基质小泡在牙胚及颅面骨矿化组织发育中的作用
作者：朱平 张伟国
单位：上海第二医科大学口腔医学院口腔病理研究室 200011
关键词：大鼠；Wistar；牙胚；显微镜检查；电子；基质小泡
中华口腔医学杂志000123 摘 要：目的：进一步深入了解基质小泡(matrix vesicles，MVs)在生物硬组织矿化中的作用。方法：应用透射电子显微镜(TEM)观察Wistar大鼠牙胚、颅骨和颌骨矿化过程中MVs的超微结构。结果：①MVs是由分泌型成骨细胞、成牙本质细胞及其突起芽生进入胶原基质；②MVs在细胞外胶原基质中有一个逐渐成熟的过程，并以羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)晶体的出现为其主要特征；③HAP在MVs内形成、增多，最终进入胶原基质并进一步沉积、钙化；④部分胶原原纤维表面沉积的HAP 晶体与MVs分泌的晶体有明显的移形迹象。结论：MVs在生物硬组织矿化中有重要作用；成熟胶原原纤维特定的排列方式可能为矿化的进一步形成创造良好的环境，并提供一个晶体生长的模板。
, http://www.100md.com
The role of matrix vesicles during development of the mineralizing tissues of tooth germ and craniofacial bone
ZHU Ping
(Department of Oral Pathlology,School of Stomatology ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200011,China)
ZHANG Weiguo
(Department of Oral Pathlology,School of Stomatology ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200011,China)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To evaluate the role of matrix vesicles (MVs) during the development of mineralizing tissues.Methods：The ultrastructure of MVs of tooth germ、calvarial bone and mandibular bone were observed by trasmission electron microscopy in fetal Wistar rat.Results：①The MVs were formed by osteoblast of the secret type、dentinoblast and process;② There was a mature process of the MVs in the extracellular matrix.The appearance of the hydroxyapatite (HAP) was a major mature feature;③ HAP formed initially in the MVs entered into collage matrix and eventually mineralized;④ The shifting sign of HAP from MVs to the surface of collage fibril was observed.Conclusions：The MVs played an important role in the biomineralization,but the special arrange pattern of mature collage fiber provided a suitable environment and a model to the growth of HAP for further mineralization.
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Key words：Rats,Wistar；Tooth germ；Microscopy，electron; Matrix vesicles▲
牙本质和骨均为矿化的结缔组织，矿化的发生是一个十分复杂而又有序的过程。目前对矿化的认识主要有两种理论，即同质晶核理论和异质晶核理论。前者强调了基质小泡(matrix vesicles，MVs)及其内部碱性磷酸酶(alkalin phosphatase，ALP)等的作用,认为首先在MVs内形成晶核化，然后种晶(seeds)进入基质，并在与钙和(或)羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)有亲和力的非胶原蛋白生物大分子的作用下发生同质晶核化[1，2]；而后者则认为最初的矿化首先发生在胶原蛋白分子的孔区，并以胶原蛋白分子为结晶的异质晶核[3] 。但确切的发生机理仍不甚明确。我们应用TEM对Wistar 大鼠牙胚、颅骨及颌骨形成、矿化过程中MVs的超微结构进行观察，对MVs来源、发育的形态变化及HAP的形成和一系列变化过程做了详细描述，以期为深入了解MVs在生物硬组织矿化中的作用提供形态学资料。
, 百拇医药
材料与方法
1. 材料：胚胎14及21 d的Wistar 大鼠各3只。
