颌面枪弹伤软组织中前炎症细胞因子的表达
作者：吴洋 周树夏 杨琨 刘雪松 孙庆妹 李秀娟
单位：吴洋、李秀娟 200003上海，第二军医大学长征医院口腔科；周树夏、孙庆妹 第四军医大学口腔医学院；杨琨、刘雪松 第四军医大学免疫学教研室
关键词：细胞因子；创伤，枪击；下颌骨
中华口腔医学杂志990507 【摘要】 目的 观察颌面枪弹伤局部软组织中白细胞介素(interleukin，IL)6、8(IL-6、IL-8)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的表达情况,分析前炎症细胞因子对伤口愈合的影响。方法应用免疫组织化学方法检测3种前炎症细胞因子在狗下颌枪弹伤模型伤口局部软组织中的表达,结合伤口组织病理学变化分析创伤愈合过程中前炎症细胞因子的作用机理。结果 枪弹伤后IL-6、IL-8、TNF-α在伤口局部开始高表达，近、远伤区有不同，远伤区呈单峰，近伤区呈双峰,IL-6、IL-8特别明显；不同的细胞因子表达高峰时间点有所不同;3种因子表达的组织细胞定位基本相同，主要为成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞等。结论 前炎症细胞因子在伤后软组织中的高表达对创伤炎症反应影响较大，是调控伤后早期炎症水平的主要因素；它们促进成纤维细胞、内皮细胞及炎细胞功能，刺激与调控这些创伤细胞分泌其他细胞因子，从而对创伤组织愈合过程产生重要的影响。
, http://www.100md.com
Local expresion of proinflammatory cytokines in maxillofacial gunshot wound
WU Yang, ZHOU Shuxia, YANG Kun, et al.
*Department of Stomatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To study the relationship between proinflammentory cytokines and wound healing in local area. Methods Interleukin(IL)-6, IL-8 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) expression in local soft tissues after lower jaw gunshot wound were assessed by using immunohisto-chemistry, and pathological methods. Results High expressions of these cytokines were observed in local soft tissues of wounds after the gunshot. The cytokines expressions were different between the area near the bullet path and that far from the path. There was only one peak of the cytokines concentrations in the area far from the bullet path, while there were two peaks of the cytokines concentrations in the area near the bullet path, specially IL-6, IL-8. There were time differences for some different cytokines to reach the peaks of the their concentrations. In wound situ, the fibroblasts, mononuclear phagocytes and endothelial cells expressed IL-6, IL-8 and TNF-α after the firearm. Conclusion These results suggest that proinflammatory cytokines play an important role in regulating inflammatory cytokine reactions of local injury tissues. They might improve the functions of fibroblasts, mononuclear phagocytes and endothelial cells and stimulate wound cells to produce and release other cytokines.
