雏鸡视网膜褪黑激素含量测定
作者：关光玉 王洁 周玲
单位：关光玉(宁夏医学科学研究所，银川 750004)；王洁(宁夏医学院中心实验室，银川 750004)；周玲(西安医科大学公卫学院卫化教研室，西安 710061)
关键词：雏鸡；褪黑激素；高效液相色谱
宁夏医学院学报000406 摘要：目的：检测雏鸡视网膜褪黑激素的含量。方法：采用高效液相色谱法。结果：方法操作简单，结果可信，检出限为25ng/ml。线性范围0.025～80μg/ml，变异系数<11%(日内、日间)。加标回收率82.0%～99.8%，样品中褪黑激素含量0.2μg/ml。结论：出生1～7d雏鸡松果体不分泌褪黑激素。
中图分类号：R322.5+5 文献标识码：A
文章编号：1005-8486(2000)04-0246-02
, 百拇医药
Measuring the Amount of Melatonin in Chicken Retina
GUAN Guang-yu WANG Jie et al
(Ningxia Inst.of Medical Sciences，Yinchuan 750004)
Abstract:Objective:To measure the amount of Melatonin in chicken retina.Methods:Melatonin was detected by high performance liquid chromatography.Results:The detection limint of Melatonin-was 25.0ng/ml.The linear range ranged 0.025～80μg/ml and the recovery rate 82.0%～98%.The coefficient of variation was 11%.Conclusion:The amount of melatonin in chicken retina is 0.2μg/ml and the HPLC method is reliable.
, http://www.100md.com
Key words:chicken;melatonin(MT);high performance liquid chromatography (HPLC)
褪黑激素(MT)化学名称：N-乙酰-5-甲氧基色胺，禽类的MT主要来源于松果体、视网膜等部位的分泌，具多种生理调节功能，与个体发育、免疫功能增强[1]、延缓衰老[2]等相关。本实验采用高效液相色谱法(HPLC)(紫外检测器)对雏鸡松果体视网膜中MT含量进行测定。
1 材料与方法
1.1 仪器设备 高速冷冻离心机(0～16000rpm)，北京医用离心机厂生产LGR16-W。高效液相色谱仪：美国Beckman-344型。超声波清洗器：上海超声仪器厂生产。
1.2 药品试剂 MT标准品：Sigma公司产品；甲醇：色谱纯，北京昌化精细化工厂生产；标准贮备液：精称MT标准品10mg，甲醇定容至10ml，即含MT1.0mg/ml。标准应用液：取标准贮备液1ml，甲醇定容至10ml，即含MT0.1mg/ml。
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1.3 动物 出生1～7d健康雏鸡12只，雌雄不限。
1.4 色谱条件 色谱柱：ODS柱；温度：室温；流动相：甲醇∶水=60∶40；流动相上机前须超声除去气体。流速：1ml/min；进样量：20μl，检测器波长225nm，范围0.8AV，斜率为自动，以tR定性，峰面积定量。
1.5 标准溶液配制 取标准应用液1.0μl、10μl、50μl、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml，分别加甲醇至1.0ml。
1.6 生物样品处理 小鸡处于黑暗状态6～10h后，断头处死迅速出取松果体及视网膜放入已加入100μl甲醇的Ependorf管中，剪碎置4℃冰箱浸泡，于高速冷冻离心机离心，12000rpm，4℃，15min，取上清进样，进样量20μl。
1.7 精密度测试 取高、中、低浓度的标准品(80μg、40μg、1μg、)在日内连续检测或连续数天检测分别求日内、日间变异系数。
, 百拇医药
1.8 回收率测定 于样品中加入一定量标准品，同时设样品对照，分别求出加标回收率。
2 结果
2.1 MT检测条件选择 参照文献[3]得到理想的分离效果，MT保留时间为4.32-4.37min,最低检出限25ng/ml。见图1
图A、B：标准品 图C： 样品 图D：样品+标准品
图1 高效液相色谱图