2. 用乙醚麻醉法处死动物，沿矢状方向从中线将头颅剖开，取牙胚(颌骨)、颅骨组织。将所取组织置于3%戊二醛中固定，4℃过夜，0.2 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗，1%锇酸后固定2 h(4 ℃)，梯度丙酮常规脱水，环氧树脂618浸透、包埋。经Diamond ultramicrotome knife,Drukker Co 超薄切片，Hitachi 600 透射电镜观察。
结果
一、骨细胞、成牙本质细胞的分化及基质形成
在14及21 d胚龄Wistar 大鼠颅、颌骨及牙胚处，可观察到不同分化阶段的成骨细胞和成牙本质细胞。在分泌型成骨细胞阶段，细胞表现出很强的合成能力和活跃的分泌功能。在细胞周围有大量新合成的胶原原纤维，排列较稀疏、无方向性。原纤维间无定型基质丰富，离胞体稍远部位的胶原原纤维的排列较密集、规则、趋于束状，周期横纹清晰。
, 百拇医药
部分成牙本质细胞亦表现为十分活跃的生物合成状态，其顶端有较为丰富的新生胶原原纤维及无定型基质。原纤维排列亦无规则且疏松。有少量周期横纹明显的粗大原纤维，原纤维由少到多、由疏松到致密、最后规则地交织在一起，而且越远离细胞越趋于成熟。
二、MVs的形成及变化
随着骨胶原基质的逐渐成熟，可见分泌型成骨细胞不断从细胞表面和突起边缘释放MVs进入基质(图1),MVs呈圆形、直径约100～300 nm、电子密度不一，越远离细胞体直径越大，电子密度越高。HAP首先出现在较小的MVs内，呈针状、细丝状或颗粒状，较大的MVs周缘可见放射状排列的HAP结晶。当MVs体积及内部HAP数量增加到一定程度时，MVs膜逐渐消失，HAP晶核完全暴露于胶原基质中并逐渐向周围扩散，沉积于胶原基质内(图2)。在成熟胶原纤维表面可见平行排列的MVs，部分原纤维表面可见与其长轴平行的HAP晶体，这些晶体与MVs分泌的晶体有明显移形的迹象(图3)。
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图1 胚胎21 d龄的鼠颅骨组织TEM图像。骨基质中可见多个MVs(↑)，有的正从分泌型成骨细胞表面向外分泌，越远离细胞，其MVs直径越大，电子密度越高 图2 胚胎21 d龄的鼠牙胚牙本质基质TEM图像。可见大量散在分布的MVs，从早期的MVs(↑)逐渐向成熟的MVs(▲)过渡，密度逐渐增高，小泡膜破裂，HAP晶体呈放射状排列 图3 胚胎21 d龄的鼠颅骨组织TEM图像。在成熟的胶原原纤维束表面可见大量平行排列的MVs，部分胶原表面可见与其长轴平行的HAP晶体沉积(↑)，并且这些晶体与小泡分泌的晶体有移形的迹象(▲)
在牙胚较成熟的牙本质内也可观察到大量MVs。MVs在基质中亦有不断增大、密度增高等逐渐成熟的过程，可见HAP在MVs膜或内部出现、数量增多及最终进入基质的过程。此外，在一些矿化较密集的区域，亦可见散在的MVs的圆形轮廓，周缘呈羽绒状，而且与胶原基质中的HAP有明显移形的迹象(图4)。
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图4 胚胎21 d龄鼠牙胚的牙本质TEM图像。可见MVs(△)的圆形轮廓和HAP沉积
讨论
MVs在生物硬组织矿化中起着十分重要的作用，本研究不仅观察到骨基质和牙本质基质中有大量的MVs及分泌型成骨细胞正在分泌MVs的现象,还观察到HAP最初在MVs内形成到最终在胶原基质内沉积、生长、钙化的一系列形态变化过程。新形成的胶原基质内并无MVs,而成熟的胶原基质内有丰富的MVs存在，说明成熟的胶原基质可能对MVs的分泌有一定诱导作用。刚分泌的MVs到离细胞稍远、接近成熟胶原基质内的MVs不仅直径越来越大，而且电子密度越来越高，HAP晶核也越来越多，这表明MVs在分泌后经历了一个不断成熟的过程，以小泡内矿物盐的结晶化为主要特征。随着晶核的不断增多，MVs膜破裂消失，HAP晶核释放至胶原基质中并向周围扩散、生长，使基质矿化。因此我们认为MVs是矿化的起点。许多研究亦证实，在骨、牙本质和软骨组织基质发生矿化时均可出现MVs[4-6]。Morris等[7]的研究也认为，最初矿化的晶核形成于MVs膜上。由于MVs内含有大量的能富集钙磷离子的ALP等物质,通过分解和浓集磷酸离子，加之MVs膜上的annexin V将MVs外的钙离子移至泡内，从而造成局部高浓度的钙磷环境，当MVs内的钙离子浓度集聚到一定程度，即可导致晶核化的发生而形成种晶，然后破壁进入胶原基质中成为继续矿化的结晶晶核使基质矿化[8，9]。
, 百拇医药
然而，也有学者认为最初的矿化首先发生在胶原蛋白的孔区，并以胶原蛋白分子为结晶的异质晶核[10]。有的作者在体外培养的成骨细胞基质的胶原纤维表面，发现有与之平行排列的HAP晶体，因而认为这是胶原作为异质晶核的证据。作者在观察中也注意到在骨基质纤维表面存在一定的与纤维长轴平行排列的HAP，但仔细观察则发现它们与MVs的晶体有移形关系，在矿化的牙本质基质中亦可见散在的MVs的圆形轮廓，周缘呈羽绒状，而且与胶原基质中的HAP有移形的迹象，提示这些胶原表面的HAP极可能来自MVs。所以作者认为致密排列的成熟胶原纤维以及存在于孔区内的磷酸蛋白及ALP的去磷酸化作用，可为孔区局部的磷酸环境提供基础，使MVs分泌的HAP晶核易于在此沉积，磷酸蛋白及ALP等可能为晶体的进一步生长创造了一个理想的环境，并提供一个晶体生长的模板，因而在晶体的延伸、排列和增长中起重要作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470750)
参考文献：
, 百拇医药
[1]成令忠，主编.组织学.第2版.北京:人民卫生出版社,1994.3287-3422.