, 百拇医药
【Key words】 Cytokine Wounds，gunshot Mandible
前炎症细胞因子(proinflammatroy cytokines，PC)对创伤愈合的影响已成为创伤研究的一个新热点,当前国内外学者广泛关注PC与严重创伤并发症的关系,而PC对伤口愈合的影响目前了解甚少。我们采用国产制式*****弹(5.80mm)致伤狗下颌部，造成狗下颌硬软组织贯通伤模型[1]，并用该模型研究IL-6，IL-8，TNF-α3个PC在伤口局部软组织中的表达情况，探讨它们对创伤后软组织愈合的影响。
材料与方法
1.动物模型:同参考文献[1]。
2.观察与取材:观测致伤前后心率、呼吸、体温变化，观察致伤局部损伤变化；不同时间点取距伤道0.5、1.0cm处的组织，4%多聚甲醛固定。
, 百拇医药
3.细胞因子的检测与观察方法:
(1)免疫组织化学方法：抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC技术)检测IL-6、IL-8、TNF-α在局部软组织中的表达。
(2)主要试剂：ABC试剂盒(美国Vector公司)，一抗为基因重组鼠抗人IL-6、IL-8、TNF-α单克隆抗体(第四军医大学免疫教研室提供)。
(3)对照设置：以不加一抗的为替代对照，正常狗相同部位组织作为正常对照，用同期组织切片HE染色作常规组织病理学观察。
4.免疫组化结果观察分析方法：
(1)组织学观察：光学显微镜下观察不同标本组织原位细胞因子表达情况。
, 百拇医药
(2)图象分析：①仪器设备：图象分析仪(英国Leica公司)，显微镜(德国Leitz公司);②方法：所有组织切片每一种细胞因子的免疫组化染色在同一条件下一次完成，定量分析在额定光强条件下，采用无偏估计，每张切片随机抽测10个视野，视野面积为20×20相素点，4倍目镜、256个灰度级条件下测量每个视野中所有阳性相素的平均灰度，折算成光密度值[2]，然后进行统计分析。
结果
1.免疫组化观察结果：正常对照组织为阴性或微弱的阳性着色(主要是毛细血管平滑肌细胞)，伤后所有标本染色均阳性，阳性部位主要在肌肉间隙和肌束间的结缔组织中，3种细胞因子的阳性表达位点基本相同，成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、炎细胞的胞浆中3种因子均呈强阳性，不同时间点标本光镜下观察阳性着色深浅明显不同。
2.免疫组织化学图象分析结果：
, http://www.100md.com
(1)枪弹伤后组织内TNF-α含量变化：图1。
TNFa：近伤区(0～0.5cm)
TNFb：远伤区(0.5～1.0cm)
图1 枪弹伤前后组织内TNF变化情况
(2)枪弹伤后组织内IL-6含量变化：图2。
IL-6a：近伤区(0～0.5cm)
IL-6b：远伤区(0.5～1.0cm)
图2 枪弹伤前后组织IL-6变化情况
, 百拇医药
(3)枪弹伤后组织内IL-8含量变化：图3。
IL-8a：近伤区(0～0.5cm)
IL-8b：远伤区(0.5～1.0cm)
图3 枪弹伤前后组织IL-8变化情况
讨论
本研究结果清楚地显示IL-6、IL-8、TNF-α3种PC在颌面枪弹伤口局部软组织中的表达趋势十分相似；近、远伤区的变化趋势明显不同；不同的细胞因子表达高峰时间点有所不同。结果说明,3种细胞因子在来源上具有较高的同一性，创伤后主要阳性细胞为单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、间质细胞、内皮细胞及一些间质与炎症细胞。它们是伤后炎症及组织修复过程主要参与者，3种因子的同源性使得它们一同反应出伤后这些细胞的大致功能与活性情况；本研究结果表明在急性创伤后IL-8表达较TNF-α、IL-6稍早，与国外报道相似[3,4]。3种细胞因子对单核细胞都有诱导分泌细胞因子的生物学活性，目前哪一种PC是细胞因子反应链的启动因子看法不一。
, http://www.100md.com
IL-6、IL-8、TNF-α在火器伤伤道周围软组织中表达水平与颌面火器伤后局部组织的急性炎症反应密切相关。作者认为火器伤后早期局部严重水肿与IL-8的过高表达有关，IL-8的过高表达会导致类似速发超敏反应的表现[3,5]；IL-6能激活机体的特异和非特异免疫反应,从而对火器伤后炎症发展发生影响；TNF-α能活化中性粒细胞,提高其吞噬能力、刺激单核细胞表达分泌细胞因子，促进淋巴细胞增殖，诱导成熟内皮细胞、成纤维细胞有丝分裂，促进炎性肉芽形成[6]。由于IL-6、IL-8、TNF-α在伤后很短时间内就有明显的局部高表达，在如此短的时间里伤道内的感染并没有形成，这说明火器伤本身是伤道周围软组织中IL-6、IL-8、TNF-α高表达的诱因，伤口感染的形成又使IL-6、IL-8、TNF-α的高表达得以继续，酯多糖(lipoplysaccharide,LPS)能促使巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等表达IL-6、IL-8、TNF-α[7]。
新增生未成熟的纤维细胞基本不表达这3种细胞因子，而成熟的成纤维细胞创伤后表达水平很高，说明这些细胞因子是组织细胞从G0期和G1期向S期转化过程中的启动因子，但从组织增生开始，启动因子表达就失去了意义，故在一定条件下表达降低。作者认为在创伤后早期伤口局部IL-6、IL-8、TNF-α的适量表达对创伤愈合有着积极的影响。 参考文献
, 百拇医药
1 吴洋, 周树夏, 李曙光, 等. 5.80mm枪弹狗下颌硬软组织复合贯通伤模型的建立. 实用口腔医学杂志, 1997, 13:97-99.
