量测定 采用放射免疫分析法，3H-睾丸酮试剂盒由中国科学院动物研究所提供。双管测定，取均值，用Wallac1410液闪计数仪测定DPM，转化为logit值，代入logit半对数回归方程，计算睾丸酮含量。
1.5 睾丸细胞NOS显示 采用NADPH-d组化染色。切片移入NADPH-d反应液，37 ℃孵育1 h，反应液成分：NADPH-Ⅱ(Sigma公司) 5 mg，NBT(氯化硝基四氮唑蓝，华美公司提供)2.5 mg，0.3% Triton-TBS 5 ml。终止反应后裱片、脱水、透明、封片。每组选择15张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数3组每5个曲细精管间结构完成的NOS阳性细胞数目。
, 百拇医药
1.6 睾丸凋亡细胞标记和计数 采用INST法〔2〕。切片入缺口平移混合液〔0.05 mmol/L TBS,0.05 mol/L MgCl2，10 μg/μl乙酰化BSA，0.2 X地高辛DNA标记混合液(Boehringer Mannheim)0.2 U/L DNA聚合酶(Klenow片段)〕中保湿1 h，以碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim,1∶1 000稀释)室温孵育4 h，入NBT和BCIP显色液中，25 ℃显色10 min左右终止显色反应；对照实验中缺口平移混合液中不加Kelenow片段，其它步骤与阳性实验相同。每组选择15张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数每10个曲细精管中凋亡细胞的数目。
实验数据用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 血清锌和睾丸酮含量的变化 与对照组相比，补锌组大鼠在血清锌水平明显增加的同时(P<0.05)，血清睾丸酮含量也明显增加(P<0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 补锌对衰老大鼠血清锌、睾丸酮含量的影响(
±s) 组别
血清锌(μmol/L)
睾丸酮(nmol/L)
实验组
19.58±0.941)
279.65±71.361)
对照组
13.71±1.13
227.34±54.31
1)与对照组相比，P<0.05
, 百拇医药
2.2 睾丸NOS阳性细胞的变化 在NADPH-d法标记的睾丸组织切片上，衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞呈深蓝色，主要存在于间质细胞，而生精细胞和支持细胞呈弱阳性；补锌组睾丸间质细胞NOS阳性细胞明显减少，胞浆显色明显减弱。二组大鼠睾丸切片经形态计量分析发现，实验组大鼠睾丸NOS阳性细胞数目较对照组明显减少(P<0.01，表2)。表2 补锌对衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞数目的影响 组别
切片数(张)
NOS细胞数(NO./5个曲细精管)
实验组
15
122.79±37.191)
对照组
, 百拇医药 15
185.77±51.46
1)与对照组相比，P<0.01
2.3 睾丸细胞凋亡数目的变化 在ISNT法标记的睾丸组织切片上，衰老大鼠睾丸凋亡细胞较多，可见于各级生精细胞层，补锌组睾丸凋亡细胞数目少，主要存在于精原细胞层。二组大鼠睾丸切片经形态计量分析发现，实验组大鼠睾丸生精细胞凋亡数目较对照组明显减少(P<0.05，表3)。表3 补锌对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡数目的影响 组别
切片数(张)
凋亡细胞(NO./10个曲细精管)
实验组
15
, 百拇医药 10.82±2.191)
对照组
15
16.57±3.46
1)与对照组相比，P<0.05
3 讨 论
锌是人体必需的微量元素，与生殖系统的发育和功能密切相关。睾丸组织对锌具有强烈的依赖性。现已确认，衰老过程中机体对锌的吸收与年龄呈负相关，锌具有治疗男性不育和老年性功能减退的潜力〔3〕。本研究进一步观察到补锌老年大鼠血清锌水平升高的同时，睾丸生精细胞凋亡的数目明显减少。有报道，单纯锌摄入不足可引起睾丸内蛋白、脂质及核酸的氧化损伤增强〔4〕，睾丸生精细胞发生凋亡数目增加〔2〕。提示衰老过程中机体锌水平的降低是诱发睾丸生精细胞凋亡的重要原因。但关于补锌减少衰老大鼠睾丸生精细胞发生凋亡的机制是什么，目前尚不清楚。
, 百拇医药