[2]Sela J,Schwartz Z,Swain LD,et al.Calcification in biological systems.In:Bonucci E,ed.Boca Roton:CRC Press,1992.74-105.
[3]Limeback H.Molecular mechanisms in dental hard tissue mineralization.Curr Opin Dent,1991,1:826-835.
[4]Young MF,Kerr JM,Ibaraki K,et al.Structure,expression,and regulation of the major noncollagenous matrix proteins of bone.Clin Orthop,1992,(281):275-294.
, 百拇医药
[5]Steinfort J,van de Stadt R,Beertsen W.Identification of new rat dentin proteoglycans utilizing C18 chromatograph.J Biol Chem,1994,269:22397-22404.
[6]Takagi M,Hishikawa H,Hosokawa Y,et al.Immunohistochemical localization of glycosaminoglycans and proteoglycans in predentin and dentin of rat incisors.J Histochem Cytochen,1990,38:319-324.
[7]Morris DC,Masuhara K,Takaoka K,et al.Immunolocalization of alkaline phosphatase in osteoblasts and matrix vesicles of human fetal bone.Bone Miner,1992,19:287-298.
, 百拇医药
[8]Anderson HC.Molecular biology of matrix vesicles.Clin Orthop,1995,(314):266-280.
[9]Kirsch T,Nah HD,Shapiro IM,et al.Regulated production of mineralization-competent matrix vesicles in hypertrophic chondrocytes.J Cell Biol,1997,137:1149-1160.
[10]Christoffersen J,Landis WJ.A contribution with review to the description of mineralization of bone and other calcified tissues in vivo.Anat Rec,1991,230(4): 435-450.
收稿日期:1998-12-07, 百拇医药
单位：上海第二医科大学口腔医学院口腔病理研究室 200011
关键词：大鼠；Wistar；牙胚；显微镜检查；电子；基质小泡
中华口腔医学杂志000123 摘 要：目的：进一步深入了解基质小泡(matrix vesicles，MVs)在生物硬组织矿化中的作用。方法：应用透射电子显微镜(TEM)观察Wistar大鼠牙胚、颅骨和颌骨矿化过程中MVs的超微结构。结果：①MVs是由分泌型成骨细胞、成牙本质细胞及其突起芽生进入胶原基质；②MVs在细胞外胶原基质中有一个逐渐成熟的过程，并以羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)晶体的出现为其主要特征；③HAP在MVs内形成、增多，最终进入胶原基质并进一步沉积、钙化；④部分胶原原纤维表面沉积的HAP 晶体与MVs分泌的晶体有明显的移形迹象。结论：MVs在生物硬组织矿化中有重要作用；成熟胶原原纤维特定的排列方式可能为矿化的进一步形成创造良好的环境，并提供一个晶体生长的模板。
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The role of matrix vesicles during development of the mineralizing tissues of tooth germ and craniofacial bone
ZHU Ping
(Department of Oral Pathlology,School of Stomatology ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200011,China)
ZHANG Weiguo
(Department of Oral Pathlology,School of Stomatology ,Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200011,China)
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Abstract：Objective：To evaluate the role of matrix vesicles (MVs) during the development of mineralizing tissues.Methods：The ultrastructure of MVs of tooth germ、calvarial bone and mandibular bone were observed by trasmission electron microscopy in fetal Wistar rat.Results：①The MVs were formed by osteoblast of the secret type、dentinoblast and process;② There was a mature process of the MVs in the extracellular matrix.The appearance of the hydroxyapatite (HAP) was a major mature feature;③ HAP formed initially in the MVs entered into collage matrix and eventually mineralized;④ The shifting sign of HAP from MVs to the surface of collage fibril was observed.Conclusions：The MVs played an important role in the biomineralization,but the special arrange pattern of mature collage fiber provided a suitable environment and a model to the growth of HAP for further mineralization.