2 齐春, 钱钟材, 陈一怀, 等. 咬合接触点测量中灰度图象的定标和误差校正.实用口腔医学杂志，1995, 11:197-199.
3 Biffl WL, Moore EE, Moore FA, et al. Interleukin-8 increases endothelial permeability independent of neutrophils. J Trauma, 1995, 39:98-102.
4 Goldblum SE, Ding X， Campbell-Washington J. TNF-alpha induces endothelial cell F-actin depolymerization, new actin synthesis, and barrier dysfunction. Am J Physiol， 1993, 264:894-905.
, http://www.100md.com
5 Rodriguez JL, Miller CG, Garner WL, et al. Correlation of the local and systemic cytokine response with clinical outcome following thermal injury. J Trauma, 1993, 34:684-694.
6 Sander JH,Vandeventer ,Harry R, et al. Exprimental endotoxemia in humans: analysis of cytokine release and coagulation, fibrinnolytic,and complement path ways. Blood, 1990, 76:2520-2527.
7 Molloy RG, Mannick JA, Rodrick ML. Cytokines, sepsis and immunomodulation. Br J Surg, 1993, 80: 289-297.
(收稿:1998-11-20 修回:1999-04-29), 百拇医药
单位：吴洋、李秀娟 200003上海，第二军医大学长征医院口腔科；周树夏、孙庆妹 第四军医大学口腔医学院；杨琨、刘雪松 第四军医大学免疫学教研室
关键词：细胞因子；创伤，枪击；下颌骨
中华口腔医学杂志990507 【摘要】 目的 观察颌面枪弹伤局部软组织中白细胞介素(interleukin，IL)6、8(IL-6、IL-8)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的表达情况,分析前炎症细胞因子对伤口愈合的影响。方法应用免疫组织化学方法检测3种前炎症细胞因子在狗下颌枪弹伤模型伤口局部软组织中的表达,结合伤口组织病理学变化分析创伤愈合过程中前炎症细胞因子的作用机理。结果 枪弹伤后IL-6、IL-8、TNF-α在伤口局部开始高表达，近、远伤区有不同，远伤区呈单峰，近伤区呈双峰,IL-6、IL-8特别明显；不同的细胞因子表达高峰时间点有所不同;3种因子表达的组织细胞定位基本相同，主要为成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞等。结论 前炎症细胞因子在伤后软组织中的高表达对创伤炎症反应影响较大，是调控伤后早期炎症水平的主要因素；它们促进成纤维细胞、内皮细胞及炎细胞功能，刺激与调控这些创伤细胞分泌其他细胞因子，从而对创伤组织愈合过程产生重要的影响。
, http://www.100md.com
Local expresion of proinflammatory cytokines in maxillofacial gunshot wound
WU Yang, ZHOU Shuxia, YANG Kun, et al.