有报道，血清睾丸酮浓度与男性器官发育成熟度及血锌、发锌含量呈正相关，缺锌时，血清睾丸酮和精液量均减少〔5〕；衰老过程中睾丸酮水平降低〔6〕；单纯睾丸酮水平的降低可明显增加生精细胞的凋亡〔7〕；本研究结果证明补锌可使衰老大鼠血清睾丸酮水平明显升高。内源性一氧化氮(NO)是由NOS催化合成的一种具有广泛生物学活性的信使分子和毒性因子，参与机体多种生理和病理反应过程。NO的生物半衰期仅数秒，因此，细胞产生NO量的多少及释放时间的长短关键取决于NOS的活性。Tomlinson等〔8〕发现，将NO供体SNP与有活力的精子共同培养，NO能明显减弱精子运动能力，减少有活力精子的百分数。Bauche等〔9〕发现，NO合成抑制剂L-NAME孵育精子，可明显增强其运动和生存能力。最近，有研究证明睾丸NOS的活性增强与生精细胞凋亡增加有关〔10〕。本研究发现，补锌可使衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞数目明显减少，反应强度变浅。由此可见，补锌对睾丸酮含量的上调和睾丸NOS活性的下调作用可能是补锌调控衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡的重要原因。 本课题受国家自然科学基金经费资助(No.39870689)
, http://www.100md.com
作者简介：李积胜，男，35岁，博士，教授，从事衰老机制的细胞生物学研究
参考文献
1，曹 坚.我国男性生殖健康的现状与未来.中华医学杂志，1998；78(2)：83
2，李积胜，徐鹏霄，贺 智.缺锌对大鼠睾丸精子细胞凋亡的影响.中华医学杂志，1998；78(2)：91
3，Vallee BL，Falchuk KH.Biochemical basis of zinc physiology.Physiol Rev，1993；73(1)：79
4，Matrtin GB，White Cl,Markey CM et al.Effects of dietary zinc deficiency on the reproductive system of young male sheep:testicular growth and the secretion of inhibin and testosterone.J Reprod Fertil，1994；101：87
, 百拇医药
5，Hunt CD，Johnson PR，Herbel J et al.Effects of dietary zinc depletion on seminal volume and zinc loss，serum tetosterone concentration and sperm morphology in young men.Am J Clin Nutr，1992；56：148
6，Grzywacz FW，Chen H,Allegretti J et al.Does age-associated reduced leydig cell testosterone production in Brown Norway rats result from under-stimulation by luteinizing hormone?J Androl，1998；19(5)：625
7，Henriksen K，Hakovirta H,Parvinen M.Testosterone inhibits and induces apoptosis in rat seminiferous tubules in a stage-specific manner:in situ quantification in squash preparations after administration of ethane dimethane sulfonate.Endocrinology，1995；136(8)：3285
, http://www.100md.com
8，Tomlinson Mj，East SJ,Barratt CL et al.Preliminary communication:possible role of reactive nitrogen intermediates in leucocytemediated sperm dysfunction.Am J Reprod Immunol，1992；27(1)：89
9，Bauche F，Stephan JP,Touzalin AM et al.In vitro regulation of an inducible-type NO synthase in the rat seminiferous tubule cells.Biol Reprod，1998；58(2)：431
10，El Gohary M，Awara WM,Nassar S et al.Deltamethrin induced teticular apoptosis in rats:the protective effect of nitric oxide synthase inhibitor.Toxicology，1999；132(1)：1
收稿日期：1999-12-12, 百拇医药
单位：武警医学院神经研究室，天津 300162
关键词：补锌；衰老；睾丸；细胞凋亡；一氧化氮合酶