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Key words：Rats,Wistar；Tooth germ；Microscopy，electron; Matrix vesicles▲
牙本质和骨均为矿化的结缔组织，矿化的发生是一个十分复杂而又有序的过程。目前对矿化的认识主要有两种理论，即同质晶核理论和异质晶核理论。前者强调了基质小泡(matrix vesicles，MVs)及其内部碱性磷酸酶(alkalin phosphatase，ALP)等的作用,认为首先在MVs内形成晶核化，然后种晶(seeds)进入基质，并在与钙和(或)羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)有亲和力的非胶原蛋白生物大分子的作用下发生同质晶核化[1，2]；而后者则认为最初的矿化首先发生在胶原蛋白分子的孔区，并以胶原蛋白分子为结晶的异质晶核[3] 。但确切的发生机理仍不甚明确。我们应用TEM对Wistar 大鼠牙胚、颅骨及颌骨形成、矿化过程中MVs的超微结构进行观察，对MVs来源、发育的形态变化及HAP的形成和一系列变化过程做了详细描述，以期为深入了解MVs在生物硬组织矿化中的作用提供形态学资料。
, 百拇医药
材料与方法
1. 材料：胚胎14及21 d的Wistar 大鼠各3只。
2. 用乙醚麻醉法处死动物，沿矢状方向从中线将头颅剖开，取牙胚(颌骨)、颅骨组织。将所取组织置于3%戊二醛中固定，4℃过夜，0.2 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗，1%锇酸后固定2 h(4 ℃)，梯度丙酮常规脱水，环氧树脂618浸透、包埋。经Diamond ultramicrotome knife,Drukker Co 超薄切片，Hitachi 600 透射电镜观察。
结果
一、骨细胞、成牙本质细胞的分化及基质形成
在14及21 d胚龄Wistar 大鼠颅、颌骨及牙胚处，可观察到不同分化阶段的成骨细胞和成牙本质细胞。在分泌型成骨细胞阶段，细胞表现出很强的合成能力和活跃的分泌功能。在细胞周围有大量新合成的胶原原纤维，排列较稀疏、无方向性。原纤维间无定型基质丰富，离胞体稍远部位的胶原原纤维的排列较密集、规则、趋于束状，周期横纹清晰。
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部分成牙本质细胞亦表现为十分活跃的生物合成状态，其顶端有较为丰富的新生胶原原纤维及无定型基质。原纤维排列亦无规则且疏松。有少量周期横纹明显的粗大原纤维，原纤维由少到多、由疏松到致密、最后规则地交织在一起，而且越远离细胞越趋于成熟。
二、MVs的形成及变化
随着骨胶原基质的逐渐成熟，可见分泌型成骨细胞不断从细胞表面和突起边缘释放MVs进入基质(图1),MVs呈圆形、直径约100～300 nm、电子密度不一，越远离细胞体直径越大，电子密度越高。HAP首先出现在较小的MVs内，呈针状、细丝状或颗粒状，较大的MVs周缘可见放射状排列的HAP结晶。当MVs体积及内部HAP数量增加到一定程度时，MVs膜逐渐消失，HAP晶核完全暴露于胶原基质中并逐渐向周围扩散，沉积于胶原基质内(图2)。在成熟胶原纤维表面可见平行排列的MVs，部分原纤维表面可见与其长轴平行的HAP晶体，这些晶体与MVs分泌的晶体有明显移形的迹象(图3)。
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图1 胚胎21 d龄的鼠颅骨组织TEM图像。骨基质中可见多个MVs(↑)，有的正从分泌型成骨细胞表面向外分泌，越远离细胞，其MVs直径越大，电子密度越高 图2 胚胎21 d龄的鼠牙胚牙本质基质TEM图像。可见大量散在分布的MVs，从早期的MVs(↑)逐渐向成熟的MVs(▲)过渡，密度逐渐增高，小泡膜破裂，HAP晶体呈放射状排列 图3 胚胎21 d龄的鼠颅骨组织TEM图像。在成熟的胶原原纤维束表面可见大量平行排列的MVs，部分胶原表面可见与其长轴平行的HAP晶体沉积(↑)，并且这些晶体与小泡分泌的晶体有移形的迹象(▲)
在牙胚较成熟的牙本质内也可观察到大量MVs。MVs在基质中亦有不断增大、密度增高等逐渐成熟的过程，可见HAP在MVs膜或内部出现、数量增多及最终进入基质的过程。此外，在一些矿化较密集的区域，亦可见散在的MVs的圆形轮廓，周缘呈羽绒状，而且与胶原基质中的HAP有明显移形的迹象(图4)。
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图4 胚胎21 d龄鼠牙胚的牙本质TEM图像。可见MVs(△)的圆形轮廓和HAP沉积
讨论