2.2 标准曲线与质量控制 以标准品浓度及相应峰面积值作标准曲线，MT在0.025～80μg之间呈线性，回归方程：Y=-478.83+5972.5X r=0.9999。日内、日间变异系数<11%(n=6)，回收率为82.0%～99.8%(n=4)，表明该方法的准确性、重现性较好。
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2.3 本实验检测视网膜中MT含量为0.2μg/ml，松果体未检出MT。
3 讨论
本文首次报道禽类动物视网膜中MT含量。实验选用1-7d龄的雏鸡，分别获取松果体和视网膜，进行测试分析。结果前者未检出，后者为0.2μg/ml。MT存在于松果体和视网膜等部位，其分泌与昼夜节律和终生性节律有关，一则MT分泌受光照影响，呈昼低夜高现象。二则刚出生时不分泌MT，青春期分泌达高峰，以后随年龄增长逐渐下降[1]。本实验松果体内未测出MT，可能因雏鸡太小，与MT分泌的终生性节律相吻合，拟选不同年龄组进行实验以继续深入探讨。
目前国内外对MT的检测多采用高效液相色谱法(紫外检测器，荧光检测器及电化学检测器)、气相/质谱联用法，放免等技术[4]。其中气相/质谱联用法，检测精度高，可达10-12克级，但所用仪器复杂，普通实验室难以开展，而放免法在样品处理方面又显繁琐。故本实验采用快速、灵敏、重现性好的HPLC法，该法操作简便，值得推广应用。
, 百拇医药
参考文献：
[1] Nelson RJ,Damas GE.Seasonal changes in immune function[J].Q Res Biol,1996,71(4):511-548
[2] Reiter RJ,Guerreo JM,et al.Reactive oxygen intermediates,molecular damage and aging,Relation to Melatonin[J].Ann NY accad Sci,1998,854(20):410-424
[3] 刘 淳，郑 毅.高效液相色谱法测定保健食品中褪黑激素的含量[J].中国卫生检验杂志，1997，10(6)：384-385
[4] Adrendt J,et al.Radioimmunoassay of Melatonin:human serum and cerebrospinal fluid[J].Horm Res,1977,8(2):65-75
收稿日期：1999-12-09, 百拇医药
单位：关光玉(宁夏医学科学研究所，银川 750004)；王洁(宁夏医学院中心实验室，银川 750004)；周玲(西安医科大学公卫学院卫化教研室，西安 710061)
关键词：雏鸡；褪黑激素；高效液相色谱
宁夏医学院学报000406 摘要：目的：检测雏鸡视网膜褪黑激素的含量。方法：采用高效液相色谱法。结果：方法操作简单，结果可信，检出限为25ng/ml。线性范围0.025～80μg/ml，变异系数<11%(日内、日间)。加标回收率82.0%～99.8%，样品中褪黑激素含量0.2μg/ml。结论：出生1～7d雏鸡松果体不分泌褪黑激素。
中图分类号：R322.5+5 文献标识码：A
文章编号：1005-8486(2000)04-0246-02
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Measuring the Amount of Melatonin in Chicken Retina
GUAN Guang-yu WANG Jie et al
(Ningxia Inst.of Medical Sciences，Yinchuan 750004)
Abstract:Objective:To measure the amount of Melatonin in chicken retina.Methods:Melatonin was detected by high performance liquid chromatography.Results:The detection limint of Melatonin-was 25.0ng/ml.The linear range ranged 0.025～80μg/ml and the recovery rate 82.0%～98%.The coefficient of variation was 11%.Conclusion:The amount of melatonin in chicken retina is 0.2μg/ml and the HPLC method is reliable.