中国老年学杂志000217摘 要 目的 探讨补锌对衰老过程睾丸细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 选用24月龄Wistar雄性大鼠16只，均分为实验组和对照组，实验(补锌)组和对照组分别喂养补锌和常锌饲料。喂养4 w后，采用原子吸收分光光度法测定血清锌含量；采用放射免疫分析法测定血清睾丸酮含量；采用NADPH-d组织化学法显示睾丸细胞一氧化氮合酶(NOS)活性；采用原位缺口平移技术(INST法)显示睾丸凋亡细胞数目。结果 与对照组相比，老年大鼠补锌4 w后，血清锌含量明显升高(P<0.05)；血清睾丸酮水平明显升高(P<0.05)；睾丸间质细胞NOS阳性细胞数目明显减少(P<0.01)，NOS阳性细胞反应强度明显减低；睾丸生精细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。结论 锌是睾丸发育必需的营养素，补锌可使老年大鼠睾丸细胞凋亡数目减少，这种变化可能与补锌对衰老大鼠睾丸细胞NOS活性和睾丸酮水平的调节有关。
, 百拇医药
The influence of zinc supplementation on apoptosis of old rats' testicular cells its nitric oxide synthase activity
Li Jisheng,Wang Chao,Wang Jing et al
(Dept.of Neurobiology,Chinese People's Armed Police Force Medical College,Tianjin 300162)
Abstract：Objective To study the effective mechanism of zinc supplement on testis apoptosis.Methods 16 wistar male rats(24 months) were evenly divided into zinc supplement and control groups after 4 weeks,and the serum zinc levels and testosterone contents were measured.The apoptosis of spermatogenic cells were studied in situ with nick translation(ISNT) technique.Results As compared with the control group,the serum zinc and testostrone contents were obviously increased(P<0.05)，NOS positive cell in testis was significantly decreased(P<0.01) and apoptosis number was obviously decreased in zinc supplement group.Conclusions Adequate amouunt of zinc supplement can decreased testis apoptosis of aging rats,but the serum testostrone increased and NOS positive cell with decreased activity might be one of the importent mechanism of zinc supplement which can inhibit testis apoptosis of the aging rats.
, 百拇医药
Key words Zinc supplement Aging Testis Apoptosis Nitric oxide synthase
近50年来的研究表明〔1〕，全球范围男性生育能力明显下降。其中环境污染、性病蔓延、吸毒、酗酒、过度吸烟等生物、物理和化学因素致男性生殖器官睾丸损害，是导致男性生育能力降低的最常见原因。根据WHO全球政策委员会1994提出的生殖健康定义，为提高我国人民的生活质量，我国已提出了适合我国国情的生殖健康规划。鉴于我国人口老龄化日趋明显，因此，老年男性生殖健康已倍受关注。为揭示补锌对衰老大鼠睾丸细胞凋亡的保护作用及其可能机制，本研究在证明缺锌可诱导睾丸生精细胞发生凋亡的基础上〔2〕，对补锌衰老大鼠睾丸细胞凋亡数目、睾丸酮水平和NOS阳性细胞数目和活性变化进行了研究，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 动物分组和用药 选用健康24月龄Wistar雄性大鼠16只，均分为实验(补锌)组和对照组。两组大鼠在相同环境中分别喂养含锌量为100和45 mg/kg固体饲料，4 w后进行实验。
, 百拇医药
1.2 样品制备 二组大鼠在相同条件下麻醉，开胸，经心脏穿刺取血3 ml，分离血清，同时快速经心脏灌注生理盐水150 ml，再用500 ml含4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注固定。取右侧睾丸入上述固定液后固定6 h(4 ℃)，再移入含20%蔗糖的磷酸盐缓冲液中至沉底(4 ℃)。冰冻切片机冠状位切片，片厚30 μm，贴于涂有铬明胶的载玻片上，37 ℃烘箱烘烤过夜。