MVs在生物硬组织矿化中起着十分重要的作用，本研究不仅观察到骨基质和牙本质基质中有大量的MVs及分泌型成骨细胞正在分泌MVs的现象,还观察到HAP最初在MVs内形成到最终在胶原基质内沉积、生长、钙化的一系列形态变化过程。新形成的胶原基质内并无MVs,而成熟的胶原基质内有丰富的MVs存在，说明成熟的胶原基质可能对MVs的分泌有一定诱导作用。刚分泌的MVs到离细胞稍远、接近成熟胶原基质内的MVs不仅直径越来越大，而且电子密度越来越高，HAP晶核也越来越多，这表明MVs在分泌后经历了一个不断成熟的过程，以小泡内矿物盐的结晶化为主要特征。随着晶核的不断增多，MVs膜破裂消失，HAP晶核释放至胶原基质中并向周围扩散、生长，使基质矿化。因此我们认为MVs是矿化的起点。许多研究亦证实，在骨、牙本质和软骨组织基质发生矿化时均可出现MVs[4-6]。Morris等[7]的研究也认为，最初矿化的晶核形成于MVs膜上。由于MVs内含有大量的能富集钙磷离子的ALP等物质,通过分解和浓集磷酸离子，加之MVs膜上的annexin V将MVs外的钙离子移至泡内，从而造成局部高浓度的钙磷环境，当MVs内的钙离子浓度集聚到一定程度，即可导致晶核化的发生而形成种晶，然后破壁进入胶原基质中成为继续矿化的结晶晶核使基质矿化[8，9]。
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然而，也有学者认为最初的矿化首先发生在胶原蛋白的孔区，并以胶原蛋白分子为结晶的异质晶核[10]。有的作者在体外培养的成骨细胞基质的胶原纤维表面，发现有与之平行排列的HAP晶体，因而认为这是胶原作为异质晶核的证据。作者在观察中也注意到在骨基质纤维表面存在一定的与纤维长轴平行排列的HAP，但仔细观察则发现它们与MVs的晶体有移形关系，在矿化的牙本质基质中亦可见散在的MVs的圆形轮廓，周缘呈羽绒状，而且与胶原基质中的HAP有移形的迹象，提示这些胶原表面的HAP极可能来自MVs。所以作者认为致密排列的成熟胶原纤维以及存在于孔区内的磷酸蛋白及ALP的去磷酸化作用，可为孔区局部的磷酸环境提供基础，使MVs分泌的HAP晶核易于在此沉积，磷酸蛋白及ALP等可能为晶体的进一步生长创造了一个理想的环境，并提供一个晶体生长的模板，因而在晶体的延伸、排列和增长中起重要作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470750)
参考文献：
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[1]成令忠，主编.组织学.第2版.北京:人民卫生出版社,1994.3287-3422.
[2]Sela J,Schwartz Z,Swain LD,et al.Calcification in biological systems.In:Bonucci E,ed.Boca Roton:CRC Press,1992.74-105.
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[6]Takagi M,Hishikawa H,Hosokawa Y,et al.Immunohistochemical localization of glycosaminoglycans and proteoglycans in predentin and dentin of rat incisors.J Histochem Cytochen,1990,38:319-324.
[7]Morris DC,Masuhara K,Takaoka K,et al.Immunolocalization of alkaline phosphatase in osteoblasts and matrix vesicles of human fetal bone.Bone Miner,1992,19:287-298.
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[8]Anderson HC.Molecular biology of matrix vesicles.Clin Orthop,1995,(314):266-280.
[9]Kirsch T,Nah HD,Shapiro IM,et al.Regulated production of mineralization-competent matrix vesicles in hypertrophic chondrocytes.J Cell Biol,1997,137:1149-1160.
[10]Christoffersen J,Landis WJ.A contribution with review to the description of mineralization of bone and other calcified tissues in vivo.Anat Rec,1991,230(4): 435-450.
收稿日期:1998-12-07, 百拇医药