*Department of Stomatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To study the relationship between proinflammentory cytokines and wound healing in local area. Methods Interleukin(IL)-6, IL-8 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) expression in local soft tissues after lower jaw gunshot wound were assessed by using immunohisto-chemistry, and pathological methods. Results High expressions of these cytokines were observed in local soft tissues of wounds after the gunshot. The cytokines expressions were different between the area near the bullet path and that far from the path. There was only one peak of the cytokines concentrations in the area far from the bullet path, while there were two peaks of the cytokines concentrations in the area near the bullet path, specially IL-6, IL-8. There were time differences for some different cytokines to reach the peaks of the their concentrations. In wound situ, the fibroblasts, mononuclear phagocytes and endothelial cells expressed IL-6, IL-8 and TNF-α after the firearm. Conclusion These results suggest that proinflammatory cytokines play an important role in regulating inflammatory cytokine reactions of local injury tissues. They might improve the functions of fibroblasts, mononuclear phagocytes and endothelial cells and stimulate wound cells to produce and release other cytokines.
, 百拇医药
【Key words】 Cytokine Wounds，gunshot Mandible
前炎症细胞因子(proinflammatroy cytokines，PC)对创伤愈合的影响已成为创伤研究的一个新热点,当前国内外学者广泛关注PC与严重创伤并发症的关系,而PC对伤口愈合的影响目前了解甚少。我们采用国产制式*****弹(5.80mm)致伤狗下颌部，造成狗下颌硬软组织贯通伤模型[1]，并用该模型研究IL-6，IL-8，TNF-α3个PC在伤口局部软组织中的表达情况，探讨它们对创伤后软组织愈合的影响。
材料与方法
1.动物模型:同参考文献[1]。
2.观察与取材:观测致伤前后心率、呼吸、体温变化，观察致伤局部损伤变化；不同时间点取距伤道0.5、1.0cm处的组织，4%多聚甲醛固定。
, 百拇医药
3.细胞因子的检测与观察方法:
(1)免疫组织化学方法：抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC技术)检测IL-6、IL-8、TNF-α在局部软组织中的表达。
(2)主要试剂：ABC试剂盒(美国Vector公司)，一抗为基因重组鼠抗人IL-6、IL-8、TNF-α单克隆抗体(第四军医大学免疫教研室提供)。
(3)对照设置：以不加一抗的为替代对照，正常狗相同部位组织作为正常对照，用同期组织切片HE染色作常规组织病理学观察。
4.免疫组化结果观察分析方法：
(1)组织学观察：光学显微镜下观察不同标本组织原位细胞因子表达情况。
, 百拇医药
(2)图象分析：①仪器设备：图象分析仪(英国Leica公司)，显微镜(德国Leitz公司);②方法：所有组织切片每一种细胞因子的免疫组化染色在同一条件下一次完成，定量分析在额定光强条件下，采用无偏估计，每张切片随机抽测10个视野，视野面积为20×20相素点，4倍目镜、256个灰度级条件下测量每个视野中所有阳性相素的平均灰度，折算成光密度值[2]，然后进行统计分析。
结果
1.免疫组化观察结果：正常对照组织为阴性或微弱的阳性着色(主要是毛细血管平滑肌细胞)，伤后所有标本染色均阳性，阳性部位主要在肌肉间隙和肌束间的结缔组织中，3种细胞因子的阳性表达位点基本相同，成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、炎细胞的胞浆中3种因子均呈强阳性，不同时间点标本光镜下观察阳性着色深浅明显不同。