1.3 血清锌含量测定 采用火焰原子吸收分光光度法，所用仪器为IL-AA951型。
1.4 血清睾丸酮含量测定 采用放射免疫分析法，3H-睾丸酮试剂盒由中国科学院动物研究所提供。双管测定，取均值，用Wallac1410液闪计数仪测定DPM，转化为logit值，代入logit半对数回归方程，计算睾丸酮含量。
1.5 睾丸细胞NOS显示 采用NADPH-d组化染色。切片移入NADPH-d反应液，37 ℃孵育1 h，反应液成分：NADPH-Ⅱ(Sigma公司) 5 mg，NBT(氯化硝基四氮唑蓝，华美公司提供)2.5 mg，0.3% Triton-TBS 5 ml。终止反应后裱片、脱水、透明、封片。每组选择15张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数3组每5个曲细精管间结构完成的NOS阳性细胞数目。
, 百拇医药
1.6 睾丸凋亡细胞标记和计数 采用INST法〔2〕。切片入缺口平移混合液〔0.05 mmol/L TBS,0.05 mol/L MgCl2，10 μg/μl乙酰化BSA，0.2 X地高辛DNA标记混合液(Boehringer Mannheim)0.2 U/L DNA聚合酶(Klenow片段)〕中保湿1 h，以碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim,1∶1 000稀释)室温孵育4 h，入NBT和BCIP显色液中，25 ℃显色10 min左右终止显色反应；对照实验中缺口平移混合液中不加Kelenow片段，其它步骤与阳性实验相同。每组选择15张相同断面的切片，光镜下在每张切片上随机计数每10个曲细精管中凋亡细胞的数目。
实验数据用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 血清锌和睾丸酮含量的变化 与对照组相比，补锌组大鼠在血清锌水平明显增加的同时(P<0.05)，血清睾丸酮含量也明显增加(P<0.05)，见表1。
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表1 补锌对衰老大鼠血清锌、睾丸酮含量的影响(
±s) 组别血清锌(μmol/L)
睾丸酮(nmol/L)
实验组
19.58±0.941)
279.65±71.361)
对照组
13.71±1.13
227.34±54.31
1)与对照组相比，P<0.05
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2.2 睾丸NOS阳性细胞的变化 在NADPH-d法标记的睾丸组织切片上，衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞呈深蓝色，主要存在于间质细胞，而生精细胞和支持细胞呈弱阳性；补锌组睾丸间质细胞NOS阳性细胞明显减少，胞浆显色明显减弱。二组大鼠睾丸切片经形态计量分析发现，实验组大鼠睾丸NOS阳性细胞数目较对照组明显减少(P<0.01，表2)。表2 补锌对衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞数目的影响 组别
切片数(张)
NOS细胞数(NO./5个曲细精管)
实验组
15
122.79±37.191)
对照组
, 百拇医药 15
185.77±51.46
1)与对照组相比，P<0.01
2.3 睾丸细胞凋亡数目的变化 在ISNT法标记的睾丸组织切片上，衰老大鼠睾丸凋亡细胞较多，可见于各级生精细胞层，补锌组睾丸凋亡细胞数目少，主要存在于精原细胞层。二组大鼠睾丸切片经形态计量分析发现，实验组大鼠睾丸生精细胞凋亡数目较对照组明显减少(P<0.05，表3)。表3 补锌对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡数目的影响 组别
切片数(张)
凋亡细胞(NO./10个曲细精管)
实验组
15
, 百拇医药 10.82±2.191)
对照组
15
16.57±3.46
1)与对照组相比，P<0.05
3 讨 论
锌是人体必需的微量元素，与生殖系统的发育和功能密切相关。睾丸组织对锌具有强烈的依赖性。现已确认，衰老过程中机体对锌的吸收与年龄呈负相关，锌具有治疗男性不育和老年性功能减退的潜力〔3〕。本研究进一步观察到补锌老年大鼠血清锌水平升高的同时，睾丸生精细胞凋亡的数目明显减少。有报道，单纯锌摄入不足可引起睾丸内蛋白、脂质及核酸的氧化损伤增强〔4〕，睾丸生精细胞发生凋亡数目增加〔2〕。提示衰老过程中机体锌水平的降低是诱发睾丸生精细胞凋亡的重要原因。但关于补锌减少衰老大鼠睾丸生精细胞发生凋亡的机制是什么，目前尚不清楚。
, 百拇医药