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Key words:chicken;melatonin(MT);high performance liquid chromatography (HPLC)
褪黑激素(MT)化学名称：N-乙酰-5-甲氧基色胺，禽类的MT主要来源于松果体、视网膜等部位的分泌，具多种生理调节功能，与个体发育、免疫功能增强[1]、延缓衰老[2]等相关。本实验采用高效液相色谱法(HPLC)(紫外检测器)对雏鸡松果体视网膜中MT含量进行测定。
1 材料与方法
1.1 仪器设备 高速冷冻离心机(0～16000rpm)，北京医用离心机厂生产LGR16-W。高效液相色谱仪：美国Beckman-344型。超声波清洗器：上海超声仪器厂生产。
1.2 药品试剂 MT标准品：Sigma公司产品；甲醇：色谱纯，北京昌化精细化工厂生产；标准贮备液：精称MT标准品10mg，甲醇定容至10ml，即含MT1.0mg/ml。标准应用液：取标准贮备液1ml，甲醇定容至10ml，即含MT0.1mg/ml。
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1.3 动物 出生1～7d健康雏鸡12只，雌雄不限。
1.4 色谱条件 色谱柱：ODS柱；温度：室温；流动相：甲醇∶水=60∶40；流动相上机前须超声除去气体。流速：1ml/min；进样量：20μl，检测器波长225nm，范围0.8AV，斜率为自动，以tR定性，峰面积定量。
1.5 标准溶液配制 取标准应用液1.0μl、10μl、50μl、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml，分别加甲醇至1.0ml。
1.6 生物样品处理 小鸡处于黑暗状态6～10h后，断头处死迅速出取松果体及视网膜放入已加入100μl甲醇的Ependorf管中，剪碎置4℃冰箱浸泡，于高速冷冻离心机离心，12000rpm，4℃，15min，取上清进样，进样量20μl。
1.7 精密度测试 取高、中、低浓度的标准品(80μg、40μg、1μg、)在日内连续检测或连续数天检测分别求日内、日间变异系数。
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1.8 回收率测定 于样品中加入一定量标准品，同时设样品对照，分别求出加标回收率。
2 结果
2.1 MT检测条件选择 参照文献[3]得到理想的分离效果，MT保留时间为4.32-4.37min,最低检出限25ng/ml。见图1
图A、B：标准品 图C： 样品 图D：样品+标准品
图1 高效液相色谱图
2.2 标准曲线与质量控制 以标准品浓度及相应峰面积值作标准曲线，MT在0.025～80μg之间呈线性，回归方程：Y=-478.83+5972.5X r=0.9999。日内、日间变异系数<11%(n=6)，回收率为82.0%～99.8%(n=4)，表明该方法的准确性、重现性较好。
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2.3 本实验检测视网膜中MT含量为0.2μg/ml，松果体未检出MT。
3 讨论
本文首次报道禽类动物视网膜中MT含量。实验选用1-7d龄的雏鸡，分别获取松果体和视网膜，进行测试分析。结果前者未检出，后者为0.2μg/ml。MT存在于松果体和视网膜等部位，其分泌与昼夜节律和终生性节律有关，一则MT分泌受光照影响，呈昼低夜高现象。二则刚出生时不分泌MT，青春期分泌达高峰，以后随年龄增长逐渐下降[1]。本实验松果体内未测出MT，可能因雏鸡太小，与MT分泌的终生性节律相吻合，拟选不同年龄组进行实验以继续深入探讨。
目前国内外对MT的检测多采用高效液相色谱法(紫外检测器，荧光检测器及电化学检测器)、气相/质谱联用法，放免等技术[4]。其中气相/质谱联用法，检测精度高，可达10-12克级，但所用仪器复杂，普通实验室难以开展，而放免法在样品处理方面又显繁琐。故本实验采用快速、灵敏、重现性好的HPLC法，该法操作简便，值得推广应用。
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参考文献：
[1] Nelson RJ,Damas GE.Seasonal changes in immune function[J].Q Res Biol,1996,71(4):511-548
[2] Reiter RJ,Guerreo JM,et al.Reactive oxygen intermediates,molecular damage and aging,Relation to Melatonin[J].Ann NY accad Sci,1998,854(20):410-424
[3] 刘 淳，郑 毅.高效液相色谱法测定保健食品中褪黑激素的含量[J].中国卫生检验杂志，1997，10(6)：384-385
[4] Adrendt J,et al.Radioimmunoassay of Melatonin:human serum and cerebrospinal fluid[J].Horm Res,1977,8(2):65-75
收稿日期：1999-12-09, 百拇医药