2.免疫组织化学图象分析结果：
, http://www.100md.com
(1)枪弹伤后组织内TNF-α含量变化：图1。
TNFa：近伤区(0～0.5cm)
TNFb：远伤区(0.5～1.0cm)
图1 枪弹伤前后组织内TNF变化情况
(2)枪弹伤后组织内IL-6含量变化：图2。
IL-6a：近伤区(0～0.5cm)
IL-6b：远伤区(0.5～1.0cm)
图2 枪弹伤前后组织IL-6变化情况
, 百拇医药
(3)枪弹伤后组织内IL-8含量变化：图3。
IL-8a：近伤区(0～0.5cm)
IL-8b：远伤区(0.5～1.0cm)
图3 枪弹伤前后组织IL-8变化情况
讨论
本研究结果清楚地显示IL-6、IL-8、TNF-α3种PC在颌面枪弹伤口局部软组织中的表达趋势十分相似；近、远伤区的变化趋势明显不同；不同的细胞因子表达高峰时间点有所不同。结果说明,3种细胞因子在来源上具有较高的同一性，创伤后主要阳性细胞为单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、间质细胞、内皮细胞及一些间质与炎症细胞。它们是伤后炎症及组织修复过程主要参与者，3种因子的同源性使得它们一同反应出伤后这些细胞的大致功能与活性情况；本研究结果表明在急性创伤后IL-8表达较TNF-α、IL-6稍早，与国外报道相似[3,4]。3种细胞因子对单核细胞都有诱导分泌细胞因子的生物学活性，目前哪一种PC是细胞因子反应链的启动因子看法不一。
, http://www.100md.com
IL-6、IL-8、TNF-α在火器伤伤道周围软组织中表达水平与颌面火器伤后局部组织的急性炎症反应密切相关。作者认为火器伤后早期局部严重水肿与IL-8的过高表达有关，IL-8的过高表达会导致类似速发超敏反应的表现[3,5]；IL-6能激活机体的特异和非特异免疫反应,从而对火器伤后炎症发展发生影响；TNF-α能活化中性粒细胞,提高其吞噬能力、刺激单核细胞表达分泌细胞因子，促进淋巴细胞增殖，诱导成熟内皮细胞、成纤维细胞有丝分裂，促进炎性肉芽形成[6]。由于IL-6、IL-8、TNF-α在伤后很短时间内就有明显的局部高表达，在如此短的时间里伤道内的感染并没有形成，这说明火器伤本身是伤道周围软组织中IL-6、IL-8、TNF-α高表达的诱因，伤口感染的形成又使IL-6、IL-8、TNF-α的高表达得以继续，酯多糖(lipoplysaccharide,LPS)能促使巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等表达IL-6、IL-8、TNF-α[7]。
新增生未成熟的纤维细胞基本不表达这3种细胞因子，而成熟的成纤维细胞创伤后表达水平很高，说明这些细胞因子是组织细胞从G0期和G1期向S期转化过程中的启动因子，但从组织增生开始，启动因子表达就失去了意义，故在一定条件下表达降低。作者认为在创伤后早期伤口局部IL-6、IL-8、TNF-α的适量表达对创伤愈合有着积极的影响。 参考文献
, 百拇医药
1 吴洋, 周树夏, 李曙光, 等. 5.80mm枪弹狗下颌硬软组织复合贯通伤模型的建立. 实用口腔医学杂志, 1997, 13:97-99.
2 齐春, 钱钟材, 陈一怀, 等. 咬合接触点测量中灰度图象的定标和误差校正.实用口腔医学杂志，1995, 11:197-199.
3 Biffl WL, Moore EE, Moore FA, et al. Interleukin-8 increases endothelial permeability independent of neutrophils. J Trauma, 1995, 39:98-102.
4 Goldblum SE, Ding X， Campbell-Washington J. TNF-alpha induces endothelial cell F-actin depolymerization, new actin synthesis, and barrier dysfunction. Am J Physiol， 1993, 264:894-905.
, http://www.100md.com
5 Rodriguez JL, Miller CG, Garner WL, et al. Correlation of the local and systemic cytokine response with clinical outcome following thermal injury. J Trauma, 1993, 34:684-694.
6 Sander JH,Vandeventer ,Harry R, et al. Exprimental endotoxemia in humans: analysis of cytokine release and coagulation, fibrinnolytic,and complement path ways. Blood, 1990, 76:2520-2527.
7 Molloy RG, Mannick JA, Rodrick ML. Cytokines, sepsis and immunomodulation. Br J Surg, 1993, 80: 289-297.
(收稿:1998-11-20 修回:1999-04-29), 百拇医药