有报道，血清睾丸酮浓度与男性器官发育成熟度及血锌、发锌含量呈正相关，缺锌时，血清睾丸酮和精液量均减少〔5〕；衰老过程中睾丸酮水平降低〔6〕；单纯睾丸酮水平的降低可明显增加生精细胞的凋亡〔7〕；本研究结果证明补锌可使衰老大鼠血清睾丸酮水平明显升高。内源性一氧化氮(NO)是由NOS催化合成的一种具有广泛生物学活性的信使分子和毒性因子，参与机体多种生理和病理反应过程。NO的生物半衰期仅数秒，因此，细胞产生NO量的多少及释放时间的长短关键取决于NOS的活性。Tomlinson等〔8〕发现，将NO供体SNP与有活力的精子共同培养，NO能明显减弱精子运动能力，减少有活力精子的百分数。Bauche等〔9〕发现，NO合成抑制剂L-NAME孵育精子，可明显增强其运动和生存能力。最近，有研究证明睾丸NOS的活性增强与生精细胞凋亡增加有关〔10〕。本研究发现，补锌可使衰老大鼠睾丸NOS阳性细胞数目明显减少，反应强度变浅。由此可见，补锌对睾丸酮含量的上调和睾丸NOS活性的下调作用可能是补锌调控衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡的重要原因。 本课题受国家自然科学基金经费资助(No.39870689)
, http://www.100md.com
作者简介：李积胜，男，35岁，博士，教授，从事衰老机制的细胞生物学研究
参考文献
1，曹 坚.我国男性生殖健康的现状与未来.中华医学杂志，1998；78(2)：83
2，李积胜，徐鹏霄，贺 智.缺锌对大鼠睾丸精子细胞凋亡的影响.中华医学杂志，1998；78(2)：91
3，Vallee BL，Falchuk KH.Biochemical basis of zinc physiology.Physiol Rev，1993；73(1)：79
4，Matrtin GB，White Cl,Markey CM et al.Effects of dietary zinc deficiency on the reproductive system of young male sheep:testicular growth and the secretion of inhibin and testosterone.J Reprod Fertil，1994；101：87
, 百拇医药
5，Hunt CD，Johnson PR，Herbel J et al.Effects of dietary zinc depletion on seminal volume and zinc loss，serum tetosterone concentration and sperm morphology in young men.Am J Clin Nutr，1992；56：148
6，Grzywacz FW，Chen H,Allegretti J et al.Does age-associated reduced leydig cell testosterone production in Brown Norway rats result from under-stimulation by luteinizing hormone?J Androl，1998；19(5)：625
7，Henriksen K，Hakovirta H,Parvinen M.Testosterone inhibits and induces apoptosis in rat seminiferous tubules in a stage-specific manner:in situ quantification in squash preparations after administration of ethane dimethane sulfonate.Endocrinology，1995；136(8)：3285
, http://www.100md.com
8，Tomlinson Mj，East SJ,Barratt CL et al.Preliminary communication:possible role of reactive nitrogen intermediates in leucocytemediated sperm dysfunction.Am J Reprod Immunol，1992；27(1)：89
9，Bauche F，Stephan JP,Touzalin AM et al.In vitro regulation of an inducible-type NO synthase in the rat seminiferous tubule cells.Biol Reprod，1998；58(2)：431
10，El Gohary M，Awara WM,Nassar S et al.Deltamethrin induced teticular apoptosis in rats:the protective effect of nitric oxide synthase inhibitor.Toxicology，1999；132(1)：1
收稿日期：1999-12-12, 百拇医药